200ml水冲洗,然后转移至2ml小离心管中,并于60°C真空离心3小时冻干。X-100,500mM盐酸胍,200mM氯化钠)中重悬,随后彻底混合。RNAse然后于37°C保温10分钟。加入100μg蛋白酶K,使反应于50°C保温30分钟。PB洗柱并再离心1分钟。PE洗柱,然后再离心1分钟。1分钟而将DNA洗脱。19670作为第一引物,第二引物为掺入型oligo23701,23702或23703,如下所述,在下列条件下进行PCR:94°C,5分钟;30循环(94°C,30秒;50°C,30秒;72°C,1分钟),和72°C,5分钟。NJ,USA)的建议使用。SE)将所得产物纯化。7.接着将产物用Dpn1消化以除去模板DNA,然后在94°C保温30分钟以灭活Dpn1酶。2μg,和源于23701,23702或23703掺入型oligo反应的PCR片段每种5μg转化JaL250。97/07205所述使载体和PCR片段在体内重组。JaL250细胞也用消化的pENI1298或每种PCR产物单独转化。