和彦)分子生物学者にとって、酵素は完全に道具であり、キット化されているものも多く、酵素としての理解をしていない場合が多い。多少なりとも酵素学も手がけている研究室なので、分子生物学に使うものでも酵素としての特徴を把握して欲しい。そのことが、実験の失敗を減らし、キット化されていないようなものへの応用力にもつながる。Cloningなどの成書やカタログを参照し、また、キット化されているものでも、その試薬の組成などは必ず調べる(説明書に書いてなくても問い合わせれば教えてくれることが多い)。1.制限酵素反応Analyticalな反応とPreparativeな反応があり、目的にあわせて方法を変える。ここに示す反応量は一例であり、実験に応じて増減する。1-5unit至適温度(37°Cでない酵素に注意=>SmaI、SfiI、BssHIIなど)で、1時間。DNAさえきれいなら、overnightでも問題ない。DNAを使うことが多く、DNAの純度がやや落ちるので、酵素は少し多めに使う。Bufferを加え、10μlを電気泳動する。20μlの系で反応するのは電気泳動の失敗などに備えるため。・Preparativeな反応のようにDNA量が多い方が酵素はよく働くので、あまり酵素過剰にならないように気を付け、1時間後に一部を電気泳動で調べ、完全切断していたら反応を止める。overnightはできる限り避ける。digestionはDNAの末端を傷つけたり、nickを入れたりして次のステップに大きな支障を来たすことが多い。・市販の酵素は、表示されているよりもかなり力価が強くなっているので(表示力価はいわゆる最低保障と考えた方がよい)、理論量だけ入れれば必ず完全切断できるはずである。digestionになってしまう時は、酵素の量を増やすことよりも、下に述べるように自分のDNAの純度をまず疑うこと。・BSAは酵素を安定させ、混入物による酵素の阻害を軽減するので、通常全ての反応に加えた方がよい。bufferと混合して保存してはいけない(なぜか?考えてみること)。・制限酵素の分注は必ず未使用のピペットマンチップで行う。多数のサンプルを同じ酵素で切る場合は、まずチューブ゙にDNAのみ分注下した後、本数分の反応液を作る。ここに最後に酵素を入れて、穏やかに混和後分注する。することで、コンタミネーションを避け、使用する制限酵素を節約することができる。・全ての反応は使用する核酸の純度に左右される。DNAに混入してくる物質で問題になるのは、多くの場合、塩とフェノールである。etc)による切断のみがうまくいかなくなる。フェノールはほとんどの反応を阻害するので、多量の酵素を必要とするようになる。そのため、フェノール/クロロフォルム抽出後のエタノール沈殿はなるべく2回以上行い、最後の時はNaCl以外の塩を用いる。エタノールそのものは濃度が低ければ(1%以下)ほとんど反応に影響を与えないので、気にしなくてよい。製するDNA量を増やすことが有効である。DNA量が多ければ、たとえ混入物があっても反応にはそのごく一部が持ち込まれるだけで、悪影響を最小限に抑えられるからである。brothで培養するなど)の工夫をするとよい。・また、自分で精製したDNAの純度の検定は、UVスペクトラムをとるのもよいが、制限酵素のよい基質になるかどうかがよい基準になる。そのため、日常的な制限酵素反応で制限酵素を過剰に使う人も多いが、いつもある程度ぎりぎりの量を使っていれば、DNAの純度のよいコントロールとなる。そのため、初心者は最初は必ず理論量を使って反応をしてみること。self-ligation)によって、条件を設定するが、一般にDNA濃度と温度が高いほど、分子間結合が起きやすくなる。ligationなら37°Cでも原理的にはよい。richな末端では4°Cのような低温の方が、スリッピングを起こさず、siteが潰れることが少なくなる。fragmentを加えて反応を行っている。TakaraのライゲーションキットはNaClとPEGが反応液に入るとDNA末端の有効濃度が高められたような効果があることを利用して反応を促進している。ligationにはより注意を払う。coliにtoxicであることにも注意する。ライゲーションは最も頻繁にする操作の一つで、なおかつ制限酵素反応と違い、すぐには結果が見えないので、詳しい反応理論を一度は勉強するとよい。units;定価10,000円)などを用いている。phosphataseであり、DNAにnickを入れることもある。そこで反応は必要最小限とする。突出末端や平滑末端の場合は高温(55~65°Cぐらい)で1時間ぐらい処理する方が良い。反応後は必ずフェノール/クロロホルム抽出で酵素を完全に除く。突出の場合は削ることも埋めることもできる。fragment)などがある。Nuclease(いずれもTakaraのものを使用している。詳しくはカタログを参照。polymeraseとそのバッファーをライゲーションキットと一緒にしただけという製品なのでできれば単品で買いましょう。