Mini试剂盒制备约40-50ng的基因组DNA作模板,准备扩增反应(50μl)。480型热循环仪中保温,其程序如下:循环1在94°C2.5分钟,72°C2.5分钟;循环2-26每个于94°C45秒,50°C45秒,和72°C2分钟;循环27在94°C45秒,50°C45秒,和72°C10分钟。第一种PCR产物(大约230bp片段)在5'末端包含SwaI位点和3'末端包含EcoRV位点,而第二种产物(大约230bp片段)在5'末端包含EcoRV位点和3'末端包含PmeI位点。agarase.将所得片段克隆入PmeI和SwaI消化的pJRoy43以制成pJRoy44(图4)。这个载体包含两个230bp的重复片段,中间以EcoRV位点分隔,侧翼为SwaI和PmeI位点。4:475-479),用Klenow片段制成平端,并连接至EeoRV消化的pJRoy44以制成pJRoy47(图3)。3).从pJRoy47获得侧翼为230bp重复序列的amdS基因作为SwaI/PmeI片段,将其插入EcoRV/StuI消化的pDM156.2中以制得pDM222.A(图3)。I片段于转化前用Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)纯化。28°C150rpm保温2-3天,以形成孢子。Co.,Wilmington,DE)上以7000rpm离心20分钟。YEPG培养基上并且在24°C,150rpm保温16小时,制得原生质体。Co.,Wilmington,DE)上以3500rpm离心7分钟。MgSO4溶液5ml重悬。2M山梨醇,所得混合物于2500rpm离心10分钟。1.25×107原生质体/ml。Francisco,CA)控制速率冷冻后,贮存在-80°C。I片段1μg和5μl肝素(5mg/ml的STC)加入50ml无菌聚丙烯试管。加入100μl原生质体,轻轻混合,并在冰上静置30分钟。SPTC,室温保温20分钟。I片段经同源重组用4.4kb片段(其包含pyrG侧翼序列和侧翼有230bp重复序列的amdS基因)置换。这导致缺失整个pyrG编码区以及0.78kb的5'非翻译区和0.8kb的3'非翻译区。System方案进行。Southernrn印迹。3.2kb的pyrG探针包含pyrG完整编码区,0.64kb的5'区,以及1.42kb的3'非翻译区。10mM尿苷的Vogel's/乙酰胺琼脂上。pyrG标记缺失体的9.5×105孢子,以筛选amdS标记的缺失。Southern印迹分析。I切割基因组DNA并用上述pyrG探针探测。1.4kb的杂交带,其表示amdS“loop-out”。