実施例[0065]以下に本発明の実施例を示して、本発明をより詳細に説明する。本発明は、以下の実施例に限定されるものではない。[0066]本発明に使用する試薬を、以下の手順で調製又は用意した。(PBS)〕リン酸水素二ナトリウム(和光純薬工業(株)製)5.75g、リン酸二水素カリウム(和光純薬工業(株)製)1.0g、塩化カリウム(和光純薬工業(株)製)1.0g、塩化ナトリウム(和光純薬工業(株)製)40.0gを秤量し、水で5Lにメスアップした。Tween/PBSという)を得た。75.07gを、水900mL程度に溶解し、6N塩酸を添加してpHメーターでpH3.0に合わせ、さらに水で1000mLにメスアップした。上記グリシン37.54gを、水900mL程度に溶解し、6N塩酸を添加しpHメーターでpH3.3に合わせ、水で1000mLにメスアップした。60.6gを、水400mL程度に溶解し、6N塩酸を添加しpHメーターでpH9.0に合わせ、水で500mLにメスアップした。塩酸を添加しpHメーターでpH9.0に合わせ、水で500mLにメスアップした。塩化カルシウム(和光純薬工業(株))0.74gを5mLチューブに量り取り、水5mLで溶解して1M塩化カルシウム水溶液を得た。上記トリスヒドロキシメチルアミノメタンを12.11g量り取り、水80mLで溶解後、6N塩酸溶液を加えてpHを7.8に調整し、さらに水で液量100mLまでメスアップして、1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.8)を得た。1M塩化カルシウム水溶液と1Mトリス塩酸緩衝液(pH7.8)から10mM塩化カルシウム/100mMトリス塩酸緩衝液(pH7.8)を調製した。以下の糖タンパク質を、それぞれ、濃度2mg/mLになるように水に溶解して糖タンパク質溶液を得た。αフェトプロテイン-L3(AFP-L3):非特許文献1に記載の方法に準じて調製した。以下に示すプロテアーゼ溶液を調製した。グリシン塩酸緩衝液(pH3.0)で0.1mg/mL(0.01質量%)になるように溶解した。リン酸緩衝液、pH6.5)で濃度2mg/mL(0.2質量%)になるように溶解した。〔アクチナーゼE〕アクチナーゼE(科研製薬製、コードNo.90002-1611)を、10mM塩化カルシウム/100mMトリス塩酸緩衝液(pH7.8)で、濃度10mg/mL(1質量%)になるように溶解した。PMSF溶液を調製した。PMSF溶液を調製した。BSA/PBSウシ血清アルブミン(BSA、シグマ・アルドリッチ製)1gを100mLのPBSに溶解して、BSAのPBS溶液(BSA濃度1%)を調製した。レクチン表1に示すレクチンを用意した。α1-6フコース特異的レクチンであるPhoSLを、非特許文献1に記載の方法に従ってスギタケから精製した。PhoSLの合成ペプチドの一種である合成PhoSLペプチド(配列番号1)を非特許文献1に記載の方法に従って合成した。麹菌レクチン(AOL)は、東京化成工業(株)から入手した。西洋ニワトコレクチン(SNA-I)、ニガウリレクチン(MCL)、及びチューリップレクチン(TxLC-I)は、それぞれ、非特許文献2~4の方法で精製した。上記レクチンを非特許文献1に記載の方法に準じてビオチン標識化した。ビオチン標識化ヒイロチャワンタケレクチン(AAL)、ビオチン標識化レンズマメレクチン(LCA)、ビオチン標識化エンドウマメレクチン(PSA)、ビオチン標識化タチナタマメレクチン(ConA)、ビオチン標識化日本ニワトコレクチン(SSA)、ビオチン標識化ヒマレクチン(RCA120)、ビオチン標識化デイゴマメレクチン(ECA)、及びビオチン標識化インゲンマメレクチン(PHA-E4)は、J-オイルミルズ製のビオチン標識化レクチンを使用した。すべてのビオチン標識化レクチンは、PBSで濃度1mg/mLに調製し、使用の際、適切な濃度に希釈した。[0078]糖タンパク質のペプシン処理の手順を、以下に示す。濃度2mg/mLの糖タンパク質溶液25質量部に、1Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)を25質量部加えた。1Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.0))を、(1)の1質量部添加して、撹拌後、37°Cで静置した。(3)反応停止ペプシン反応5~30分間処理した後、25質量部の1Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)と混合し反応を停止させた。これらの試料をペプシン処理後の糖タンパク質溶液とした。[0079]糖タンパク質のアクチナーゼE処理の手順を、AFP―L3を例に以下に示す。トリス塩酸緩衝液(pH7.8)で濃度0.00125質量%になるまで希釈した。この希釈液42μLと濃度8mg/mLのAFP-L3水溶液70μLとを混合し、37°Cの温度で30分間、保温した。14μLと混合してタンパク質分解反応を停止し、アクチナーゼE処理AFP-L3の溶液を得た。[0080]糖タンパク質のパパイン処理の手順を、AFP―L3を例に以下に示す。(1)酵素反応6mg/mL(水に溶解)のAFP-L3溶液5μLに対して、2mg/mLのパパイン溶液を5μL添加(終濃度1mg/mL)し、37°Cで保温した。(2)反応停止パパイン溶液添加から30分後に、濃度10μg/mLのアンチパイン(シグマ・アルドリッチ製)2μLと混合して反応を停止させ、パパイン処理後のAFP溶液とした。[0081]レクチンELISA(サンドイッチ法)の手順を以下に示す。1に記載の方法に準じて糖鎖除去した固相化抗体をPBSで5μg/mLに希釈し、96穴マイクロタイタープレート(グライナー社製)のウェルに50μL添加して4°Cで16時間放置後、添加した液を廃棄した。Tween/PBSを250μL添加し、添加した液を廃棄した。(3)ブロッキングウェルにBSA/PBSを200μL添加して、37°Cで1時間放置後、添加した液を廃棄した。Tween/PBSを250μL添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計3回繰り返した。50μLをウェルに添加して、室温で1時間放置後、添加した液を廃棄した。Tween/PBSを250μL添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計3回繰り返した。PBS)を、適切な濃度になるように、BSA/PBS溶液で希釈した。このレクチン溶液50μLをウェルに添加して、4°Cで30分間放置後、添加した液を廃棄した。Tween/PBSを250μL添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計3回繰り返した。(9)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン反応1mg/mLのHRP標識ストレプトアビジン(フナコシ(株)製)をBSA/PBSで希釈した(1μg/mL)。これをウェルに50μL添加して、室温で30分間放置後、添加した液を廃棄した。Tween/PBSを250μL添加し、添加した液を廃棄した。この操作を合計3回繰り返した。Substrate、フナコシ(株)製)を、ウェルに50μL添加し、室温で5分間放置した。(12)反応停止1Mリン酸を50μL添加し、反応を停止した。[0082]プレートリーダー(製品名:POWERSCAN(登録商標)HT、バイオテック(株)製)を用いて、波長450nm及び630nmの吸光度を測定した。450nmの吸光度値から630nmの吸光度値を引いた値を検出値(シグナル:S)とした。糖タンパク質未添加の検出値(ノイズ:N)を、糖タンパク質添加の検出値(S)から引いた値を反応値(S-N)とした。[0083]式(1)に示すように、プロテアーゼ処理での反応値(S-N)pから、プロテアーゼ未処理での反応値(S-N)npを減じた値を増大量Δとした。フコース、シアル酸、ガラクトース、マンノース、グルコース等に親和性を有するレクチンによるペプシン処理AFP-L3の検出(I)糖タンパク質AFP-L3を30分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理AFP-L3をレクチンELISA(サンドイッチ法)により検出した。検出試験は、以下の点を除き、上記したサンドイッチELISA法と同様の操作を行った。(1)抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトAFPモノクローナル抗体(マウス)(フナコシ(株)製)を使用した。(5)抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液として、ペプシン処理AFP-L3(5,000ng/mL)及び未処理AFP-L3(5,000ng/mL)を使用した。(7)レクチン反応では、表1に記載のビオチン標識化レクチンを使用し、また、レクチンの代わりに1μg/mLの抗AFP抗体(ダコ・ジャパン製)を使用した。(9)HRP標識ストレプトアビジン反応では、(7)でレクチン反応の代わりに抗AFP抗体を使用した場合には、HRP標識ストレプトアビジンに替えて、HRP標識化抗ウサギIgG抗体溶液(フナコシ(株)製)をBSA/PBSで0.5μg/mLとしたものを使用した。[0085]ペプシン処理AFP-L3及び未処理AFP-L3のレクチン又は抗体に対する反応値(S-N)及び増大量Δを表1に示す。[0086][表1][0087]すべての実施例において、プロテアーゼ処理したAFP-L3のレクチンとの反応値は、プロテアーゼ未処理のAFP-L3とレクチンとの反応値よりも増大した。抗体を用いた比較例1では、反応値は、プロテアーゼ処理によって増大しなかった。このことから、プロテアーゼ処理された糖タンパク質AFP-L3とレクチンとの反応値の増大(すなわち、糖タンパク質の検出感度の向上)は、糖タンパク質の固相抗体への結合量の増大が原因ではないことが確認された。糖タンパク質AFPを30分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理AFPをレクチンELISA(サンドイッチ法)により検出した。検出試験は、実施例7~13及び比較例1において、糖タンパク質をAFP-L3からAFPに代えた以外は前記実施例又は比較例と同様の手順で行った。ペプシン処理AFP及び未処理AFPの各レクチンに対する反応値(S-N)及び増大量Δを表2に示す。[0089][表2][0090]表2を見ると、すべての実施例において、プロテアーゼ処理したAFPのレクチンとの反応値は、プロテアーゼ未処理のAFPとレクチンとの反応値よりも増大した。抗体を用いた比較例2では、反応値は、プロテアーゼ処理によって増大しなかった。このことから、プロテアーゼ処理による糖タンパク質とレクチンとの反応値の増大、すなわち、糖タンパク質の検出感度の向上は、糖タンパク質の固相抗体へのAFP結合量の増大が原因ではないことが確認された。実施例1において、糖タンパク質のプロテアーゼ処理をペプシン処理からアクチナーゼE処理に変更した。具体的には、実施例1において、以下の点を除き、同様の操作を行った。(5)抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてアクチナーゼE処理後のAFP-L3(400ng/mL)、及び未処理のAFP-L3(400ng/mL)を使用した。(7)レクチン反応では、ビオチン標識化PhoSL(0.5μg/mL)を使用した。[0092]プロテアーゼ処理AFP-L3及び未処理AFP-L3のレクチン反応値(S-N)、及び、プロテアーゼ処理による反応値の増大量Δを、表3に示す。[表3][0093]表3から、プロテアーゼ処理にペプシンと異なるタンパク質分解酵素であるアクチナーゼEを用いても、プロテアーゼ処理により、AFP-L3とレクチンの反応値が増大することがわかった。実施例1において、糖タンパク質のプロテアーゼ処理をペプシン処理からパパイン処理に変更した。具体的には、実施例1において、以下の点を除き、同様の操作を行った。(1)抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトAFPモノクローナル抗体(マウス)(フナコシ(株)製)を使用した。(5)抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてパパイン処理後のAFP-L3(1000ng/mL)及び未処理のAFP-L3(1000ng/mL)を使用した。(7)レクチン反応では、ビオチン標識化PhoSL(0.5μg/mL)を使用した。[0095]プロテアーゼ処理AFP-L3及び未処理AFP-L3のレクチン反応値(S-N)、及び、プロテアーゼ処理による反応値の増大量Δを、表4に示す。[表4][0096]表4から、プロテアーゼ処理にペプシンと異なるタンパク質分解酵素であるパパインを用いても、プロテアーゼ処理により、AFP-L3とレクチンの反応値が増大することがわかった。糖タンパク質TFを5分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理TFをレクチンELISA(サンドイッチ法)により検出した。検出試験は、以下の点を除き、上記したサンドイッチELISA法と同様の操作を行った。(1)抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体(ウサギ)(フナコシ(株)製)を使用した。(5)抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のTF溶液(1μg/mL)及び未処理のTF溶液(1μg/mL)を使用した。(7)レクチン反応では、表1に記載のビオチン標識化SSA(1μg/mL)を使用した。レクチンの代わりに0.2μg/mLの抗ヒトトランスフェリンポリクローナル抗体(マウス)(コスモ・バイオ(株)製)を使用した。(9)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン反応では、(7)でレクチン反応の代わりに抗TF抗体を使用した場合には、HRP標識ストレプトアビジンに替えて、HRP標識化抗マウスIgG抗体溶液(インビトロジェン製)をBSA/PBSで0.5μg/mLとしたものを使用した。[0098]ペプシン処理TF及び未処理TFのレクチン又は抗体に対する反応値(S-N)及び増大量Δを表5に示す。[表5][0099]表5から、トランスフェリンをシアル酸特異的レクチンSSAで検出した場合においても、ペプシン処理により反応値を増大させられることがわかった。トランスフェリンを抗TF抗体で検出した場合では、ペプシン処理による反応値の増加はないことから、固相抗体に捕捉されるトランスフェリン量が増えることがレクチン反応値の増大原因ではないことがわかった。糖タンパク質IgGを5分間、ペプシン処理し、得られたペプシン処理IgGをレクチンELISA(サンドイッチ法)により検出した。試験は、上記したサンドイッチELISA法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。(1)抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体(ヤギ)(フナコシ(株)製)を使用した。(5)抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のIgG溶液(1μg/mL)及び未処理のIgG溶液(1μg/mL)を使用した。(7)レクチン反応では、ビオチン標識化PhoSL及びビオチン標識化AAL(いずれも1μg/mL)を使用した。レクチンの代わりに、0.2μg/mLの抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体(ヤギ)を使用した。(9)西洋ワサビペルオキシダーゼ(HRP)標識ストレプトアビジン反応では、(7)でレクチン反応の代わりに抗ヒト免疫グロブリンポリクローナル抗体(ヤギ)を使用した場合には、HRP標識ストレプトアビジンに替えて、HRP標識化抗ヤギIgG抗体溶液(コスモ・バイオ(株)製)をBSA/PBSで0.5μg/mLとしたものを使用した。[0101]ペプシン処理IgG及び未処理IgGのレクチン又は抗体に対する反応値(S-N)及び増大量Δを表6に示す。[表6][0102]表6から、IgGをフコース特異的レクチンであるPhoSL又はAALで検出した場合においても、ペプシン処理により反応値を増大できることがわかった。IgGを抗IgG抗体で検出した場合では、ペプシン処理による反応値の増加はないことから、固相抗体に捕捉されるIgG量が増えることがレクチン反応値の増大原因ではないことがわかった。フコース又はシアル酸に親和性を有するレクチンによるペプシン処理AFP-L3の検出(II)AFP-L3を添加した血清を用いて、ペプシン処理を行い、サンドイッチELISA法によりAFP-L3の検出試験を行った。AFP-L3の血清溶液のペプシン処理手順を、以下に示す。(1)AFP-L3溶液の調製ヒトプール血清(100%血清、(株)ケー・エー・シー製)992μL、及びこの100%血清をPBSで10倍希釈した10%血清992μLに、それぞれ、50μg/mLのAFL-L3溶液8μLを添加し、AFP-L3/100%血清、及びAFP-L3/10%血清を調製した(いずれもAFP-L3濃度:400ng/mL)。(2)ペプシン反応AFP-L3/100%血清55μLには、400μg/mLのペプシン/1Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)を22μL添加して、撹拌後、25°Cで静置した。AFP-L3/10%血清55μLには、10μg/mLのペプシン/1Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.0)を22μL添加して、撹拌後、25°Cで静置した。(3)反応停止ペプシン溶液添加30分後、それぞれ、0.33Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を33μL添加し、反応を停止させ、ペプシン処理後のAFP-L3/100%血清及びペプシン処理後のAFP-L3/10%血清を得た。[0104]レクチンによる検出試験は、上記したサンドイッチELISA法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。(1)抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトAFPモノクローナル抗体(マウス)(フナコシ(株)製)を使用した。(5)抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液としてペプシン処理後のAFP-L3/100%血清、ペプシン処理後のAFP-L3/10%血清、未処理のAFP-L3/100%血清、及び未処理のAFP-L3/10%血清を使用した(いずれもAFP-L3濃度:0.2μg/mL)。(7)レクチン反応では、ビオチン標識化PhoSL、ビオチン標識化AAL、ビオチン標識化SNA-I、ビオチン標識化SSA(いずれも0.5μg/mL)を使用した。未処理AFP-L3/100%血清及び未処理AFP-L3/10%血清のレクチンに対する反応値(S-N)及び増大量Δを表7に示す。[表7][0106]表7から、血清存在下、フコース特異的レクチンPhoSL又はAALでAFP-L3を検出した場合であっても、ペプシン処理により反応値を増大できることがわかった。表7から、シアル酸特異的レクチンSNA-I又はSSAで検出した場合も同様に、ペプシン処理により反応値を増大できることが確認された。したがって、ヒト血清中の糖タンパク質においても、反応値を増大できることが確認できた。フコースに親和性を有するレクチンによるペプシン処理AFP-L3の検出(III)AFP-L3を添加した血清のペプシン処理を、時間を変えて行い、各処理サンプルについてサンドイッチELISA法によりAFP-L3の検出試験を行った。ng/mL)をペプシン処理手順において、ペプシン添加後反応を停止するまでの時間を、30分間から5、10、15、30、45又は60分間に変えた以外は、実施例31と同様に行った。[0108]レクチンによる検出試験は、実施例31と同様の操作で行った。[0109]ペプシン処理AFP-L3/100%血清及び未処理AFP-L3/100%血清のレクチンに対する反応値(S-N)及び増大量Δを表8に示す。[表8][0110]表8から、ペプシン処理5分後、反応値の増大量が0.241まで増大した。ペプシン処理10~60分間での増大量は、0.331~0.364であり、ほぼ一定であった。増大効果は、反応時間が5分間から少なくとも60分間までで得られることがわかった。糖タンパク質にAFP-L3を用いてペプシン処理を30分間行い、HPLC-PhoSLカラムによりペプシン処理AFP-L3の結合試験を行った。その具体的手順を以下に示す。活性化ハードゲル((株)J-オイルミルズ製)にPhoSLを添付マニュアルに従って固定化後、ステンレスカラム(150mm×4.6mmI.D.)に充填した。(50mM酢酸アンモニウム):1M酢酸アンモニウム(和光純薬(株)製)50mLを水で1000mLにメスアップした。緩衝液B(0.2Nアンモニア):25%アンモニア水溶液(シグマ・アルドリッチ製)7.55mLを水で500mLにメスアップした。LC-8020、ポンプ:DP-8020、いずれも(株)東ソー社製)を用いて、ペプシン処理AFP-L3又はペプシン未処理AFP-L3を、緩衝液Aで10倍希釈したものを100μLインジェクトした。緩衝液Aを10分間流し、非吸着ピークを得た後、緩衝液Bを10分間流し、吸着溶出ピークを得た。流速は0.5mL/min、検出は、UV280nm(UV-2080、(株)東ソー社製)とした。[0114]未処理、ペプシン処理AFP-L3をHPLC-PhoSLで分析したときの、非吸着ピークエリアの面積及び吸着溶出ピークエリアの面積を測定した。結合率を以下の式に従って計算した。AFP-L3のHPLC-PhoSLによる非吸着ピーク面積、吸着溶出ピーク面積及び結合率(%)を、表9に示す。[表9][0116]表9から、ペプシン処理AFP-L3のHPLC-PhoSLによる検出値(結合率)は、未処理のものより増大することがわかった。フコースに親和性を有するレクチンによるペプシン処理AFP-L3の検出(IV)AFP-L3を添加した血清のペプシン処理を、ペプシン濃度と時間を変えて行い、各処理サンプルについてサンドイッチELISA法によりAFP-L3の検出試験を行った。ペプシン処理は、以下のように行った。[0118](1)AFP-L3溶液の調製ヒトプール血清に、AFP-L3溶液を添加し、AFP-L3/100%血清(AFP-L3濃度:200ng/mL)を調製した。90.08gを、水900mL程度に溶解し、6N塩酸を添加してpHメーターでpH3.25に合わせ、さらに水で1000mLにメスアップした。〔0.1%BSA/1.2Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.25)〕ウシ血清アルブミン(BSA、シグマ・アルドリッチ製)0.1gを100mLの1.2Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.25)に溶解して調製した。上記AFP-L3/100%血清60μLに、ペプシンを0.1%BSA/1.2Mグリシン塩酸緩衝液(pH3.25)に溶解したもの(0.47~1.1mg/mL)を30μL添加して、撹拌後、25°Cで静置した。(4)反応停止5、7、9、11、13又は15分後、0.33Mトリス塩酸緩衝液(pH9.0)を30μL添加し、反応を停止させた。[0119]レクチンによる検出試験は、上記したサンドイッチELISA法において、以下の点を除き、同様の操作を行った。(1)抗体固定化において、固相化抗体に抗ヒトAFPモノクローナル抗体(マウス)(フナコシ(株)製)を使用した。(5)抗原抗体反応において、糖タンパク質溶液として、上記ペプシン処理後のAFP-L3/100%血清及び未処理のAFP-L3/100%血清を使用した(いずれもAFP-L3濃度:0.1μg/mL)。(7)レクチン反応では、ビオチン標識化PhoSL(0.5μg/mL)を使用した。[0120]ペプシン処理AFP-L3/100%血清及び未処理AFP-L3/100%血清のレクチンに対する検出値を、表10に示す。[0121][表10][0122]表10で示したように、ペプシンの濃度を変えることで、短時間でも十分に反応値を高められることがわかった。前記反応物を検出する工程を含む、前記糖タンパク質の検出方法。[請求項2]前記プロテアーゼ処理が、ペプシン処理、パパイン処理又はアクチナーゼ処理であることを特徴とする、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。[請求項3]前記試料が血清であることを特徴とする、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。[請求項4]前記糖結合化合物が、糖結合タンパク質である、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。[請求項5]前記糖結合化合物が、フコース、シアル酸、マンノース、グルコース、ガラクトース、N-アセチルグルコサミン及びN-アセチルガラクトサミンからなる群から選ばれる少なくとも一種に親和性を有することを特徴とする、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。[請求項6]前記糖タンパク質は、担体に固定化されている、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。[請求項7]前記糖タンパク質は、その抗体を介して前記担体に固定化されている、請求項6に記載の糖タンパク質の検出方法。/又は前記糖結合化合物を検出するプローブが、標識されている、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。[請求項9]前記糖鎖が、複合型糖鎖、高マンノース型糖鎖、又はO結合型糖鎖である、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。チログロブリン、フェツイン、及びアシアロフェツインからなる群から選ばれる、請求項1に記載の糖タンパク質の検出方法。