2020-02-07.中山大学の研究チームが、ほとんどの細胞型で高発現し、細胞系譜追跡のバーコーディングに利用可能なサイト78ヶ所を同定し、バーコーディング用の配列の外部からの導入を不要にした。これらのサイトを通常のscRNA-seqのプラットフォームで分析することで細胞型と細胞系譜関連データの同時獲得を実現。(XRN1)によって、そのオーバハングが処理されることで、Cas9の触媒活性が維持されることを同定;XRN1は成熟型sgRNAsの5'末端はプロセスしない。ゆえにこれまで多大な手間、時間および経費を要していたライグラスの品種改良を、CRISPR/Cas9により効率化することが可能なことを示した。tracing)マウスを樹立した。10組とCAG配下にEGFPとsgRNAsの標的になるアレイを配したコンストラクトを、導入する。アレイは、13-bpの保存領域、10種類のsgRNAsのターゲットとなる7-bp領域および3-bpのPAMと4-bpのリンカーからなる。このアレイをCARLINアレイと称するCARLINアレイとは別に、リバーステトラサイクリン調節性トランス活性化因子(M2-rtTA)を、ES細胞のセーフ・ハーバー領域Rosa26遺伝子座に導入する。して作出したES細胞において、DoxでCas9の発現を誘導するごとに、CARLINアレイに、Cas9による二本鎖DNA切断からのエラーが起きやすいNHEJ修復過程を経て、極めて多様な変異が刻まれていくこと、および、Cas9発現のレベルと期間によって、変異の様相が変わることを確認した。CARLINマウスCARLINアレイ/Col1a1を導入したES細胞由来マウスと、tetO-Cas9/Col1a1とrtTA/Rosa26を導入したES細胞由来マウスを交配することで、CARLINマウスを作出し、シングルセル・ドロップレット・シーケンシングを介して44,000種類までのCARLINアレルの読み取りを実現した。CARLINマウスにおいて、造血幹細胞の分化の過程と5-FUによる損傷からの修復の過程それぞれにおけるクローンの動態について新たな知見を得るに至った。(CHYRON)が加わった。recorder)を実現する。RNA)法にしても、Cas9がランダムに誘導する挿入欠失変異を前提として設計されたが、主として欠失変異に依存することになる。単一遺伝子座に発生する欠失は、それまでに生じた挿入変異および欠失変異を損なうリスクを伴い、また、欠失の累積自身にも限界がある。Irvineの研究グループは挿入変異に基づくCHYRONの開発に着手した。第4項目)、および、DNA書き込み因子で構成されている。bps)が刻み込まれていく。(ここでは、CHYRON遺伝子座)に、細胞状態の遷移に応じた挿入変異が、順次、刻み込まれる。して累積された挿入変異のNGS解析から、細胞に起こった事象を遡及することが可能になる。bits)になることを同定した。M細胞集団16種類のNGS解析から、配列類似性と階層的クラスタリングにより、分割過程を完全に再現することに成功した。研究グループは、挿入変異の長さから、細胞に酸素ストレスのレベルと時期を遡及的に同定可能なことも示した。期間5種類)に暴露し、レベルと期間に応じて挿入が長くなることを同定した。課題DSBに対するTdTの応答を、CHYRON遺伝子座に限定し、Cas9-hgRNA以外の原因で発生する可能性があるDSBへの応答を抑止する;挿入変異の累積を介したCHYRON遺伝子座伸長によるCas9-hgRNAの活性低下を回避する;欠失変異を完全に抑止する。*1)に準拠し、SpCas9活性の深層学習モデルDeepCas9を構築・公開した。CNN)に基づく深層学習モデルを構築し、542組のSpCas9活性データで検証した。(AID)に変更することで、ウサギにおいて11-ntウインドウ幅におけるC-to-T変換効率が向上することを示した。AIDとBE4maxの組み合わせ[eAID-BE4max*]により、Tyrp.R299H変異におけるGCコンテクストのC-to-T変換効率がBE3による16.67%から83.33%に向上することを示した。よりバイスタンダー変異が抑制されることを示した。CRISPR-Casシステムは、サイクリックオリゴアデニル酸(cOA)を合成した非特異的なRNA分解機能も備えていることが知られており、いくつかのバクテリアとアーケアで分子機構が解析されている*。data)法を開発し、scGSETALTの実験で利用されたゼブラフィッシュの2種類のデータセットにて、その性能を検証した。(細胞機能)と細胞系譜同時に追跡することが可能になった。よるトランスクリプトミクスによって同定することが可能であった。細胞系譜は、CRISPR-Cas9が合成DNAからなる細胞内の'記憶素子'書き込むindels変異を、特定のステージや成体の細胞から読み出すことで、再構築することが可能になった。intBC)、続いてCas9の切断サイト3種類を帯びたDNAを結合した長さ205-bpの合成DNAである。cassette)とを単一のpiggyBacトランスポゾンベクターに組み込む。mRNAならびにRosa26::Cas9:eGFP精子細胞と共に卵母細胞に注入し、その後、胎生期E8.5またはE9.5の胚を解析し、遡及的に再構築した細胞系譜にscRNA-seqからの細胞機能を重ね合わせた。胚形成の過程で分化全能性が徐々に失われていき、互いの距離が近い細胞系譜に由来する細胞の転写プロファイルが似る傾向があることを確認した。一方で、胚体外内胚葉に由来する細胞と胚体内胚葉に由来する細胞が同様の転写プロファイルへと収斂する現象も見出した。