PEG8000非存在下では35分をピークに濁度の減少が見られたのに対して、PEG8000存在下では濁度の減少が見られなかった。このことから、LAMP反応にPEG8000を加えることにより濁度が安定し(すなわち不溶性物質の沈殿が抑制され)、濁度測定(目視による濁度の確認を含む)が容易にできるようになることがわかった。チューブ内の反応溶液を混和した後、チューブ内の濁度変化を経時的に観察した(図2b)。【0056】この結果、PEG8000が入っているチューブ(DNA(+)PEG8000(+))では、混和後2時間経過した後でも溶液の混濁が見られ、24時間後のチューブでもその傾向が見られた。これに対して、PEG8000が入っていないチューブ(DNA(+)PEG8000(−))では、沈殿が見られ溶液が徐々に透明になった。24時間後ではさらに沈殿が進み、溶液は、核酸増幅反応が陰性のチューブ(DNA(−)PEG8000(−))と同程度に、ほぼ透明となった。した後でも濁度測定を容易に行うことができることがわかった。サイバーグリーン等DNA鎖にインターカレートすることにより蛍光を発する試薬を用いる方法や、カルセインのような蛍光標識剤を用いる方法も報告されている。カルセインが含まれたLAMP法用のプレミックスも市販されている(栄研化学株式会社)。当該プレミックスにおける、カルセインを用いて核酸増幅を検出する方法の概要は次の通りである。LAMP反応のための反応溶液に、マンガンイオンと結合したカルセインを含ませておく。マンガンイオンと結合したカルセインは消光している。核酸増幅反応が進むとこのマンガンイオンはピロリン酸イオンによってカルセインから奪われ、ピロリン酸マンガンが生成する。その結果、カルセインはフリーとなり、消光していた蛍光を発するようになる。核酸増幅が起こった場合は、紫外線照射装置を用いて紫外線を照射すれば蛍光が増強されるため、LAMP反応後その蛍光を目視で確認することにより標的核酸配列の有無を確認することができる。悪影響を及ぼさないかを検討した。【0060】まず、PEG8000がEtBrに与える影響について検討した。mg/lの濃度でEtBrを添加し反応を行った。Biosystems社製)を用いて行った。図3aのグラフの縦軸は、蛍光強度(Rn)を表しているが、反応開始前の蛍光強度を「0」にするベースライン補正を行っている(従って「ΔRn」と標記する)。図3aからわかるように、PEG8000存在下でもEtBrの蛍光によるシグナルを検出することができた。PEG8000はEtBrによる増幅測定に影響を及ぼさないことが明らかとなった。LMP221(栄研化学株式会社)を用い、LAMP反応を行ってPEG8000による影響について検討を行った。当該試薬は反応溶液に1μL加えた。【0063】その結果、PEG8000の存在下でもカルセインによるDNA増幅が確認できた(図3b)。この蛍光強度はPEG8000非存在下、増幅したサンプルのものと変わらなかった。このことから、PEG8000はカルセインによる増幅の確認に影響を及ぼさないことが明らかとなった。【0064】<PEG分子量の検討>PEG8000以外の分子量のPEGであっても生成する不溶性物質の安定化に寄与するかを検討するため、PEG8000のかわりにPEG2000、PEG4000、PEG6000、PEG10000、PEG20000、又はPEG500000の5種類のPEGを用いて、上述のようにしてLAMP法により核酸増幅を行い、濁度を測定した。各種PEGの配合割合も変化させて検討した(図4)。その結果、いずれの分子量のPEGであっても、PEG未使用に比べて沈殿の生成が抑制された。PEG4000、PEG6000、PEG10000、PEG20000を用いた場合では、いずれの濃度でもPEG未使用に比べて濁度の低下はほぼ抑えられた(図4)。以上のことから、PEGはその分子量にかかわらず、LAMP反応で生成するピロリン酸マグネシウムが沈殿するのを防止できることがわかった。用いるPEGの分子量は、4000〜500000程度が好ましいこともわかった。【0066】<PEG濃度がLAMPの特異的な増幅に与える影響の検討>LAMP反応溶液にPEG8000の様々な濃度(0%、4.8%、9.6%、14.4%、19.2%)を加え、90分の増幅後、2%アガロースゲル電気泳動を行なった(図5)。この結果、19.2%の濃度でも特異的な増幅が起きていることが確認できた。次に、LAMP反応溶液にPEG4000の様々な濃度(0%、22%、24%、26%)を加え、60分の増幅後、2%アガロースゲル電気泳動を行なった(図6)。この結果、22%の濃度では特異的な増幅が行なわれたが、24%以上では特異的な増幅が起こらないことが確認できた。以上のことから、高濃度のPEGを溶解した反応溶液(すなわち、比較的高粘度の反応溶液)を用いると、LAMP法による特異的な増幅を阻害する場合があることが分かった。【0068】<他の親水性増粘剤の検討>ポリエチレングリコールと同様にニュートニアン性を示す増粘剤としてデキストランが挙げられる。そこで、デキストランにおいても濁度の低下が抑えられるかを検討した。LAMP反応溶液に分子量40000のデキストランを2.4%、4.8%、7.2%となるように、また、分子量60000-90000のデキストランを2.0%、4.0%、6.0%となるようにそれぞれ加えた。測定はLoopampリアルタイム濁度測定装置RT-160Cを使用した。LAMP反応の立ち上がり時間はいずれのデキストランの有無にかかわらずあまり変化がなかった。デキストランは、LAMP反応に影響を及ぼさないことがわかった。見られたのに対して、デキストラン存在下では濁度の低下は見られなかった。以上より、ポリエチレングリコールだけでなくデキストランにおいても濁度の低下を抑制する作用があることがわかった。ついても検討を行った。mMにした以外は、上述と同様に反応を行った。LAMP反応の立ち上がり時間は、いずれのCMC濃度であってもあまり変化がなかった。CMCは、LAMP反応に影響を及ぼさないことがわかった。CMCの存在により濁度低下が抑制されること、抑制効果は濃度依存的に大きくなること、がわかった。以上のことより、濁度の安定化(沈殿の防止)には、反応溶液の粘性を高めることが重要であることがわかった。ニュートニアン性を示す増粘剤であるPEG、デキストラン、又はチキソトロピック性を示す増粘剤であるCMCを反応溶液に加えても核酸増幅反応に悪影響は及ぼさないことがわかった。粘度を回転粘度計によって測定した。当該測定用溶液には、Glycerolが終濃度2%となるように加えた。これを8U(1μL)用いていたため、これと同様の条件となるよう測定用溶液を調整するために加えたものである。マイティーバイアル)。このときの液温は24°Cであった。測定結果を表1に示す。表1を基にグラフを描くと図9、図10になる。【0075】<粘度条件の検討>親水性増粘剤を加えていない反応溶液の粘度は、上記測定条件において回転速度1S−1のとき応力が2.6mPaであった。上記の検討で確認されたように、親水性増粘剤の添加量を増加させることにより不溶性物質の沈殿抑制効果が高まる傾向があるため、回転速度1S−1のとき応力が約2.7mPa以上の反応溶液であれば、反応溶液の濁度低下を抑制する効果が生まれると考えられた。【0076】また、PEG4000を2%の濃度になるように加えた反応溶液は、図4に示した通り、濁度の低下が好ましく抑制されている。具体的には、濁度が最大に達した時点から15分後において、濁度が最大濁度の88%以上を維持している。当該反応溶液は、回転速度1S−1のとき応力が3mPaであった。従って、回転速度1S−1のとき応力が3mPa以上の反応溶液であれば、反応溶液の濁度の低下がより好ましく抑制されると考えられた。【0077】さらに、上述した検討から、PEG4000を22%の濃度になるように加えた反応溶液では特異的な増幅が行なわれ、24%以上では特異的な増幅が起こらないことが分かっている。PEG4000を22%の濃度になるように加えた反応溶液は、回転速度1S−1のとき応力が9.1mPaであった。従って、回転速度1S−1のとき応力が約10mPa以下の反応溶液であれば、核酸増幅反応を阻害する可能性が低いと考えられた。回転速度1S−1のとき応力が9.1mPa以下の反応溶液であれば、核酸増幅反応を阻害することなく反応溶液の濁度の低下がより好ましく抑制されると考えられた。〔配列番号:2〕LAMP反応用プライマー。〔配列番号:3〕LAMP反応用プライマー。〔配列番号:4〕LAMP反応用プライマー。〔配列番号:5〕LAMP反応用プライマー。〔配列番号:6〕LAMP反応用プライマー。〔配列番号:7〕LAMP反応用プライマー。これを用いたジャガイモ加工食品。ekouhou.net。