体細胞には最終分化した成熟細胞だけでなく、最終分化に至っていない分化途中の細胞も含まれる。0033本発明の方法において分化誘導の対象となる体細胞は、中胚葉由来の体細胞であってもよい。本発明の方法における体細胞は中胚葉由来の筋肉細胞であってもよく、心筋細胞または骨格筋細胞であってもよい。本発明の方法における体細胞は中胚葉由来の血管内皮細胞であってもよい。0034本発明の方法は、ヒトiPS細胞を、骨形成タンパク質4またはアクチビンAを含む培地を用いて心筋細胞に分化誘導する方法に適用することができる。この場合、コンジュゲートとして、ヒトラミニン421E8のα4鎖のC末端またはヒトラミニン511E8のα5鎖のC末端にパールカンのドメイン1が連結しているコンジュゲートを用いることが好ましい。0035本発明の方法によりヒトiPS細胞を心筋細胞に分化誘導する場合、分化誘導の全期間にわたって細胞をコンジュゲートに接触させることが好ましい。骨形成タンパク質4またはアクチビンAは、分化誘導開示時に培地に添加して約24時間培養し、その後は骨形成タンパク質4またはアクチビンAを含有しない培地に交換することが好ましい。肝細胞増殖因子を含む培地を用いて骨格筋細胞に分化誘導する方法に適用することができる。この場合、コンジュゲートとして、ヒトラミニン421E8のα4鎖のC末端、ヒトラミニン511E8のα5鎖のC末端、ヒトラミニン411E8のα4鎖のC末端またはヒトラミニン521E8のα5鎖のC末端にパールカンのドメイン1が連結しているコンジュゲートを用いることが好ましい。好ましくはヒトラミニン421E8のα4鎖のC末端にパールカンのドメイン1が連結しているコンジュゲートである。肝細胞増殖因子は、ヒトiPS細胞から皮筋節(dermomyotome)細胞に分化させた後に、培地に添加することが好ましい。含む培地を用いて血管内皮細胞に分化誘導する方法に適用することができる。この場合、コンジュゲートとして、ヒトラミニン411E8のα4鎖のC末端にパールカンのドメイン1が連結しているコンジュゲートを用いることが好ましい。細胞とコンジュゲートの接触開始の時点から培地に添加することが好ましい。0040以下、実施例により本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。>(1)ラミニンE8およびラミニンE8とパールカンドメイン1が連結したコンジュゲートヒトラミニン511E8(以下「LN511E8」と表記する)、LN511E8のα5鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲート(以下「P-511E8(D1;a-C)」と表記する)、ヒトラミニン421E8(以下「LN421E8」と表記する)およびLN421E8のα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲート(以下「P-421E8(D1;a-C)」と表記する)を使用した。2007)に従って作製した(WO2014/199754A1の実施例参照)。P-511E8(D1;a-C)は、WO2014/199754A1の実施例の「Plus#5ラミニンE8」と同一分子であり、その作製方法はWO2014/199754A1に記載されている。LN421E8は、上記井戸らの方法において、α5鎖E8をα4鎖E8に、β1鎖E8をβ2鎖E8にそれぞれ変更して作製した。α4鎖E8発現ベクターおよびβ2鎖E8発現ベクターの作製方法はWO2014/103534A1に記載されている。P-421E8(D1;a-C)は、P-511E8(D1;a-C)の作製方法において、α5鎖E8をα4鎖E8に変更し、β1鎖E8をβ2鎖E8に変更して作製した。BRCから購入して使用した。2014)を一部変更したプロトコールを用いて維持培養した。253G1株はLN511E8またはP-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートに播種して分化誘導させた。201B7株はLN421E8またはP-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートに播種して分化誘導させた。Technologies)を0.5mMEDTA/PBS(-)で1:1に希釈した液)を添加し、37°C5分間インキュベートしてhiPS細胞を剥がし、hiPS細胞懸濁液を調製した。詳細には、インキュベート後に細胞剥離液を吸引除去し、PBS(-)で洗浄した後、10μMのROCK阻害剤(Y-27632、和光純薬)を含有するStemFitAK02N培地(味の素)を1ml/well加え、セルスクレーパーを用いてhiPS細胞を回収した。Technologies)を用いて細胞数を測定した。コーティング液を1.5ml/well添加し、4°Cで一夜静置してコーティングを行った。当日、コーティングされたラミニンE8の乾燥による失活を防止するために、PBS(-)で調製したリコンビナントヒト血清アルブミン(Novozymes)溶液(1mg/ml)を1.5ml/well添加した。ウェルに残った溶液を吸引除去し、単一細胞に分散した253G1株hiPS細胞および201B7株hiPS細胞を、それぞれ5.0×105cells/wellで播種し、前培養を開始した。培地には、10μMのROCK阻害剤(Y-27632)を含有するStemFitAK02N培地を使用した。37°C、0.5%CO2条件下で3日間培養し、50〜60%コンフルエントに達した時点で分化誘導を開始した。11:560-569)を一部変更したプロトコールを用いた。分化誘導に使用した培地、および添加した因子を以下の表5に示した。Wntシグナル活性化剤であるCHIR99021(最終濃度5μM、Sigma-Aldrich)を添加した培地を用いた。CHIR99021(最終濃度)を含有するがBMP4を含有しない前記培地に交換した。含有するRPMI1640に培地を交換した。Wntシグナルの阻害剤であるIWR1(和光純薬)を最終濃度10μMとなるよう添加した培地に交換した。L-glutamineを含有するRPMI1640に交換した。12まで)1日おきに同じ培地で培地交換を行った。0047(5)拍動細胞の観察253G1株hiPS細胞から分化誘導した細胞の拍動を観察した。PrimoVert倒立顕微鏡(ZEISS)の低倍レンズ(4倍)でウェル全体を観察し、拍動細胞塊の位置を確認した。次に、BZ-X700オールインワン蛍光顕微鏡(Keyence)のタイムラプスモジュールを用いて同倍率(4倍)で拍動細胞塊を10秒間にわたって動画撮影した。Analyzerを用いて10秒間の動画を291枚の静止画像に変換し、個々の拍動細胞塊の伸縮している箇所を選択して拍動に伴う移動距離(振幅:μm)を定量測定した。そのデータをExcelにエクスポートしてグラフを作成した。1;415(3):417-427)を一部変更した方法で実施した。253G1株hiPS細胞から分化誘導した細胞および201B7株hiPS細胞から分化誘導した細胞をFACS解析に供した。Fluor488標識ヤギ抗マウスIgG抗体を使用した。Technologies)を0.5mMEDTA/PBS(-)で1:1に希釈した液)で剥がし、繰り返しのピペッティングで単一細胞まで分散させた。PBS(-)で希釈したホルマリン(ホルマリン:PBS(-)=1:10)を用いて室温で10分間固定処理を行った。ホルマリンを除去し、PBS(-)で2回洗浄した後、800μlのPBS(-)に懸濁した。X-100を含むPBS(-)を200μl加えて15分間の透過処理を行った。Technologies)を含むPBS(-)(ブロッキング液)を500μl添加し、15分間静置した。ブロッキング後、ブロッキング液で4μg/mlに希釈したマウス抗トロポニンT抗体1μlを添加して、室温で60分間インキュベートした。Fluor488標識ヤギ抗マウスIgG抗体)を添加して室温で60分間インキュベートした。Dickinson)を用いてトロポニンT陽性細胞の解析を行った。0052(6-2)201B7株hiPS細胞から分化誘導した細胞のFACS解析10日間分化誘導した細胞を用いた。Dickinson)を用いてトロポニンT陽性細胞の解析を行った。0053<結果>(1)拍動細胞の観察hiPS細胞(253G1株)から心筋細胞へ分化誘導した細胞の拍動を観察した結果を図1、図2、図3に示した。図1は拍動細胞塊を10秒間動画撮影した1コマの静止画像であり、(A)はLN511E8をコーティングしたプレートを用いて分化誘導した細胞、(B)はP-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いて分化誘導した細胞の結果である。破線で囲っている部分が1個の拍動細胞塊である。LN511E8をコーティングしたプレートを用いた場合は1視野内に1か所のみ拍動細胞塊が観察されたのに対し、P-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合は1視野内に12か所の拍動細胞塊が観察された。図1図2図30054図2は図1(A)の拍動細胞塊の10秒間の拍動回数と移動距離をグラフ化した図であり、図3は図1(B)の12個の拍動細胞塊のそれぞれについて、10秒間の拍動回数と移動距離をグラフ化した図である。図2、3のグラフのX軸は時間(秒)を示し、Y軸は拍動に伴う始点(選択箇所)からの移動距離(単位μm)を示す。LN511E8をコーティングしたプレートを用いた場合は拍動細胞塊の10秒間の拍動数が5回であったが、P-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合は拍動細胞塊が10秒間に8-13回拍動し、よりヒト心筋細胞に近似した拍動を示すことがわかった。(A)はLN511E8をコーティングしたプレートを用いた結果であり、(B)P-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた結果である。(A)では15.1%のcTnT陽性細胞が認められた。(B)では71.6%のcTnT陽性細胞が認められた。(A)はLN421E8をコーティングしたプレートを用いた結果であり、(B)はP-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた結果である。(A)では10.4%のcTnT陽性細胞が認められた。(B)では33.9%のcTnT陽性細胞が認められた。図50057以上の結果から、hiPS細胞から心筋細胞への分化誘導において、P-511E8(D1;a-C)またはP-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いることの有用性および優位性が明らかになった。>(1)ラミニンE8およびラミニンE8とパールカンドメイン1が連結したコンジュゲートLN421E8、P-421E8(D1;a-C)およびP-511E8(D1;a-C)を使用した。これらはいずれも実施例1で使用したものと同じである。0059(2)hiPS細胞hiPS細胞201B7株を使用した。iPSCs、以下「MYF5-tdTomato」と表記する)を作製した。MYF5-tdTomatoは、片アレルのみに遺伝子組み換えが行われたことを確認している。1mlを添加して洗浄し、Accutaseを500μl添加し、37°C10分間インキュベートした。ピペッティングにより細胞を剥離し、StemFitAK02N培地(味の素)を2ml添加してチューブに回収した。900rpmで5分間遠心分離し、上清を除去して10μMのY-27632を含有するStemFitAK02N培地を1〜2ml加えて再懸濁し、細胞数を測定した。コーティング液を1.5ml/well添加し、37°Cで1時間静置してコーティングを行った。マトリゲルはhiPS細胞維持培地(KSR培地、bFGF不含)で100倍に希釈してウェルに添加し、37°Cで一夜静置してコーティングを行った。Y-27632含有StemFitAK02Nで培地交換し、2日間培養を続けた。0)に、分化培地A(2ml/well)に培地交換した。(SIGMA)を添加したもの)である。5)に培地交換を行った。7)に次の方法で継代を行った。0.25%Trypsin/1mMEDTAを添加して、37°Cで5分間インキュベートした。続いて、2.5mlのCDMi基本培地を加えて、ピペッティングにより単一細胞まで分散させた。900rpm、4°Cで5分間遠心分離した後、上清を除去し、CDMi基本培地で再懸濁した。その後、細胞数をカウントした。前日にマトリゲル、LN421E8、P-421E8(D1;a-C)またはP-511E8(D1;a-C)をコーティングした培養用6穴プレートに、分化培地A(2ml/well)を添加し、4×105cells/wellで播種した。12)に培地交換を行った。7と同じ方法で継代を行った。培地を10μMのY-27632を含有するCDMi基本培地に変更した。播種細胞数は、10cmディッシュの場合1枚あたり6×105個、6cmディッシュの場合1枚あたり2×105個、6wellプレートの場合1wellあたり1×105個とした。17)に培地を筋分化培地に変更した。38日目までは週2回、新鮮な筋分化培地で培地交換を行った。38に培地を成熟化培地に変更し、週3回培地交換を行って培養を続けた。2-MEを含有するDMEM培地)である。分化誘導38日目の細胞をプレート上に接着したまま、PBS(-)で希釈した2%パラホルムアルデヒド溶液を用いて4°Cで10分間固定処理を行った。パラホルムアルデヒドを除去し接着細胞をPBS(-)で3回洗浄した後、ブロッキングワン液(ナカライテスク)にて1時間室温でブロッキングした。一次抗体にはマウス抗ミオシン重鎖(MHC)抗体(eBiosciense)およびウサギ抗MyoD抗体(Abcam)を使用した。100/PBS(-)で10倍に希釈したブロッキングワン液で400倍希釈し、ブロッキングワン液を除去した接着細胞に添加し、室温で60分間インキュベートした。Fluor568標識抗マウスIgG抗体を添加し、遮光下室温で60分間インキュベートした。Fisher)で、遮光下室温で5分間カウンター染色を行った。PBS(-)で3回洗浄した後、BZ-X700オールインワン蛍光顕微鏡を用いてMHCおよびMyoD陽性細胞を観察した。分化14日目の細胞を回収し、SIX1およびSox1の遺伝子発現量を定量した。Chain(MHC)、MyogeninおよびPax7の遺伝子発現量を定量した。System(Promega)を用いて、回収した細胞からRNAを精製した。1μgより、ReverTraAce-a-キット(東洋紡)を用いてcDNAを合成した。Fisher)を用いて、各遺伝子特異的プライマーとともに定量的PCRを実施した。Fisher)を用いて標準プロトコールにて実施した。別途、未分化hiPS細胞を免疫不全マウスに移植して形成させた奇形腫からRNAを精製してcDNAを合成し、標準曲線作成用のポジティブコントロールとして使用した。奇形腫における各遺伝子の発現量を1とし、分化誘導後の細胞における各遺伝子の相対発現量を算出した。RNA量を内因性コントロールであるβアクチンの発現量で補正した。I(Sigma)にて37°C、30分反応させ細胞をディッシュから剥離し、さらにAccutase(ナカライテスク)にて37°C、10分間反応させ、繰り返しのピペッティングで単一細胞まで分散させた。Biosciences)を用いてtdTomatoの発現量を解析した。0069<結果1:MYF5-tdTomatoを用いた骨格筋細胞への分化誘導の評価>hiPS細胞としてMYF5-tdTomatoを用い、マトリゲル、LN421E8、P-421E8(D1;a-C)またはP-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートで、上記の方法により骨格筋細胞への分化誘導を行った。14日目の細胞におけるSIX1遺伝子(骨格筋に発現)とSox1遺伝子(神経に発現)の発現量を定量した。18日目および85日目の細胞におけるMyf5(骨格筋幹細胞マーカー)陽性細胞の出現率をFACSで解析した。38日目の細胞におけるMHCとMyoDの発現を免疫染色により観察した。0070(1)免疫染色38日目の細胞におけるMHCとMyoDの発現を免疫染色により観察した結果を図6に示した。マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合は(上段:MG)、観察視野の中にMHC陽性細胞およびMyoD陽性細胞が存在する領域と存在しない領域(黒い部分)が観察された。LN421E8をコーティングしたプレートを用いた場合は(2段目:421)、観察視野の一部にMHC陽性細胞およびMyoD陽性細胞が存在したに過ぎず、マトリゲルより分化効率が劣ることが示された。P-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合は(3段目:p421)、観察視野の全体にMHC陽性細胞およびMyoD陽性細胞が観察され、分化効率はマトリゲルより顕著に優れていることが示された。P-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合は(下段:p511)、マトリゲルと同様にMHC陽性細胞およびMyoD陽性細胞が存在する領域と存在しない領域(黒い部分)が混在したが、存在する領域はマトリゲルより多かった。図60071(2)遺伝子発現14日目の細胞におけるSIX1遺伝子およびSox1遺伝子の発現量を定量した結果を図7に示した。(A)はSIX1遺伝子の結果、(B)はSox1遺伝子の結果である。骨格筋に発現するSIX1遺伝子は、P-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合(図中p421)、マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合(図中MG)より2倍以上発現量が高かった。P-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合は(図中p511)マトリゲルと同程度の発現量であり、LN421E8をコーティングしたプレートを用いた場合は(図中421)ほとんど発現していなかった。神経に発現するSox1遺伝子は、LN421E8をコーティングしたプレートを用いた場合(図中421)に発現量が高かったが、それ以外では、ほとんど発現していなかった。図70072(3)FACS解析18日目および85日目の細胞におけるMyf5(骨格筋幹細胞マーカー)陽性細胞の出現率をFACSで解析した結果を図8に示した。左は18日目の結果、右は85日目の結果である。P-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合(図中p421)、18日目の時点でMyf5陽性細胞6.9%出現しており、マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合(図中MG)の出現率(1.6%)より顕著に高かった。85日目では、マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合が4.6%であるのに対して、P-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合は22.8%であった。図80073<結果2:201B7株を用いた骨格筋細胞への分化誘導の評価>hiPS細胞として、未分化性が安定しており分化誘導が難しいことが知られている201B7株を用い、マトリゲルまたはP-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートで、上記の方法により骨格筋細胞への分化誘導を行った。38日目の細胞におけるMHCとMyoDの発現を免疫染色により観察した。38日目の細胞における骨格筋マーカー遺伝子(MyoD、MHC、Myogenin、Pax7)の発現量を定量した。007438日目の細胞におけるMHCとMyoDの発現を免疫染色により観察した結果を図9に示した。マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合は(上段:MG)観察視野の一部にMHC陽性細胞およびMyoD陽性細胞が観察され、分化誘導効率が低かった。P-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを使用した場合は(下段:p421)観察視野の全体にMHC陽性細胞およびMyoD陽性細胞が観察され、分化誘導効率が顕著に優れていることが示された。図9007538日目の細胞における骨格筋マーカー遺伝子(MyoD、MHC、Myogenin、Pax7)の発現量を定量した結果を図10に示した。(A)はMyoD遺伝子の結果、(B)はMHC遺伝子の結果、(C)はMyogenin遺伝子の結果、(D)はPax7遺伝子の結果である。いずれの遺伝子発現も、マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合よりP-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを使用した場合の方が高かった。図100076以上の結果から、hiPS細胞から骨格筋細胞への分化誘導において、P-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いることの有用性および優位性が明らかになった。P-511E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いた場合は、マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合と同等の分化誘導効率が得られることが明らかになった。>(1)ラミニンE8およびラミニンE8とパールカンドメイン1が連結したコンジュゲート実施例2で用いたLN421E8、P-421E8(D1;a-C)およびP-511E8(D1;a-C)以外に、ヒトラミニン111E8(以下「LN111E8」)およびLN111E8のα1鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲート(以下「P-111E8(D1;a-C)」)、ヒトラミニン211E8(以下「LN211E8」)およびLN211E8のα2鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲート(以下「P-211E8(D1;a-C)」)、ヒトラミニン332E8(以下「LN332E8」)およびLN332E8のα3鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲート(以下「P-332E8(D1;a-C)」)、ヒトラミニン411E8(以下「LN411E8」)およびLN411E8のα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲート(以下「P-411E8(D1;a-C)」)、ヒトラミニン511E8(以下「LN511E8」)、ならびに、ヒトラミニン521E8(以下「LN521E8」)およびLN521E8のα5鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲート(以下「P-521E8(D1;a-C)」)を使用した。2007)を適宜変更して作製した。各ラミニンE8とパールカンドメイン1が連結したコンジュゲートは、WO2014/199754A1に記載の方法を適宜変更して作製した。0078(2)hiPS細胞hiPS細胞201B7株を使用した。上記の各ラミニンE8、上記の各コンジュゲートおよびマトリゲルをコーティングしたプレートを用いて、実施例2(3)と同じ方法で行った。上記の各ラミニンE8、上記の各コンジュゲートおよびマトリゲルをコーティングしたプレートを用いて、実施例2(4)と同じ方法で行った。Fluor488標識抗ウサギIgG抗体を使用しなかったこと以外は、実施例2(5)と同じ方法で行った。分化14日目の細胞を回収し、皮筋節(dermomyotome)マーカーであるSIX1遺伝子およびDMRT2遺伝子の発現量を定量した。遺伝子発現量の定量は、実施例2(6)と同じ方法で行った。分化誘導38日目の細胞におけるMHCの発現を免疫染色により観察した結果を図11に示した。マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合は(左1段目:MG)、観察視野の中にMHC陽性細胞が存在する領域と存在しない領域(黒い部分)が観察された。各ラミニンE8(左2〜8段目、111〜521)をコーティングしたプレートを用いた場合は、MHC陽性細胞がほとんど存在しなかった。各コンジュゲート(右1〜7段目、p111〜p521)をコーティングしたプレートを用いた場合はいずれもMHC陽性細胞が存在したが、実施例2の結果と同様に、P-421E8(D1;a-C)コーティングプレートを用いた場合(右5段目、p421)、観察視野の全体にMHC陽性細胞が観察され、分化効率はマトリゲルより顕著に優れていることが示された。P-411E8(D1;a-C)コーティングプレート、P-511E8(D1;a-C)コーティングプレートおよびP-521E8(D1;a-C)コーティングプレートを用いた場合(右4、6、7段目、p411、p511、p521)は、マトリゲルコーティングプレート(左1段目:MG)を用いた場合と同程度の領域にMHC陽性細胞が観察された。P-111E8(D1;a-C)コーティングプレート、P-211E8(D1;a-C)コーティングプレートおよびP-3321E8(D1;a-C)コーティングプレートを用いた場合(右1-3段目、p111、p211、p322)は、マトリゲルコーティングプレートを用いた場合より、MHC陽性細胞の領域は少なかった。図110081(2)遺伝子発現14日目の細胞におけるSIX1遺伝子およびDMRT2遺伝子の発現量を定量した結果を図12に示した。(A)はSIX1遺伝子の結果、(B)はDMRT2遺伝子の結果である。-)、P-111E8(D1;a-C)(図中111+)およびP-332E8(D1;a-C)(図中332+)をそれぞれコーティングしたプレートを用いた場合は、マトリゲルコーティングプレートを用いた場合と同程度の発現量であった。両遺伝子とも、P-211E8(D1;a-C)(図中211+)、P-411E8(D1;a-C)(図中411+)、P-421E8(D1;a-C)(図中421+)、P-511E8(D1;a-C)(図中511+)およびP-521E8(D1;a-C)(図中521+)をそれぞれコーティングしたプレートを用いた場合は、マトリゲルコーティングプレートを用いた場合より顕著に発現量が高かった。なかでも、P-421E8(D1;a-C)コーティングプレートを用いた場合が、最も発現量が高かった。以上の結果から、hiPS細胞から骨格筋細胞への分化誘導において、P-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いることの有用性および優位性が明らかになった。P-411E8(D1;a-C)、P-511E8(D1;a-C)およびP-521E8(D1;a-C)をそれぞれコーティングしたプレートを用いた場合は、マトリゲルをコーティングしたプレートを用いた場合と同等の分化誘導効率が得られることが明らかになった。>(1)ラミニンE8およびラミニンE8とパールカンドメイン1が連結したコンジュゲートLN421E8およびP-421E8(D1;a-C)を使用した。(2)hiPS細胞hiPS細胞201B7株を使用した。コーティング液を1.5ml/well添加し、4°Cで一夜静置してコーティングを行った。Saline(TBS)で3回洗浄した。続いて、1%スキムミルクを含むTBSを添加して室温で1時間静置し、ブロッキングを行った。mU/ml;0.22μmフィルターでろ過滅菌したもの)を1.5ml添加し、37°Cで6時間インキュベートした。0.1%rHSA/PBSで3回洗浄した。μchain(Invitrogen)を用いた免疫染色により確認した。0085(5)hiPS細胞の前培養LN421E8、P-421E8(D1;a-C)およびヘパリチナーゼ処理したP-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いて、実施例2(3)と同じ方法で行った。(6)骨格筋細胞への分化誘導LN421E8、P-421E8(D1;a-C)およびヘパリチナーゼ処理したP-421E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いて、実施例2(4)と同じ方法で行った。実施例2(5)と同じ方法で行った。分化14日目の細胞を回収し、皮筋節(dermomyotome)マーカーであるSIX1遺伝子の発現量を定量した。遺伝子発現量の定量は、実施例2(6)と同じ方法で行った。0087<結果>(1)免疫染色38日目の細胞におけるMHCとMyoDの発現を免疫染色により観察した結果を図13に示した。P-421E8(D1;a-C)コーティングプレートを用いた場合(左:p421)は観察視野の全体にMHC陽性細胞およびMyoD陽性細胞が観察されたが、ヘパリチナーゼ処理P-421E8(D1;a-C)コーティングプレートを用いた場合(中央:p421+Hepa)は、LN421E8コーティングプレートを用いた場合(右:421)と同様に、MHC陽性細胞およびMyoD陽性細胞は観察されなかった。図130088(2)遺伝子発現14日目の細胞におけるSIX1遺伝子の発現量を定量した結果を図14に示した。ヘパリチナーゼ処理P-421E8(D1;a-C)コーティングプレートを用いた場合(p421+Hepa)の発現量は、LN421E8コーティングプレートを用いた場合(421)と同程度の低い発現量であったが、P-421E8(D1;a-C)コーティングプレートを用いた場合は、有意に高い発現量を示した。以上の結果から、ラミニンE8とパールカンドメイン1が連結したコンジュゲートを用いて多能性幹細胞を体細胞に分化誘導する方法において、パールカンドメイン1のヘパラン硫酸鎖が重要な役割を演じていることが明らかになった。>(1)ラミニンE8およびラミニンE8とパールカンドメイン1が連結したコンジュゲートヒトラミニン411E8(以下「LN411E8」と表記する)、LN411E8のα4鎖のC末端にヒトパールカンのドメイン1を融合させたコンジュゲート(以下「P-411E8(D1;a-C)」と表記する)およびLN511E8を使用した。2007)に従って作製した(WO2014/199754A1の実施例参照)。LN411E8は、上記井戸らの方法において、α5鎖E8をα4鎖E8に変更して作製した。P-411E8(D1;a-C)は、WO2014/199754A1に記載のP-511E8(D1;a-C)の作製方法(実施例1参照)において、α5鎖E8をα4鎖E8に変更して作製した。京都大学の山中伸弥教授より受領したhiPS細胞409B2株を使用した。Falcon)に分注し、37°Cで2時間静置してコーティングを行った。Technologies)を0.5mMEDTA/PBS(-)で1:1に希釈した液)を添加し、37°C5分間インキュベートしてhiPS細胞を剥がした。hiPS細胞の細胞塊をLN511E8でコーティングした6穴プレートに5細胞塊/cm2の密度で播種し、mTeSR1培地で培養した。Fisher)に交換し、中胚葉前駆細胞への分化を誘導した。Expressを37°Cの条件で20分間反応させて全ての細胞を剥がし、繰り返しのピペッティングで単一細胞まで分散させた。LN411E8またはP-411E8(D1;a-C)でコーティングした6ウェルプレートに、単一細胞に分散した中胚葉前駆細胞を2×105/wellの密度で播種した。Fisher)で4日間培養した。血管内皮細胞への分化誘導4日目におけるマーカーの発現をフローサイトメトリーで解析した。詳細には、細胞をTrypLEExpressで37°Cで20分間処理し、StemPro-34SFM培地で抗体反応を行った。systems、1:10で希釈)を用いた。結果を図15に示した。いずれのVEGF濃度条件においても、VE-カドヘリン陽性/CD31陽性細胞数は、P-411E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いたほうがLN411E8をコーティングしたプレートを用いた場合より有意に増加していた。結果を図16に示した。いずれのVEGF濃度条件においても、VE-カドヘリン陽性/CD31陽性細胞率は、P-411E8(D1;a-C)をコーティングしたプレートを用いたほうがLN411E8をコーティングしたプレートを用いた場合より高い傾向を示した。図16実施例0096なお本発明は上述した各実施形態および実施例に限定されるものではなく、請求項に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態についても本発明の技術的範囲に含まれる。本明細書中に記載された学術文献および特許文献の全てが、本明細書中において参考として援用される。データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。”未来を創るためのプラットフォーム”astamuseは、世界中で未来を創るための「仕組み」を提供するため日々改善を進めています。専門用語を解析し、意味や用法を知ることが出来るキーワード情報そしてこれらの情報を最大限活用することで、挑戦したい社会課題を独自の切り口で編集。社会に大きな変化を起こし、未来を創るために活動し続けるのは容易なことではありません。行う為に必要なサービスの提供を行っていきます。それが私たちの考える“未来を創ること”です。