librarian.Discussion多くの研究が最近、個々のタンパク質やインフルエンザウイルス感染8に関与する細胞のネットワークを識別しているが、これらの相互作用の大部分の機能的意義は不明である。インフルエンザウイルスRNA合成と核9の複雑な生物物理学的および生化学的性質のためにクロマチンベースの関数の絶対的な依存性を考えると、新技術は、これらの機能を解明する必要があります。vRNPsのアフィニティー精製と相まって我々はここで紹介する核内分画は、以前にアクセスできなかった重要なウイルスRNA工場の特性評価を可能にします。多くの細胞内分画のプロトコルは、以前に文献に記載されている。10で説明した現象からvRNPsの早期漏洩につながることを観察した。低Cでプリ膨らんだ細胞の短いインキュベーションを用いて重要な核漏れせずに発生した弱い洗剤、NP-40、効率的な細胞膜溶解のoncentration。興味深いことに、A549およびHEK293T細胞よりもむしろ細胞株の両方でvRNPsの強い核の漏れにつながったHeLa細胞を用いて私たちの細胞下分画を行う。約0.2%NP-40濃度を下げると、この問題を減少させますが、これらの細胞のいくつかの変動により、最適な条件は、経験的に決定する必要があります。別の可能性altermativeは、MDCKやVero細胞などの非ヒトインフルエンザウイルス感受性細胞株の使用です。私たちの塩抽出プロトコルはしばしば低塩濃度および/または高濃度のEDTAを使用する従来のクロマチン抽出手順とは異なります。我々のプロトコルは、2つの特定の画分、ポル·II-high/histone-low分画と​​、その逆数にクロマチンを分離しています。他のクロマチン抽出方法はまた、VRNのアフィニティー精製と互換性があるかもしれpsの。タンパク質間相互作用に比べて、ほとんどのクロマチン抽出手順は、DNA-タンパク質相互作用に焦点を当てているので、新しい技術は密接にクロマチンに結合した多タンパク質複合体11を抽出する必要があります。一般に、感染の長さは、ウイルス株および細胞株の間で変動による経験的に決定されるべきである。3の時rWSN-PB2-球菌株を使用して、我々は3〜10時間の感染後に様々な時点で細胞内分画を行った。強力な細胞変性効果と分数の後続の混合で3時間の結果よりも感染症は長い間我々の経験では、感染未満の3時間は、有用なウェスタンブロット解析のための数が少なすぎる精製vRNPsをもたらします。そのまま、しっかりとクロマチンに結合したウイルスの複合体を分離する能力は、いくつかの可能性を開きます。IIタグPB2、他のアフィニティタグを発現する組換えウイルスも同様にトラッドなど、使用することができる利用しながらitional免疫沈降は、他のウイルスタンパク質を標的と。vitro合成アッセイで機能を実行するために使用することができる。最後に、核内分別を通して粗い機能の種にvRNPsの分離がさらに効率的なウイルスRNA合成12,13に必要なウイルスタンパク質のいくつかの最近記載された翻訳後修飾の緊密な研究を可能にすることができる。librarian.Disclosures利害の衝突が宣言されません。Acknowledgments著者らは、rWSN-PB2-球菌ウイルスの灘Naffakhとマリー·アンRameix-Welti(パスツール研究所)に感謝したいと思います。gdpr@jove.com.。