研究実績の概要マウスVSPの分子特性をホヤVSPとのキメラ生成により解析し、基質特異性が従来知られてきたVSPの酵素特性と類似することを明らかにした。blot解析から一次構造から予測されるマウスVSPの長さより50kD程度バンドのサイズが大きいことから翻訳後修飾が生じている可能性が考えられ、哺乳類のVSPがこれまで全長タンパク質で発現系での機能発現が成功しない理由として哺乳類精子固有の翻訳後修飾が関わっている可能性が示唆された。VSPノックアウトマウス由来の精子からパッチクランプ計測を行い、CatSper電流には差が見られず、またPMCAの阻害剤存在下でも細胞内Ca2+濃度の大きさに差が見られたことから、capacitationに伴うCa2+シグナルがVSPノックアウトマウスで野生型マウスに比して増強している原因にはCatSperとPMCAは直接関わっていないと考えられた。連携し計算化学的手法による解析を行い、哺乳類VSPとホヤVSPに共通に保存される膜相互作用部位が酵素ドメインの膜との近接化を促進することで酵素活性を増強する仕組みを明らかにした。今年度の解析では精子からのパッチクランプ計測とCa2+イメージング計測を積極的に進め、CatSperとPMCAの関与が考えにくいことが判明したため、今後ターゲット分子をK+チャネルに狭めることが可能になった。精子からのパッチクランプ計測が安定して記録が可能になったことで阻害剤を用いた電流計測も今後可能になると期待される。精子でのVSPの局在部位を明確にするべくタグ配列をノックインしたマウスを作成する。ターゲット分子として精子特異的K+チャネルであるSlo3に注目し、阻害剤やPIP2抗体などを用いた精子からのパッチクランプ計測を行って、野生型マウスとVSPノックアウトマウスでのSlo3チャネル活性の定量比較を行う。質量分析によるイノシトールリン脂質の定量解析を継続し、PIP2の量の変化とチャネル活性との関係を明らかにする。