min浸とうし、アルカリ変性を行った。セット後、その上にアルカリ変性させたゲルをのせた。minアルカリブロッティングした。minの洗浄を3回行った。hrインキュベートした。hrインキュベートしてハイブリダイゼーションを行った。minの洗浄を2回行った。加え、ヒートシーラーでバッグを密封した。し、未反応の標識抗体を除去した。加え、発色沈殿物が確認できるまで暗所でインキュベートした。bufferで反応を停止させた。thuringiensis全5株のゲノムDNAについて、PCRによるセレウリド産生株特異的配列の検出を行った。表2にプライマーの配列を示す。min上記の反応を30サイクル行った。MPを用いてPCRを行った。PCR産物は、アガロースゲル電気泳動により確認した。Kitを用いて付属のプロトコールに従い精製した。cereus特異的PCR産物は、以下の方法で精製した。buffer中で電気泳動後、目的とするバンドをゲルから切り出した。これにゲルと等量のTE飽和フェノールを加えボルテックスで混合した。混合液を加えよく混合した。し、DNAを沈殿させた。bufferに溶解させた。用いて、TAクローニングを行った。Dashで増幅したので、以下の方法でアデニンを付加した後、Tベクターとのライゲーションを行った。minインキュベートした。[QIAGEN]を用い付属のプロトコールに従いPCR産物を精製した。μlになるまで滅菌水を加え、4°Cで一晩インキュベートした。DH5αを形質転換した。brothに接種し、37°Cで一晩培養した。Kitを用いてプラスミドDNAを調製した。programを用い相同性検索を行った。推定されるアミノ酸配列を図4に示す。synthetaseと高い相同性が認められた。推定されるアミノ酸配列を図5に示す。synthetaseと高い相同性が認められた。プライマーセットで増幅されたPCR産物の塩基配列の比較により、前者は後者の内部配列であることが示された。新規決定部分と推定される。ゲノムDNAについてPCRを行った結果をそれぞれ図に示す。cereus全12株では、目的サイズのDNA断片が増幅された。おいては、52株中51株ではDNA断片の増幅は確認されなかった。bpのDNA断片が増幅された。このことから、分離株11はセレウリド合成に関与する遺伝子を保有しているが、発現していない可能性が考えられた。thuringiensisでは、全株でDNA断片は増幅されなかった。図9に示すようにBacillus属以外の細菌種でも目的のバンドの増幅はみとめられなかった。一部と推定される領域とその塩基配列が同定された.この結果,当該塩基配列に基づいてB.cereus嘔吐毒セレウリド生産株の特異的かつ簡便迅速に検出するためのPCR用プライマーセットを設計することが可能となった.このプライマーセットを用い,種々のB.cereus菌株,B.cereus以外のBacillus属細菌種,Bacillus属以外の細菌種のゲノムDNAを鋳型としてPCRを行った結果,B.cereusの中でも特に嘔吐毒生産株および嘔吐毒遺伝子を有すると思われる菌株のみを特異的に検出できることが確認された.これまで,その塩基配列が未知であったために不可能であった嘔吐毒セレウリド生産株の特異的かつ迅速な検出が本発明のプライマーセットを用いたPCRにより可能となった。cereus汚染を簡便かつ迅速に検出することが可能となった。【図1】各種B.cereus菌株ゲノムDNAを鋳型として(Tyr-Ala-2F)-(ER2)プライマーセットで増幅されたPCR産物を示す図である。【図2】各種B.cereus菌株ゲノムDNAを鋳型として(Tyr-Ala-1F)-(ER2)プライマーセットで増幅されたPCR産物を示す図である。【図3】各種B.cereus菌株ゲノムおよびプラスミドDNAのサザン分析を示す図である。No.55ゲノム遺伝子を鋳型として(Tyr-Ala-2F)-(ER2)プライマーセットで増幅されたPCR産物の塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。No.55ゲノム遺伝子を鋳型として(Tyr-Ala-1F)-(ER2)プライマーセットで増幅されたPCR産物の塩基配列と推定アミノ酸配列を示す図である。【図6】嘔吐毒生産B.cereus株ゲノムDNAを鋳型とした(6F)-(7R)プライマーセットによる増幅を示す図である。【図7】嘔吐毒非生産B.cereus株ゲノムDNAを鋳型とした(6F)-(7R)プライマーセットによる増幅を示す図である。【図8】各種B.thuringiensis株ゲノムDNAを鋳型とした(6F)-(7R)プライマーセットによる増幅を示す図である。【図9】各種細菌のゲノムDNAを鋳型とした(6F)-(7R)プライマーセットによる増幅を示す図である。cereus特異的ゲノムDNA断片。配列番号4および/または5のヌクレオチド配列を有する、請求項1記載のゲノムDNA断片。cereus検出用PCRプライマー。cereus検出用PCRプライマー。cereus検出キット。cereus検出キット。ekouhou.net。