FavoritesSummaryインフルエンザウイルスは、宿主細胞のクロマチンに関連して、そのRNAゲノムを複製します。ここでは、感染細胞のクロマチンから無傷のウイルスのリボ核タンパク質複合体を精製する手法を提案する。ウイルスの複合体を精製し、それぞれウェスタンブロット、タンパク質およびRNA含量のプライマー伸長の両方で解析することができます。here.Abstractすべてのマイナス鎖RNAウイルスと同様に、インフルエンザウイルスのゲノムは一本鎖ゲノムは核タンパク質(NP)で包まれ、構成される三量体ポリメラーゼ複合体と関連付けされているウイルスのリボ核タンパク質複合体(vRNPを)の形でパッケージ化されていますPA、PB1、PB2サブユニットとの。ほとんどのRNAウイルスとは対照的に、インフルエンザウイルスは、感染細胞の核内にウイルスのRNA合成を実行します。興味深いことに、ウイルスmRNAの合成は、プライマーとして、携帯プレmRNAを使用しており、それは、このプロセスは、クロマチン1日に行われることが提案されている。ウイルスポリメラーゼ及び宿主RNAポリメラーゼIIと同様に、NPとホストヌクレオソーム間の相互作用はまた、1,2特徴づけられている。最近では、One-Strepタグをコードする組換えインフルエンザウイルスの発生は遺伝的であるウイルスポリメラーゼのPB2サブユニットのC末端(rWSN-PB2-球菌3)にした融合enは説明します。これらの組換えウイルスは、感染細胞からのvRNPsなど、PB2を含む複合体の精製を可能にします。精製されたvRNPsを取得するために、培養細胞が感染されており、vRNPsは、親和性、これらの細胞から派生したライセートから精製されています。日付に使用される溶解の手順は、一般的なヌクレアーゼの存在にもかかわらず、しばしば唯一の非効率的にクロマチンに結合した物質を抽出し、ワンステップの洗剤溶解に基づいてされています。私たちの予備的な作業は、核vRNPsの大部分は伝統的な細胞溶解中に抽出されなかったことを示唆し、したがって、アフィニティー精製することができませんでした。この抽出効率を高めるために、非クロマチン結合型核vRNPsからクロマチンに結合分離するために、我々は、インフルエンザウイルス感染細胞へ段階的に細胞内抽出プロトコルを適応した。"nucleoplasmic"分数と呼ばれる)水溶性核タンパク質を抽出します。)これらの塩抽出の手順はまだ親和性マトリックスへのタグ付けvRNPsの結合を許可500mMのNaCl、まだ核vRNPsの85%以上を可溶化するのに十分であったという我々の観察に基づいて選ばれました。感染細胞の細胞内分画後、それは、それぞれ個々の画分からPB2-タグvRNPsの親和性を精製し、それらの蛋白質およびウエスタンブロットおよびプライマー伸長を用いてRNA成分を分析することが可能である。500mMのNaCl(ch500)で抽出したクロマチン画分で感染した後に遅れてのポイントの間にそのvRNPをエクスポートする複合体の形を発見するためにこのメソッドを使用しました。Protocolプロトコルの概略フローチャートを図に示されています。1と試薬のテーブルは以下に提示されています。150ミリメートルのプラスチック細胞培養ディッシュにHeLa細胞外シード。細胞がコンフルエントに100%に達していないことが重要です。IIタグインフルエンザウイルスストックを希釈3の感染多重度にウシ血清アルブミン0.3%(BSA)を含む生理食塩水(PBS)をリン酸緩衝。mlのPBSで細胞にウイルスを含む追加します。室温で1時間インキュベートする。DMEM高グルコースの感染媒体を交換し、37°Cでインキュベーションを続ける°Cに">インキュベーションの長さは(説明を参照してください)​​勉強する感染症の位相に依存します。mlコニカルチューブに移すと冷PBSで細胞を懸濁する。rpmで5分間、卓上遠心機で細胞とその後PBSを吸引除去する。mMジチオスレイトール(DTT)、1%のプロテアーゼ阻害剤ミックス)に再懸濁し、細胞ペレット。サスペンション後、細胞塊を破壊するために10ミリリットルのプラスチック血清ピペットに取り付けられた200μlのピペットチップを介して細胞を渡します。氷上で10分間インキュベートします。穏やかに細胞を再懸濁するために定期的に反転させる。15秒間高速で0.5%と渦の最終濃度にノニデットP-40(NP-40)を追加します。テーブルトップ遠心で4°Cで3500×gで10分間遠心geがあります。4°Cで上清とストアを削除°Cにこれは、細胞質画分である。ペレットは、元の細胞ペレットよりも小さく、白くなければなりません。mlの冷ショ糖バッファー、再遠心機でペレットを洗浄し、上清を捨てる。2、0.1%NP-40、1mMのDTT、1%のプロテアーゼ阻害剤·ミックス)でペレットを(核を含む)を再懸濁します。タイトフィット乳棒を用いて冷却した、すべてのガラス4ミリリットルDounceホモジナイザーに移し、20ストロークで核を均質化する。均質化時に発泡しないようにしてください。抵抗は約10ストロークの後に増やす必要があります。効率的な均質化は、位相差顕微鏡下で確認することができます。mlのマイクロ遠心チューブに均質化した核を移し、4°Cで回転するホイール​​の20分​​間インキュベートしC.10分間、4°Cで遠心で16000×gで遠心します。4°Cで上清とストアを削除°Cにこれはnucleoplasmic画分である。MのNaCl(150mMのNaClの最終濃度)を42μlを加え、4時20分さらにインキュベート°C、10分間、4°Cで遠心で16000×gで遠心します。4°Cで上清とストアを削除°Cにこれはch150画分である。2、0.1%NP-40、1mMのDTT、1%のプロテアーゼ阻害剤ミックス)と氷上で20分間インキュベートする。em>は、10分間4°Cで遠心インチ4°Cで上清とストアを削除°Cにこれはch500画分である。NaClを300μlを追加します。mlコニカルチューブに分ごとにパックされたのStrep-Tactinセファロースビーズのアリコートを100μlの。pHは7.9、150mMのNaCl(ch500サンプルの500mMのNaCl)、1mMのEDTA)の10冊を追加します。上清を捨て、ステップ3.3回繰り返し、その後、連鎖球菌の洗浄緩衝液を等量にビーズペレットを再懸濁します。mlコニカルチューブ)200μlを添加します。回転させるチューブを4°C1H°回転ホイール上のC。チューブ4で1,000×gで1分間°Cを遠心分離上清を捨てる。mlの冷球菌の洗浄緩衝液を追加します。mLの試験管(細胞質画分)からビーズを転送します。4で全てのチューブ1分°C、ステップ3.7のようにした後、遠心分離を洗う。二回の洗浄ステップを繰り返します。最後の洗浄ステップの後、平らなピペットチップを使用して、洗浄緩衝液の痕跡をすべて削除します。100μlの溶出バッファー(2.5mMのdesthiobiotinを含む連鎖球菌洗浄バッファー)を加え、穏やかに混ぜる。氷上で15分間インキュベートします。優しくチューブの底をタップすることで時折ビーズを混ぜます。IIタグvRNPsを収集します。図2)特定のodies。5で抽出する必要があります。IIの劣化も再現文献6と一致して非感染細胞に比べて、インフルエンザウイルス感染細胞で観察されています。図細胞質溶出液のために示されるようにvRNPsの精製は、最高の、銀またはクマシー染色により判断される。我々の経験では、ほとんどのStrep-PB2が完全に形成されたvRNPの一環として、すなわち小さな水溶性ポリメラーゼがキャプチャされたで精製されています。銀またはクマシー染色により観察PA/PB1/PB2比:これは、高NPに反映されます。いくつかのユビキタスRNアーゼが(例えば、RNアーゼAなど)dissociのような方法で切断し、ウ​​イルスRNAによく知られているような低い比率は、RNaseのでバッファの混入を示唆しているNP多量7からポリメラーゼを食べました。興味深いことに、単独でベンゾナーゼによる治療は、ウイルスRNAを消化するのに十分ながら、vRNPをタンパク質の化学量論比に影響を及ぼさないように見えます。我々はこの現象を説明することはできませんが、我々はベンゾナーゼは、特定の構造的に重要なRNA領域はそのまま残しておく可能性が示唆された、他のRNase(データは示さず)で消化後vRNPsの破壊を観察した。細胞質と核質(ヌクレアーゼ消化せずに実行)からvRNPsの精製した後、高分子量で8かすかなしかし、離散的なバンドは、8インフルエンザウイルスゲノムセグメントの予測分子量に相当する銀染色法、(リファレンスを参照してください。3で観察することができます。