×この技術を簡単クリック査定この機能をご利用いただくには、会員登録(無料)が必要です。出願した特許の牽制数、引用された数などを知る事ができます。気になる技術や特許をブックマークしておけば、いつでも後から読むことができます。後で印刷するために、公報をPDFでダウンロードできます。会員登録してastamuseを使えば、もっと簡単に便利にお使いいただけます。会員登録(無料)「astamuse」は世界中の挑戦したい社会課題に挑戦し、未来を創る人のプラットフォームです。関連する未来課題-重要な関連分野-※この項目の情報は公開日時点(2019年10月3日)のものです。ヘパリン結合性増殖因子を含む培地を用いて体細胞に分化誘導する方法において、ラミニンE8フラグメントとヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントとが連結したコンジュゲートを細胞に接触させることを特徴とする分化誘導方法を提供する。本発明により、多能性幹細胞から任意の体細胞へ高効率で分化誘導することができる。概要この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedIn背景ヒトES細胞やヒトiPS細胞などのヒト多能性幹細胞は、その再生医療への応用が世界的に注目されている。ヒト多能性幹細胞を再生医療に応用するためには、これら幹細胞を高効率で安定的に体細胞に分化誘導する技術の開発が必要である。ヒト多能性幹細胞から任意の体細胞への選択的分化誘導においては、培地に添加する増殖因子とともに、足場となる細胞外マトリックスの選択が成否の鍵を握っていると考えられる。ヒト多能性幹細胞から任意の体細胞への選択的分化誘導の効率を高める細胞外マトリックスとして確立されたものは、未だ存在しない。細胞増殖制御分子とが連結したコンジュゲート(改変ラミニン)が、iPS細胞などの多能性幹細胞の多分化能を保持したまま未分化状態で維持培養する際の細胞外マトリックスとして適していること、および、体細胞からiPS細胞を樹立する際の細胞外マトリックスとして適していることを見出している(特許文献1)。ヘパリン結合性増殖因子を含む培地を用いて体細胞に分化誘導する方法において、ラミニンE8フラグメントとヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントとが連結したコンジュゲートを細胞に接触させることを特徴とする分化誘導方法を提供する。本発明により、多能性幹細胞から任意の体細胞へ高効率で分化誘導することができる。0001本発明は多能性幹細胞から体細胞への分化誘導方法に関するものであり、より詳細には、ラミニンフラグメントとヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントとのコンジュゲートを用いて多能性幹細胞を体細胞に分化誘導する方法に関するものである。背景技術0002ヒトES細胞やヒトiPS細胞などのヒト多能性幹細胞は、その再生医療への応用が世界的に注目されている。ヒト多能性幹細胞を再生医療に応用するためには、これら幹細胞を高効率で安定的に体細胞に分化誘導する技術の開発が必要である。ヒト多能性幹細胞から任意の体細胞への選択的分化誘導においては、培地に添加する増殖因子とともに、足場となる細胞外マトリックスの選択が成否の鍵を握っていると考えられる。ヒト多能性幹細胞から任意の体細胞への選択的分化誘導の効率を高める細胞外マトリックスとして確立されたものは、未だ存在しない。細胞増殖制御分子とが連結したコンジュゲート(改変ラミニン)が、iPS細胞などの多能性幹細胞の多分化能を保持したまま未分化状態で維持培養する際の細胞外マトリックスとして適していること、および、体細胞からiPS細胞を樹立する際の細胞外マトリックスとして適していることを見出している(特許文献1)。特許文献1に記載の改変ラミニンを分化誘導時の細胞外マトリックスとして使用したことは報告されていない。提供することを課題とする。課題を解決するための手段0006本発明は上記の課題を解決するために、以下の発明を包含する。[1]多能性幹細胞を、ヘパリン結合性増殖因子を含む培地を用いて体細胞に分化誘導する方法において、ラミニンE8フラグメントとヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントとが連結したコンジュゲートを細胞に接触させることを特徴とする分化誘導方法。[2]前記ヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントが、パールカンのドメイン1を含むフラグメントである前記[1]に記載の分化誘導方法。[3]前記コンジュゲートが、ラミニンE8フラグメントのα鎖のC末端にヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントが連結しているコンジュゲートである前記[1]または[2]に記載の分化誘導方法。[4]前記コンジュゲートがコーティングされた細胞培養容器を用いて多能性幹細胞を体細胞に分化誘導することを特徴とする前記[1]〜[3]のいずれかに記載の分化誘導方法。選択される1種以上である前記[1]〜[4]のいずれかに記載の分化誘導方法。[6]多能性幹細胞がヒトiPS細胞である前記[1]〜[5]のいずれかに記載の分化誘導方法。[7]前記体細胞が、中胚葉由来の体細胞である前記[1]〜[6]のいずれかに記載の分化誘導方法。[8]ヒトiPS細胞を、骨形成タンパク質4またはアクチビンAを含む培地を用いて心筋細胞に分化誘導する方法において、ヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα鎖のC末端またはヒトラミニンα5β1γ1E8フラグメントのα鎖のC末端にパールカンのドメイン1が連結しているコンジュゲートを細胞に接触させて分化誘導することを特徴とする前記[1]〜[7]のいずれかに記載の分化誘導方法。肝細胞増殖因子を含む培地を用いて骨格筋細胞に分化誘導する方法において、ヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα鎖のC末端、ヒトラミニンα5β1γ1E8フラグメントのα鎖のC末端、ヒトラミニンα4β1γ1E8フラグメントのα鎖のC末端またはヒトラミニンα5β2γ1E8フラグメントのα鎖のC末端にパールカンのドメイン1が連結しているコンジュゲートを細胞に接触させて分化誘導することを特徴とする前記[1]〜[7]のいずれかに記載の分化誘導方法。効果0007本発明により、多能性幹細胞から任意の体細胞へ高効率で分化誘導する方法を提供することができる。図面の簡単な説明0008ヒトiPS細胞(253G1株)から心筋細胞へ分化誘導した細胞における拍動細胞塊を10秒間動画撮影した1コマの静止画像であり、(A)はヒトラミニンα5β1γ1E8フラグメントをコーティングしたプレートを用いて分化誘導した細胞の結果、(B)はヒトラミニンα5β1γ1E8フラグメントのα5鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いて分化誘導した細胞の結果である。図1(A)の拍動細胞塊の10秒間の拍動回数と移動距離をグラフ化した図である。図1(B)の12個の拍動細胞塊のそれぞれについて、10秒間の拍動回数と移動距離をグラフ化した図である。ヒトiPS細胞(253G1株)から心筋細胞へ分化誘導した細胞におけるトロポニンT(cTnT)陽性細胞のFACS解析の結果を示す図であり、(A)はヒトラミニンα5β1γ1E8フラグメントをコーティングしたプレートを用いた結果であり、(B)はヒトラミニンα5β1γ1E8フラグメントのα5鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果である。ヒトiPS細胞(201B7株)から心筋細胞へ分化誘導した細胞におけるトロポニンT(cTnT)陽性細胞のFACS解析の結果を示す図であり、(A)はヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントをコーティングしたプレートを用いた結果であり、(B)はヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果である。Chain(MHC)の発現およびMyoDの発現を免疫染色により観察した結果を示す図であり、上段がマトリゲルをコーティングしたプレートを用いた結果、2段目がヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントをコーティングしたプレートを用いた結果、3段目がヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果、下段がヒトラミニンα5β1γ1E8フラグメントのα5鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果である。MYF5の発現と連携してtdTomatoを発現するヒトiPS細胞(MYF5-tdTomato)から骨格筋細胞へ分化誘導した14日目の細胞におけるSIX1遺伝子およびSox1遺伝子の発現量を定量した結果を示す図であり、(A)はSIX1遺伝子の結果、(B)はSox1遺伝子の結果である。MYF5の発現と連携してtdTomatoを発現するヒトiPS細胞(MYF5-tdTomato)から骨格筋細胞へ分化誘導した細胞におけるMyf5陽性細胞の出現率をFACSで解析した結果を示す図であり、左は18日目の結果、右は85日目の結果である。Chain(MHC)の発現およびMyoDの発現を免疫染色により観察した結果を示す図であり、上段がマトリゲルをコーティングしたプレートを用いた結果、下段がヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果である。Chain(MHC)、Myogenin、Pax7)の発現量を定量した結果を示す図であり、(A)はMyoD遺伝子の結果、(B)はMHC遺伝子の結果、(C)はMyogenin遺伝子の結果、(D)はPax7遺伝子の結果である。Chain(MHC)の発現を免疫染色により観察した結果を示す図であり、左1段目がマトリゲルをコーティングしたプレートを用いた結果、左2〜8段目が各ヒトラミニンE8フラグメントをコーティングしたプレートを用いた結果、右1〜7段目が各ヒトラミニンE8フラグメントのα鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果である。ヒトiPS細胞(201B7株)から骨格筋細胞へ分化誘導した14日目の細胞におけるSIX1遺伝子およびDMRT2遺伝子の発現量を定量した結果を示す図であり、(A)はSIX1遺伝子の結果、(B)はDMRT2遺伝子の結果である。Chain(MHC)の発現およびMyoDの発現を免疫染色により観察した結果を示す図であり、左がヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果、中央がヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティング後にヘパリチナーゼ処理してヘパラン硫酸鎖を除去したプレートを用いた結果、右がヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントをコーティングしたプレートを用いた結果である。ヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレート、ヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティング後にヘパリチナーゼ処理してヘパラン硫酸鎖を除去したプレート、ヒトラミニンα4β2γ1E8フラグメントをコーティングしたプレートをそれぞれ用いて、ヒトiPS細胞(201B7株)から骨格筋細胞へ分化誘導した14日目の細胞におけるSIX1遺伝子の発現量を定量した結果を示す図である。ヒトiPS細胞(201B7株)から血管内皮細胞へ分化誘導した4日目の細胞におけるVE-カドヘリン陽性/CD31陽性細胞数を、FACSを用いて解析した結果を示す図であり、左の2つがヒトラミニンα4β1γ1E8フラグメントをコーティングしたプレートを用いた結果、右の2つがヒトラミニンα4β1γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果である。ヒトiPS細胞(201B7株)から血管内皮細胞へ分化誘導した4日目の細胞におけるVE-カドヘリン陽性/CD31陽性細胞率を、FACSを用いて解析した結果を示す図であり、左の2つがヒトラミニンα4β1γ1E8フラグメントをコーティングしたプレートを用いた結果、右の2つがヒトラミニンα4β1γ1E8フラグメントのα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲートをコーティングしたプレートを用いた結果である。図10009本発明は、高効率で多能性幹細胞から体細胞へ分化誘導する方法を提供する。本発明の分化誘導方法(以下、「本発明の方法」という。)は、ラミニンE8フラグメントとヘパラン硫酸プロテオグリカンの増殖因子結合部位を含むフラグメントとが連結したコンジュゲートを細胞に接触させることを特徴とするものであり、多能性幹細胞を、ヘパリン結合性増殖因子を含む培地を用いて体細胞に分化誘導する方法に適用することができる。0010ラミニンは、α鎖、β鎖およびγ鎖の3本のサブユニット鎖からなるヘテロ三量体分子である。α鎖はα1〜α5の5種類、β鎖はβ1〜β3の3種類、γ鎖はγ1〜γ3の3種類が知られており、それらの組み合わせで少なくとも12種類以上のアイソフォームが存在する(表1参照)。本明細書において、ラミニンの各アイソフォームを、例えばラミニン111のように表記する。マウスラミニン111以外のラミニンについてもエラスターゼで消化した際にマウスラミニン111E8に相当するフラグメントの存在が推定されるが、マウスラミニン111以外のラミニンをエラスターゼで消化してE8を分離、同定した報告はない。したがって、本発明の方法に用いられるラミニンE8は、ラミニンのエラスターゼ消化産物であることを要するものではなく、マウスラミニン111E8と同様の細胞接着活性を有し、類似の構造を有するラミニンフラグメントであればよい。0013ラミニンE8は、α鎖のC末端フラグメントから球状ドメイン4および5が除かれたフラグメント(以下「α鎖E8」と表記する)、β鎖のC末端フラグメント(以下「β鎖E8」と表記する)およびγ鎖のC末端フラグメント(以下「γ鎖E8」と表記する)が三量体を形成したフラグメントである。三量体の分子量は特に限定されないが、通常約150〜約170kDaである。0014ラミニンE8は、どのような生物のラミニンから得られるものでもよいが、哺乳動物のラミニンから得られるものが好ましい。動物種と同じ動物種のラミニンから得られるラミニンE8が使用される。本発明の方法は、ヒト多能性幹細胞およびヒトのラミニンから得られるE8を用いることが特に好ましい。ヒト多能性幹細胞からヒトの再生医療に使用する細胞を分化誘導する場合、製造工程において異種生物由来の成分の使用を排除することが求められるからである。0015ラミニンE8は、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。α鎖E8、β鎖E8およびγ鎖E8をコードするDNAをそれぞれ取得し、これをそれぞれ発現ベクターに挿入し、得られた3種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、三量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。2007)の方法が挙げられるが、これに限定されない。ラミニンE8はその生物学的活性を維持したまま、1個またはそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。0016主要な哺乳動物のラミニンを構成するα鎖、β鎖、γ鎖をコードする遺伝子の塩基配列情報および各鎖のアミノ酸配列情報は、公知のデータベース(GenBank等)から取得することができる。表2に、ヒトのラミニンを構成する各鎖のアクセッション番号を示す。これら以外の各種生物のラミニン構成鎖の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報も同様に公知のデータベース(GenBank等)から取得することができる。00170018ラミニンE8に連結されるヘパラン硫酸プロテオグリカンとしては、例えば、パールカン、アグリン、XVIII型コラーゲン、シンデカン1〜4、グリピカン1〜6などが挙げられる。2003)などが挙げられる。好ましくはパールカンのドメイン1である。0019ヘパラン硫酸プロテオグリカンまたはその増殖因子結合部位を含むフラグメントの製造方法は特に限定されず、公知の遺伝子組換え技術を適宜用いることにより製造することができる。ヒトのパールカン、アグリン、XVIII型コラーゲン、シンデカン1〜4、グリピカン1〜6をそれぞれコードする遺伝子の塩基配列情報およびアミノ酸配列情報は、それぞれ表3に記載したアクセッション番号で公知のデータベース(GenBank等)から取得することができる。含むフラグメントは2箇所に連結していてもよく、3箇所に連結していてもよく、4箇所に連結していてもよい。連結部位は特に限定されないが、α鎖のC末端であることが好ましい。以下、ラミニンE8と増殖因子結合部位を含むフラグメントとが連結したコンジュゲートを単に「コンジュゲート」と表記する。0022コンジュゲートにおいて、ラミニンE8と増殖因子結合部位を含むフラグメントは直接連結してもよく、リンカーを介して連結してもよい。リンカーは、タンパク質の連結に使用可能な公知のリンカーを用いることができる。コンジュゲートはラミニンE8と増殖因子結合部位を含むフラグメントとの融合タンパク質として構成されていてもよい。α鎖のC末端に増殖因子結合部位を含むフラグメントが融合したコンジュゲートを製造する場合、α鎖E8をコードするDNAと増殖因子結合部位を含むフラグメントをコードするDNAが連結した融合遺伝子を挿入した発現ベクターを作製する。この融合遺伝子発現ベクターと、ヒトラミニンのβ鎖E8発現ベクターおよびγ鎖E8発現ベクターの3種類の発現ベクターを適切な宿主細胞に共導入して発現させ、三量体を形成しているタンパク質を公知の方法で精製することにより製造することができる。ラミニンE8のα鎖のC末端以外の末端に増殖因子結合部位を含むフラグメントが融合したコンジュゲートや、複数の末端に増殖因子結合部位を含むフラグメントが融合したコンジュゲートも、これに準じて製造することができる。0023本発明の方法において、コンジュゲートを細胞に接触させるために、コンジュゲートを添加した培地を用いて細胞を培養してもよく、コンジュゲートをコーティングした培養容器を用いて細胞を培養してもよい。コンジュゲートを添加した培地を用いる場合は、予めコンジュゲートを培地に添加しておいてもよく、用時にコンジュゲートを培地に添加してもよい。添加するコンジュゲートの量は特に限定されないが、培養容器の培養面積あたり約0.03〜約25μg/cm2になる濃度が好ましく、約0.06〜約10μg/cm2になる濃度がより好ましく、約0.1〜約2μg/cm2になる濃度がさらに好ましい。0024コンジュゲートを培養容器にコーティングする場合は、コンジュゲートを適当な溶媒、例えばPBS、生理食塩水、トリスヒドロキシメチルアミノメタンあるいは4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルフォン酸で中性pHとした生理的食塩水などで希釈し、この溶液を適当な培養容器に添加して、室温〜37°C程度で約1〜約12時間程度静置してコーティングすることができる。コンジュゲートのコーティング濃度は特に限定されないが、培養容器の培養面積あたり約0.03〜約25μg/cm2が好ましく、約0.06〜約10μg/cm2がより好ましく、約0.1〜約2μg/cm2がさらに好ましい。ゼラチン、血清アルブミン等の活性低下抑制剤を同時にコーティングすることにより、コーティングしたコンジュゲートの乾燥による活性低下を抑制することができる(WO2014/199754A1参照)。0025本発明の方法において、コンジュゲートを細胞に接触させる期間は特に限定されない。多能性幹細胞から体細胞への分化誘導期間の一部にコンジュゲートを細胞に接触させる期間が設けられていればよく、多能性幹細胞から体細胞への分化誘導期間の全期間においてコンジュゲートを細胞に接触させることを要しない。Factor)などが挙げられる。これらのヘパリン結合性増殖因子は、培地に添加したものでもよく、培養中の細胞から分泌されたものでもよい。培地に含まれるヘパリン結合性増殖因子は1種類でもよく、2種類以上でもよい。本発明の方法は、コンジュゲートを構成するラミニンE8が細胞表面のインテグリンと結合すると共に、ラミニンE8に連結した増殖因子結合部位を含むフラグメントの増殖因子結合部位に培地に含まれるヘパリン結合性増殖因子が結合することにより、細胞表面の増殖因子受容体が効率よく活性化するため、体細胞への分化誘導効率が向上すると考えられる。0027本発明の方法に使用可能な多能性幹細胞としては、生体に存在するすべての細胞に分化可能である多能性を有し、かつ、増殖能をも併せもつ幹細胞であればよい。(iPS細胞)、培養線維芽細胞や骨髄幹細胞由来の多能性細胞(Muse細胞)などが挙げられる。好ましくは、ES細胞、ntES細胞およびiPS細胞であり、より好ましくはiPS細胞である。多能性幹細胞は、哺乳動物の多能性幹細胞であることが好ましい。哺乳動物は特に限定されず、ヒト、マウス、ラット、ウシ、ブタ等が挙げられる。なかでもヒトが好ましい。ヒト多能性幹細胞を用いることにより、ヒトの再生医療に利用可能な安全な体細胞を取得することができる。0028コンジュゲートを構成するラミニンE8のアイソフォームは、分化誘導過程にある細胞および最終分化した成熟細胞が発現するインテグリンの種類を考慮して、適宜選択することが好ましい。インテグリンα6β1に結合特異性を有するラミニンアイソフォームとしては、α5鎖を有するラミニン(ラミニン511、ラミニン521)、α3鎖を有するラミニン(ラミニン311,ラミニン321、ラミニン332)、α4鎖を有するラミニン(ラミニン411、ラミニン421)、α1鎖を有するラミニン(ラミニン111、ラミニン121)が挙げられる。インテグリンα6β4に結合特異性を有するラミニンアイソフォームとしては、α3鎖を有するラミニン(ラミニン332、ラミニン311、ラミニン321)、α5鎖を有するラミニン(ラミニン511、ラミニン521)が挙げられる。インテグリンα3β1に結合特異性を有するラミニンアイソフォームとしては、α3鎖を有するラミニン(ラミニン332、ラミニン311、ラミニン321)、α5鎖を有するラミニン(ラミニン511、ラミニン521)が挙げられる。インテグリンα7β1に結合特異性を有するラミニンアイソフォームとしては、α2鎖を有するラミニン(ラミニン211、ラミニン221)、α1鎖を有するラミニン(ラミニン111、ラミニン121)が挙げられる。0029ヘパリン結合性増殖因子を含む培地を用いて多能性幹細胞を任意の体細胞に分化誘導する方法における体細胞とヘパリン結合性増殖因子の組み合わせの一例を表4に示す。本発明の適用範囲はこれに限定されず、ヘパリン結合性増殖因子を含む培地を用いて多能性幹細胞を任意の体細胞に分化誘導する全ての方法に適用することができる。00300031表4の体細胞とヘパリン結合性増殖因子の組み合わせが記載された代表的な文献を以下に記載する。(1)は、本願明細書の実施例1である。27.0032本発明の方法において分化誘導の対象となる体細胞は特に限定されず、多能性幹細胞から分化誘導可能な全ての体細胞を対象とすることができる。