無菌フィルター(0.2ミクロン)を通してソリューションをパスし、記録の日まで-20°Cで保存されるように200μlのアリコートに分ける。この溶液は、記録日に行われる。MΩ2-6の抵抗で記録マイクロピペットを準備します。2レーザープラー(サターインスツルメンツP-2000)を使用します。レーザーを準備します。nmの赤外線神経刺激としてファイバ結合レーザを使用するためのものです我々の実験では、光配信に使用される光ファイバの両端(AFWテクノロジーズMM1-FC2-200/220-5-Cで0.22の開口数で220分の200μmのコア/クラッド径シリカ繊維およびFC-PCコネクタです-0.22)。一端にコネクタ接続や他で切断)を生成するために半分にカットされた。先端が繊維軸に垂直で、ビジュアル検査時にフラットに表示されます)で観察することにより、高品質であることを確認してください。ソーラボADAFC2)を通じて適切なを使用して刺激レーザーのファイバー結合出力に光配信ファイバーを接続します。適切な楽器(LM-3検出ヘッドと例えばコヒーレントFieldMateの)を使用して、光送達繊維の切断された先端から出力レーザパワーを測定します。1研究室から別の輸送)レーザーに対して行われるたびにチェックすることをお勧めします。ファイバーチャックまたは同等のデバイスと貼る適切なマイクロポジショナーにチャックに光配信ファイバーを挿入します。正確には光ファイバがカバースリップとなす角度θを決定できることが重要である。ImageJの)を用いて測定することができる。角度θ(または可能な角度の範囲)は、主に実験装置の空間的な限界によって制約されます。)別のセットアップのために大きく異なる場合があります。Devices社)との間の接続を行う。パッチクランプデータ収集システムからのデジタル出力は、それが可能なデータ収集システムの独立したレーザパルスパラメータを指定すること、外部ファンクション·ジェネレータを介してレーザに接続されるべきである。この出力は、直接接続することができレーザドライバ(パルス長とデータ収集ソフトウェアによって設定される繰り返し率を必要とする)。いずれの場合も、レーザをトリガするために使用される信号は、レーザパルスのタイミング及び長さを電気生理学的信号を同時に記録することができることを保証するためにデータ収集システムの入力に接続する必要があります。/分の速度で浴の灌流を提供するために、流量を調整。我々は解決策の急速加熱、吸引によって使用済み溶液を除去するための蠕動ポンプを有効にするには、インラインヒーターで重力供給システム(アスピレーターボトル、ピンチバルブ、およびPE管)を使用します。正立顕微鏡の記録室(風呂)に培養細胞を用いたカバースリップを置きます。高倍率の水浸対物レンズ(Eを使用するg。微分干渉コントラストやDodtグラデーションコントラスト)、視覚文化の中でらせん神経節ニューロンを見つけます。図1aに示すように、典型的ならせん神経節ニューロンは、位相明るいラウンドと著名な核を持つ直径約15μmである。10倍)に切り替えて、視野内のターゲットニューロンを見つけます。次の手順を実行し(または同等)を使用して、所定の位置に光送達光ファイバを移動:先端が水平方向と垂直面の両方でターゲットニューロンに近くなるまで、出力ファイバを移動するマイクロポジショナーを使用します。ファイバーチップの垂直位置は、対物レンズを上下に移動(フォーカス走査)によって確認することができる。触れる)上に載っていることが重要である。水平面内で最適なアライメントは繊維がカバースリップおよび繊維半径rとなす角度θに依存します。2罪θ)、どこに負の値は、光ファイバ張り出しセルことを示すことになる。ターゲットの距離は約目視検査によって達成することができる。ターゲットはするように設計されて唯一の大まかなガイドラインとしての役割を果たす。-例えば、Δ設定≈0は、セルの近傍の局所温度を上昇させることが期待されるビームの中心からずれによる、セルに近いファイバ端面を移動させるから吸収されたエネルギーの増加に比べて最小である。Δ)に対してファイバー位置の正確な測定を使用してssibleは、所定の距離離れてそれを配置するよりも重要である。プロトコールのステップ3.8.2で説明したようにΔは、画像解析によって(±3μmの推定最大不確実性)を決定することができる。いくつかの実験5,8においては、白色光源は、所望の細胞を標的とするために、ファイバを介して接続されている。このアプローチは、標的領域からの散乱光の強度は、これらの浅い角度(θ)で相対的に低かったように、正立顕微鏡の設定で効果がないことが判明した。繊維が所定の位置になったら、マイクロピペットの簡単なポジショニングを可能にするために既知の量でそれを外に移動。繊維は、その後ニューラル記録が達成される元の位置に戻すことができる。微小電極ホルダーの側に取り付けられたチューブを使用して、マイクロピペットの詰まりを防止するために、正圧の少量を適用する。マイクロマニピュレータを使用して、単にターゲットニューロン上の位置にマイクロピペットを移動します。nAのにベースライン信号のマイクロピペット電位(ピペットオフセット)を調整します。2)内にあるかどうかを決定するために使用されるべきである。抵抗を監視しながら、静かにターゲットニューロンの表面にマイクロピペットを配置するマイクロマニピュレータの微調整を使用しています。マイクロピペットのニューロンに接触しているときに、抵抗(MΩ〜0.5〜1による)増加する。私mmediately抵抗増加に続いて、正の流体圧力を取り除き、小さな負圧を適用する。)に膜電位固定してください。'ギガシール'と呼ばれる)は、細胞膜とマイクロピペットとの間に形成されていることを示す、1GΩを超えるまで増加し続けなければならない。この時点で、マイクロピペットからすべての流体圧力を取り除く。とシールテストパルス中の電流に取り付けられた指数曲線から決定された入力抵抗を記録する。その後、スイッチポートと、アンプのCpFastとCpSlowコントロールを調整することにより、静電容量のトランジェントを最小化hは全細胞モードにアンプ、フラット現在までの容量や抵抗を補償は、シール試験中に観測される。フラット試験シール応答を維持するために容量や抵抗制御を調整する。直列抵抗補償(70%〜70%予測補正)を適用する。アンプに電流クランプモードに切り替えます。静止膜電位(電流注入がない場合)に注意してください。mVの)で膜電位を安定させる保持電流を設定します。ピペット容量を中和し、電圧降下のバランスをとるために、ブリッジバランスを調整する。Pa)の現在の脱分極で刺激することによって、ニューロンの発火特性を確認してください。ニューロンの隣の位置に光ファイババックを移動します。図1bおよび図1c)によってそれを正確Δ(目標ニューロンの中心に光ファイバ相対の上縁の位置)を決定することができる。一度Δが知られている、そのようなファイバ端面からターゲットニューロン(繊維軸に沿って)z及びビームδrの中心からのニューロンの半径方向変位との距離などのパラメータは、単純な三角法関係を用いて計算することができる。これらの位置パラメータの正確な知識が刺激プロセス25の間で可能な違いを解決するために必要になることがありますように分析は、細胞から細胞へのアカウントの位置のばらつきを考慮すべきである。電力、パルス長、繰り返し率など)で刺激レーザーを実行します。我々のレーザで、光パワーは、レーザドライバへの直接入力を介して制御され、各記録前に手動で指定されている。パルス長及び繰り返し率は、外部信号発生器またはデータ収集ソフト(ステップ2.3.4を参照)のいずれかによって制御することができる。データはパッチクランプチャンネルとレーザートリガチャンネルの両方から記録されていることを確認します。mJののエネルギーから、一般的に測定可能な電気的な応答が得られます。それは、このパラメータの影響を最小限にするため、1ヘルツ以下となるようにレーザパルスの繰り返し率を設定すると、最初の実験のために有用であり得る。記録された信号の変化を示す典型的な結果は、次の節に示されている。Resultsらせん神経節ニューロンは、電圧クランプと電流クランプ記録構成の両方で再現性のある波形のレーザー照射に応答します。mVで開催された膜電位と1秒間隔で繰り返しレーザーパルス、)。ネット内向き電流が一貫した照明が停止した後に初期値に戻って、レーザパルスに応答して誘発される。レーザー誘起電流の形状は、それがINSの基礎となるプロセスの完全な理解を得るために、保持電位の範囲で実験を行うことが重要であり得ることを示す、膜電位を変化させて変化させることが分かる。INSから得QV曲線の例については、電子文献7)。mJのレーザーパルス(初期膜電位-73mV、4ヘルツの繰返し速度で送達16レーザパルスにわたって平均)により誘発される膜電位の変化を示している。電流クランプ記録はパルスの後静止膜電位に向かっておよそ指数関数的減少が続いてレーザーパルスの経過とともに着実な膜の脱分極を示す。図3bの例では、レーザーパルスに続く小さな追加の膜の脱分極を示す。細胞の直接近傍の温度)に関連していることが示された。らによって記載図27特定の整列条件の下で、照射領域における軸方向及び半径方向の温度勾配に起因する拡散が密接図3bに示すように膜電位の変化に類似している局所的な温度変動につながる可能性があると判断した。これらの知見の結果、光伝送ファイバの端面に対する標的細胞の位置は、膜電位のレーザー誘発変化の時間経過及び最高温度の両方を決定する上で重要な役割を果たすと考えられているセルの範囲である。過剰なエネルギーや温度が大幅に増加への暴露に照射すると、ターゲットニューロンに損​​傷を与える可能性があります。)、セルの電気的特性の劣化を介して観察することができる。極端な場合にはさんの細胞死は、レーザー露光によりほぼ瞬時に発生します。mJのレーザーパルスへの曝露に起因するらせん神経節ニューロンの死の電圧クランプ記録を示しています。典型的ならせん神経節ニューロンと光刺激実験中の光ファイバとマイクロピペット(上から見て)の相対的な位置を示す位相コントラスト像)典型的ならせん神経節ニューロン。b)の位置での光ファイバ(画像が上に焦点を当てている。Δに張り出していることは否定的である):光ファイバの端)c)のオーバーレイ画像は、セル(音符に対する相対繊維位置を示す。上述したように、δyおよび&デルから見TA、繊維軸からニューロン中心の半径方向変位は、それぞれのニューロンの中心繊維の上端からの距離である。矢印は、らせん神経節ニューロンの位置を示す。スケールバーは20μm。標的細胞に対する相対光ファイバと微小電極の位置:光刺激実験のための実験(スケールしないように)挿入図の概略図。θ、Δ及びZは、プロトコルステップ3.4.2と3.8.2で定義されています。mJのレーザーパルス。影付きの領域は、レーザー露光のタイミングを示す。挿入図は、より詳細にレーザー照射時の応答を示す。mVのの膜電位を用いて得られたトレースに焦点を当てています。大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください。mJの)レーザパルスへの曝露に起因する細胞死を示す電圧クランプ録音。図3に示すようにpAの電流よりもかなり大きくなっている。librarian.Discussion本論文で概説プロトコルを使用すると、それは抽出して文化らせん神経節ニューロンと全細胞パッチクランプ実験を行うことにより、レーザー誘発電気的活動を調査することが可能である。インビボでは達成できない実験パラメータの制御のレベルを提供する。このような波長、パルスエネルギー、パルス長、パルス形状、及びパルス反復配列としてのレーザ刺激パラメータは、再現可能な設定で研究することができる。)は系統的ことで膜特性、したがって赤外線神経刺激のメカニズムを研究すること、変えることができる。電気および光刺激モダリティ間の相互作用はまた、制御された方法で調査することができる。これらの基本的な研究は、フロリダ州を導入することにより、さらに高度なことができますそのようなイオンの濃度又は熱ショックタンパク質の発現などの追加のパラメータを監視するuorescentプローブ。これらの種々のパラメータの明確な理解は、現象の完全な理解を達成するだけでなく、プロセスの最適化を介して、より効率的な刺激を達成するためにのみ重要ではない。INS機構内の温度が重要な役割を果たしているため、レーザ照射による局所的な加熱の正確な測定は、このメカニズム27を画定で極めて重要である。オープンパッチピペットを流れる電流を記録することによって較正された温度測定値を求める具体的な方法は、ヤオらによって記載されている。vitroで発見した。提供するdは、光伝送ファイバの位置が正確に決定することができる(現在のプロトコルを用いる)、温度測定のこの方法は、典型的なINS刺激による温度の局所的な変化の正確なマッピングを可能にする可能性がある。らによって媒介されるため、INS実験において考慮されるべきパラメータである。25用予想される波長効果の詳細な議論)。nmのダイオードレーザから他の著者によって使用されている。既存のINSの出版物で使用されるレーザーのいくつかの一般的な例は以下のとおりです。培養された螺旋神経節ニューロンにこの技術を適用することの潜在的な欠点は、記録電極を直接レーザーによって照射され、ニューロンの比較的小さなサイズ(〜10-15μmの直径)へのおかげである。シールおよびピペット抵抗)の特性を変更することができることが示唆されている。7は、レーザパワーが増大したとして3の閾値mJのパルスエネルギーを求める、QV曲線の逆転電位の変化を監視することによって、このしきい値を測定した。mVの電圧パルスに対する電流応答を記録することによって)細胞外液の温度を変化させながら。完全にINSのメカニズムを理解するためには、レーザ誘起抵抗変化を測定して考慮することが不可欠である。赤外線神経刺激は、生体内で行われてきたに関する実験研究の大半は今日まで。