[0001]本発明は、糖タンパク質の検出方法に関し、より詳細には、検出感度を向上させる糖タンパク質の検出方法に関する。背景技術[0002]タンパク質の半数以上が翻訳後に糖鎖修飾を受けている。糖鎖のタンパク質への結合様式は、アスパラギン残基のアミド基に結合するN結合型及びセリン又はスレオニン残基のヒドロキシル基に結合するO結合型に分けられる。重要な役割を果たしている。糖鎖修飾の変化が疾患と関連することが数多く報告されている。[0003]例えば、血清に含まれるαフェトプロテイン(N結合型糖鎖)は、健康な成人の血清にほとんど存在しない。良性の肝疾患を持つ患者血清にはαフェトプロテイン-L1型糖鎖(AFP-L1)が増加し、肝臓ガン患者にはさらにフコシル化したαフェトプロテイン-L3型糖鎖(fAFP又はAFP-L3)が検出される。レクチンで検出される糖鎖の違いが、肝疾患診断に利用されている。有する糖タンパク質である。膵臓癌になると、ハプトグロビンにフコースが付加した病変ハプトグロビンが患者血清等から検出される。病変ハプトグロビンは、膵臓癌の病期の進行とともに増え、膵臓癌の腫瘍部摘出後には消失する。フコシル化ハプトグロビンの高精度かつ迅速な検出により、膵臓癌の早期発見が期待される。[0005]チログロブリンは、甲状腺の上皮細胞で合成され濾胞に貯留し、一般に全身の細胞に作用して細胞の代謝率を上昇させる働きをもつホルモンである。甲状腺ホルモンが過剰に分泌される甲状腺機能亢進症の代表例が、バセドウ病である。甲状腺ホルモンの分泌が不足する甲状腺機能低下症の例が慢性甲状腺炎(橋本病)である。このタンパク質は、糖鎖の一種であるフコースを有する。チログロブリンに付加した糖鎖の検出感度を高めることで、チログロブリン含量の測定精度を上げることができる。[0006]関節リウマチ患者では、血清中IgGの末端ガラクトースの付加率が減少し、末端にN-アセチルグルコサミンを持つ糖鎖の割合が増加する。ガラクトース欠損は、IgGの重要な生理機能である補体の活性化やFC受容体への結合能を著しく損なう。[0007]トランスフェリン(TF)は、679個のアミノ酸を持ち、その413番目と611番目のアスパラギン酸残基が末端シアル酸を有する二個の分岐状糖鎖でN-グリコシル化されている糖タンパク質である。トランスフェリンには、570番目のアミノ酸残基がプロリンであるTFC1と、それがセリンで置換されたTFC2という多型が存在する。TFC1C2のヘテロ接合体の遺伝子型を持つアルツハイマー疾患(AD)患者は、6個のシアル酸を有するTFの相対強度が、TFC1C1ホモ接合体の遺伝子型を持つ患者よりも有意に減少している。[0008]AD患者から採取したCSF糖タンパク質は、シアル酸付加率が有意に低下している。シアル酸量の変化は、AD以外にも、心臓血管疾患、アルコール依存症、糖尿病等について観察されている。[0009]上記糖タンパク質を検出するために、糖結合化合物の一種であるレクチンの使用が公知である。レクチンは、シアル酸、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン等の糖残基に親和性を示すタンパク質の総称である。特定の糖残基に親和性を有する植物、動物あるいは菌類由来のレクチンが数多く発見されている。[0010]レクチンを用いた糖タンパク質の検出方法として、レクチンELISA(酵素免疫測定法)やレクチンアフィニティクロマトグラフィーが知られている。レクチンELISAは、多数の検体を同時に測定できる、糖鎖を比較的簡便に測定することができる等の長所を有する。レクチンアフィニティクロマトグラフィーは、レクチンが特異的に糖鎖に結合する性質を利用したクロマトグラフィーであり、糖鎖構造のわずかな違いを見分けて分離する。発明が解決しようとする課題[0013]レクチンELISAやレクチンクロマトグラフィー等の糖タンパク質の検出方法において、糖タンパク質とレクチンとの反応によるシグナルが低いと、糖タンパク質の正確な検出が困難である。糖鎖量の変化と関連するような疾患を早期に精度高く診断するためには、レクチン反応に基づくシグナルの増大が望ましい。[0014]そこで、本発明の目的は、糖タンパク質を高精度に検出するために、糖タンパク質とレクチンをはじめとする糖結合化合物との反応物に基づくシグナル(反応値)を増大させる方法を提供することにある。糖タンパク質をプロテアーゼ処理することにより、上記課題を解決できることを見出した。検出する工程を含む、前記糖タンパク質の検出方法を提供する。[0016]本明細書において、「糖タンパク質」という用語は、糖ペプチドを含む意味で用いられる。「糖鎖」の用語は、本明細書において、単糖を含む意味で用いられる。好ましくは糖結合タンパク質である。[0017]前記プロテアーゼ処理は、例えばペプシン処理、パパイン処理又はアクチナーゼ処理である。[0018]前記試料は、例えば血清である。[0019]前記糖結合化合物は、例えばフコース、シアル酸、マンノース、グルコース、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン及びN-アセチルガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも一種に親和性を有する。[0020]前記糖タンパク質は、担体に固定化されていることが好ましい。[0021]前記糖タンパク質は、その抗体を介して前記担体に固定化されていることが好ましい。/又は前記糖結合化合物を検出するプローブは、標識されていることが好ましい。[0023]前記糖鎖は、例えば複合型糖鎖、高マンノース型糖鎖又はO結合型糖鎖である。チログロブリン、フェツイン、及びアシアロフェツインからなる群から選ばれる。発明の効果[0025]本発明の糖タンパク質の検出方法によれば、プロテアーゼ処理された糖タンパク質と糖結合化合物との反応物に基づくシグナル(反応値)が、プロテアーゼ未処理のものより増大する。糖鎖の欠損や付加が疾患と関連することが知られている糖タンパク質では、シグナルの増大は、疾患の早期の発見、診断や治療につながる。疾患の発症機構の解明、治療や予防に関する医学や生化学の研究に役立つことも期待される。発明を実施するための形態[0026]以下に、本発明の一実施の形態を詳細に説明する。本発明の糖タンパク質の検出方法は、該糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程、及び前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る工程、及び、前記反応物を検出する工程を含む。本発明の方法は、糖タンパク質を含む試料をプロテアーゼ処理する工程を必須に含む以外は、糖結合化合物を用いた従来の糖タンパク質の検出方法と同様である。[0027]本発明の測定対象となる糖タンパク質は、糖鎖を有するタンパク質であれば、特に限定されない。糖鎖には、N結合型糖鎖及びO結合型糖鎖が含まれる。前記N結合型糖鎖には、前記コア構造の還元末端のN-アセチルグルコサミンにフコースが付加した糖鎖も含まれる。[0028]本発明の検出対象となる糖残基には、シアル酸(Sia)、ガラクトース(Gal)、マンノース(Man)、グルコース(Glc)、N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)、N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)、フコース(Fuc)等が含まれる。これらの糖残基は、健常者が通常有する糖鎖構造に対して付加するものであっても、又は欠損するものであってもよい。ホルモン)、CEA(癌胎児性抗原)、前立腺特異抗原(PSA)、フコシル化前立腺特異抗原(fPSA)、チログロブリン(TG)、フェツイン(FET)、アシアロフェツイン(aFET)等が挙げられる。糖タンパク質は、糖タンパク質の糖鎖構造の変化と疾患や異常との関係が示唆されるものが好ましい。[0030]糖タンパク質を含む試料の由来は、特に限定されない。分泌物等が挙げられる。好ましくは血液、血漿又は血清であり、特に好ましくは血清である。プロテアーゼ処理に際し、血清等の糖タンパク質を含む試料を予め希釈しておいてもよい。[0031]本発明の方法では、糖タンパク質を糖結合化合物と反応させる前にプロテアーゼ(タンパク質分解酵素)で処理する。プロテアーゼは、糖タンパク質に作用して、糖ペプチドを生成させる酵素であれば、特に制限がない。該プロテアーゼを機能的に分類すると、アスパラギン酸プロテアーゼ(酸性プロテアーゼ)、セリンプロテアーゼ、システインプロテアーゼ、金属プロテアーゼ、N-末端スレオニンプロテアーゼ、グルタミン酸プロテアーゼ等が含まれる。[0032]上記プロテアーゼは、その由来を問わない。該プロテアーゼは、動物由来のプロテアーゼとしてペプシン、トリプシン、キモトリプシン、エラスターゼ、カテプシンD、カルパイン等;植物由来のプロテアーゼとしてパパイン、キモパパイン、アクチニジン、カリクレイン、フィシン、ブロメライン等;そして微生物由来のプロテアーゼとしてバチルス属、アスペルギルス属、リゾプス属、アオカビ属(ペニシリウム属)、ストレプトマイセス属、スタフィロコッカス属、クロストリジウム属及びリソバクター属由来のものが挙げられる。[0033]上記プロテアーゼは、市販のものを特に制限なく使用可能である。ペプシンとして、ブタ胃粘膜由来ペプシン(シグマ・アルドリッチ製)、パパインとして、パパイヤ由来パパイン(フナコシ(株)製)、ストレプトマイセス由来プロテアーゼとしてアクチナーゼE(科研製薬(株)製)等が挙げられる。[0034]プロテアーゼの使用量は、糖タンパク質とプロテアーゼとの反応が進行する量であればよい。反応時の濃度は、通常、0.0001~5mg/mLでよい。ペプシンは、0.0001~1mg/mLのような少量で効果が得られる点で好ましい。[0035]プロテアーゼ処理のpH、温度、時間等の条件は、使用するタンパク分解酵素の種類に依存する。ペプシンを使用するプロテアーゼ処理は、通常、1.5~5、好ましくは2~4のpH、及び、通常、10~60°C、好ましくは15~45°C、より好ましくは20~40°Cの温度の下で、通常、1分間~24時間、好ましくは1分間~180分間、より好ましくは2分間~120分間、さらに好ましくは2分間~60分間行われる。パパインを使用するプロテアーゼ処理は、通常、3~10、好ましくは5~8のpH、及び、通常、20~80°C、好ましくは20~45°C、より好ましくは20~40°Cの温度の下で、通常、1分間~24時間、好ましくは1分間~180分間、より好ましくは2分間~120分間、さらに好ましくは2分間~60分間行われる。アクチナーゼEを使用するプロテアーゼ処理は、通常、7~10、好ましくは7~8.5のpH、及び、通常、10~50°C、好ましくは20~45°C、より好ましくは20~40°Cの温度の下で、通常、1分間~24時間、好ましくは1分間~180分間、より好ましくは2分間~120分間、さらに好ましくは2分間~60分間行われる。添加等の適宜の手段で酵素反応を停止させる。分離手段によって、上清と固体残渣とに分離してもよい。[0037]上記プロテアーゼ処理された糖タンパク質に、前記糖タンパク質の有する糖鎖と親和性を有する糖結合化合物を作用させて、該糖タンパク質と該糖結合化合物との反応物を得る。[0038]前記プロテアーゼ処理された糖タンパク質と糖結合化合物との反応時に、糖タンパク質あるいは糖結合化合物を必ずしも固定化する必要はないが、固定化する方が好ましい。糖タンパク質を固定化するための担体は、例えばガラス、ポリエチレン、ポリプロピレン、ポリ酢酸ビニル、ポリ塩化ビニル、ポリメタクリレート、ラテックス、アガロース、セルロース、デキストラン、デンプン、デキストリン、シリカゲル、多孔性セラミックス等の素材できたビーズ、ディスク、スティック、チューブ、マイクロタイタープレート、マイクロセンサーチップ、マイクロアレイ等が挙げられる。汎用の方法を特に制限なく使用可能である。[0040]前記糖タンパク質は、その抗体を介して担体に固定化されていてもよい。抗体は、抗体分子自体でよく、また、抗体を酵素処理して得られるFab、Fab’、F(ab’)2等の抗原認識部位を含む活性フラグメントでもよい。[0041]抗体の由来は限定されない。抗体には、ヒト、マウス、ウサギ等の哺乳動物に抗原としての糖タンパク質を免疫することにより得られる抗血清や腹水液、並びにこれらを塩析、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、電気泳動、アフィニティークロマトグラフィー等の汎用の方法で精製したポリクローナル抗体が含まれる。抗体には、ヒトや動物の血清等から調製したタンパク質で免疫されたマウスの抗体産生リンパ細胞とミエローマ細胞とを融合させることによって、該糖タンパク質を認識するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、次いで該ハイブリドーマ又はそれに由来する細胞株を培養し、その培養物から採取されるモノクローナル抗体が含まれる。汎用の糖タンパク質については、その抗体が試薬として販売されており、本発明ではそれらを制限なく使用可能である。[0042]上記の抗体等が糖結合化合物と反応する糖鎖を有する場合は、適宜、抗体から糖鎖を除去する。糖結合化合物と反応する糖鎖を持たない抗体を取得するには、モノクローナル抗体をノイラミニダーゼ、β-ガラクトシダーゼ、N-グリカナーゼ等の糖鎖分解酵素で処理する、抗体のFc部をペプシン、パパイン等のタンパク質分解酵素により限定加水分解する、過ヨウ素酸水溶液で糖鎖構造を酸化分解する、ハイブリドーマ又はハイブリドーマ由来の動物細胞の培地に糖鎖合成阻害剤を添加して培養する方法が挙げられる。汎用の方法を特に制限なく使用可能である。糖タンパク質に対する抗体(例えば抗トランスフェリン抗体)の溶液を担体に添加することにより、担体に抗体を結合させる。[0044]抗体の結合した担体に糖タンパク質の溶液を添加することにより、糖タンパク質を抗原-抗体反応で結合させる。[0045]本発明で使用する糖結合化合物は、糖タンパク質が有する糖鎖と親和性を有する化合物を意味する。使用する糖結合化合物は、糖タンパク質に結合する糖鎖に依存して、適宜、選択される。[0046]前記糖結合化合物は、例えば糖に結合するタンパク質(ペプチドを含む)、並びに糖に結合するDNA、RNA等の核酸である。好ましくは糖結合タンパク質であり、より好ましくはレクチン及び抗糖鎖抗体であり、さらに好ましくはレクチンである。[0048]前記糖結合化合物は、一種単独でもよく、または二種の併用でもよい。[0049]前記レクチンの親和性を、赤血球凝集を阻害する糖の最小阻害濃度で表すと、通常100mM以下、好ましくは10mM以下である。最小阻害濃度とは、糖が凝集反応を阻止するために要する最小濃度を意味する。特許文献1(特許4514163)に記載されている方法で行うことができる。特許4514163を参照のためにここに編入する。[0050]前記レクチンは、天然由来レクチン、若しくは化学合成又は遺伝子工学的合成により得られるレクチンのいずれでもよい。天然レクチンの由来は、植物、動物及び菌類のいずれでもよい。以下に、本発明に使用可能な天然レクチンの例を示す。[0051]ガラクトース(Gal)/N-アセチルガラクトサミン(GalNAc)に親和性を有するレクチンの例には、マッシュルームレクチン(ABA)、ドリコスマメレクチン(DBA)、デイゴマメレクチン(ECA)、インゲンマメレクチン(PHA-E4、PHA-P)、ピーナッツレクチン(PNA)、ダイズレクチン(SBA)、ムラサキモクワンジュレクチン(BPL)、ヒマレクチン(RCA120)が挙げられる。マンノース(Man)/グルコース(Glc)に親和性を有するレクチンの例には、コンカナバリンA(ConA)、レンズマメレクチン(LCA、LCA-A)、及びエンドウマメレクチン(PSA)が挙げられる。フコース(Fuc)に親和性を有するレクチンの例には、ヒイロチャワンタケレクチン(AAL)、レンズマメレクチン(LCA、LCA-A)、ロータスレクチン(Lotus)、エンドウマメレクチン(PSA)、ハリエニシダレクチン(UEA-I)、ミヤコグサレクチン(LTA)、ラッパスイセンレクチン(NPA)、ソラマメレクチン(VFA)、麹菌レクチン(AOL)、スギタケレクチン(PhoSL)、ツチスギタケレクチン(PTL)、サケツバタケレクチン(SRL)、クリタケレクチン(NSL)、コムラサキシメジレクチン(LSL)、ベニテングタケレクチン(AML)が挙げられる。このうち、PhoSL、PTL、SRL、NSL、LSL及びAMLは、α1→6フコースに特異的に結合するので、α1→6フコースの付加又は欠如が疾患と関連する糖タンパク質の検出に有利である。N-アセチルグルコサミン(GlcNAc)に親和性を有するレクチンの例には、チョウセンアサガオレクチン(DSA)、アメリカヤマゴボウレクチン(PWM)、小麦胚芽レクチン(WGA)、バンデリアマメレクチン-II(GSL-II)、ムジナタケレクチン(PVL)が挙げられる。シアル酸(Sia)に親和性を有するレクチンの例には、イヌエンジュレクチン(MAM)、ニホンニワトコレクチン(SSA)、小麦胚芽レクチン(WGA)、ヤナギマツタケレクチン(ACG)、キカラスウリレクチン(TJA-I)、ムジナタケレクチン(PVL)、西洋ニワトコレクチン(SNA-I)等が挙げられる。[0052]糖結合化合物は、検出可能とするために、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。糖結合化合物は、糖結合化合物と反応するプローブ(例えば抗レクチン抗体のような糖結合化合物と結合する抗体)を介して検出してもよい。その際、プローブは、当分野で公知の標識手段で標識されていることが好ましい。糖結合化合物を検出するプローブは、一種単独、又は二種以上の併用でもよい。14C等の放射性物質、金ゾル、銀ゾル、白金ゾル等の金属コロイド、顔料で着色されたポリスチレンラッテクス等の合成ラテックス、ビオチンやジゴキシゲニンを挙げることができる。[0054]標識手段が酵素の場合、酵素活性を測定するために発色基質が用いられる。2アンモニウム塩、5-アミノサリチル酸、又はo-フェニレンジアミン(OPD)、アルカリホスファターゼの基質としてはp-ニトロフェニルホスフェート(PNPP)又は4-メチルウンベリフェリルホスフェート、そしてβ-D-ガラクトシダーゼの基質としてはo-ニトロフェノール-β-D-ガラクトピラノシドを挙げることができる。前記糖結合化合物を検出するプローブへ結合することができる。標識をストレプトアビジン(又はアビジン)-ビオチン系を介して結合することは、感度が高くなる点で好ましい。[0056]適宜、固定化された糖タンパク質と糖結合化合物とを反応させるために、糖結合化合物を含む溶液に糖タンパク質を曝す。タンパク質と糖結合化合物との反応物を検出する。糖タンパク質と糖結合化合物との反応物の検出方法は、特に限定されず、当業者に周知の方法で使用することができる。検出方法の例としては、レクチンELISA(直接吸着法、サンドイッチ法)、レクチンアフィニティクロマトグラフィー(例えばHPLC-レクチンカラムを使用)、レクチン親和電気泳動、レクチン染色のように酵素等の発色や発光、蛍光を検出する方法、糖鎖アレイ、レクチンアレイのようにエバネッセント波を検出する方法、水晶発振子マイクロバランス法や表面プラズモン共鳴法のように質量変化を検出する方法等を挙げることができる。多段階法で同時に測定できるので利便である。[0058]標識した糖結合化合物の標識物量(吸光度等)等で表わした糖鎖量は、標準試料のものと対比することによって、その変化を察知することができる。測定結果は糖タンパク質に付加した特定の糖鎖量の変化を反映することになる。糖タンパク質の糖鎖量を健常者と患者との間で比較することにより、糖鎖変化に関連する疾患を従来よりも高い精度で診断できる。[0059]糖残基量の変化率(糖付加や糖欠損の度合い)を定量化することは、糖鎖変化と関連する疾患の診断、治療及び予防、研究等に大いに役立つ。糖の付加率を求めるには、予め、糖鎖末端の全位置に目的とする糖残基が付加した参照試料(例えば、健常者の糖タンパク質や市販又は合成した試薬)の全糖残基量を本発明の検出方法で測定する。糖残基量を、標識した検出糖結合化合物の標識物量(吸光度等)で表わす。未知試料の糖残基量を本発明の検出方法で測定する。未知試料で測定された糖残基量を全糖残基量で除した値が糖付加率となる。糖付加率を1から減じたものが糖欠損率となる。[0060]糖鎖量の変化率は、測定試料の糖タンパク質量に対する糖鎖量の比で表してもよい。ブラッドフォード法、ローリー法等で求めておく。[0061]糖付加率又は糖欠損率の導出に検量線を使用することは、測定作業の効率化の点で有利である。目的糖残基量が既知で、糖残基量の異なる複数の標準試料を、本発明の検出方法で測定し、目的糖残基量と検出糖結合化合物の標識物量(吸光度等)との関係を求め、検量線を作成しておく。目的糖残基量が未知の試料の標識物量(吸光度等)を本発明の検出方法で求め、標識物量を前記検量線に当てはめる。[0062]いくつかの代表的な検出方法を、以下に概説する。ELISA(直接吸着法)では、糖タンパク質を含む血清等の検体をELISAプレートに添加して固定化する(検体反応)。ビオチン標識したレクチンを添加して、糖鎖とレクチンとを反応させる(レクチン反応、1次反応)。2次標識化合物としてHRP標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる(プローブ反応、2次反応)。HRP用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。既知の濃度の糖鎖を含む標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。[0063]ELISA(サンドイッチ法)では、糖タンパク質(抗原)に結合する抗体をELISAプレートに添加し抗体をプレートに固定化する。糖タンパク質を含む検体(血清等)を添加して、前記抗体と糖タンパク質とを反応させる(検体反応)。ビオチン標識したレクチンを添加して、糖鎖とレクチンとを反応させる(レクチン反応)。2次プローブとしてHRP標識ストレプトアビジン溶液を添加して、ビオチンとストレプトアビジンとを反応させる(プローブ反応)。HRP用発色基質を加えて発色させ、発色強度を吸光光度計で測定する。既知の濃度の標準試料によって検量線を作成しておけば、糖鎖の定量化も可能である。[0064]本発明の方法によれば、糖タンパク質の検出感度が向上するので、糖鎖変化と関連する疾患の診断精度の向上に寄与する。ガラクトース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、慢性関節リウマチ、肝癌、骨髄腫等がある。マンノース残基が診断の指標となり得る疾患の例としては、直腸癌等がある。