2.細胞固定およびせん断10cmの組織培養プレート上で細胞を70〜80%のコンフルエンスまで増殖させる。実験目的ごとに細胞を刺激する。組織培養培地を除去し、固定液5mLを添加し、インキュベートする細胞を振盪プラットフォーム上で室温で10分間インキュベートした。固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。PBSを除去し、5mLのグリシン停止固定溶液を添加し、振盪プラットフォーム上でRTで5分間細胞をインキュベートする。グリシン停止固定溶液を除去し、10mLの氷冷1×PBSで細胞を2回洗浄する。1×PBSを除去し、2mLの細胞掻き取り溶液を加え、細胞スクレーパーを用いて細胞を回収する。採取した細胞を氷上のコニカルチューブに移す。xgおよび4°Cで10分間サンプルを遠心分離する。上清を除去し、ペレットを1×細胞溶解緩衝液1mLに再懸濁し、氷上で30分間インキュベートする。液体窒素中でペレットをスナップフリーズし、-80°Cで保存します。ペレットを細胞溶解バッファーに再懸濁したら、細胞懸濁液を氷冷ダウンスホモジナイザーに移し、タイプBのペストル細胞破壊のためのe。xgおよび4°Cで10分間サンプルを遠心分離します。上清を捨て、ペレットを350μLの核消化バッファーに再懸濁し、37°Cで5分間サンプルをインキュベートする。/μL)を添加し、ボルテックスで混合する。サンプルを37°Cで5〜20分間インキュベートする。2分ごとにサンプルを反転させる。注:時間と酵素濃度は細胞株間で異なり、最適以下の酵素的剪断の場合に最適化が必要な場合があります。市販の超音波処理器を用いた超音波処理によるクロマチン剪断を達成する。注:超音波条件は最適化が必要です。300μLのサンプル容量と25%のサンプル処理能力を用いて最適化の例のプロトコルを以下に示す。300μLの再懸濁した核ペレットを3つの1.7mLマイクロ遠心チューブに分注する。それらを氷上に置きます。最適な超音波処理条件を決定するために、3つの異なる条件を使用して25%出力で固定クロマチンの3つのアリコートをせん断する:それぞれ20秒の5パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。それぞれ20秒の10パルス、各パルスの間に氷上に30秒の休止時間があります。それぞれ20秒の20回のパルス、各パルスの間の氷上での30秒の休息。以下に説明するように、ステップ2.15に進みます。xgおよび4°Cで10分間サンプルを遠心分離する。剪断したDNA含有上清を新鮮な微量遠心管に移す。50μLを別のマイクロ遠心チューブに分注してsuを確認する。DNAの厳しい剪断(セクション3)。免疫沈降(セクション4)のために残りの容量をすぐに使用するか、-80°Cで保存してください。サンプルを65°Cで4時間インキュベートし、クロスリンクを逆にする。A(10μg/μL)を添加し、サンプルを37°Cで15分間インキュベートする。プロテイナーゼK(0.5μg/μL)10μLを添加し、サンプルを42°Cで90分間インキュベートする。DNAの精製のために、フェノール/クロロホルム抽出を行う12。ヌクレアーゼフリーの水を200μLの最終容量に加えます。200μLのフェノール:クロロホルム:イソアミルアルコール(25:24:1)を試料に添加し、20秒間ボルテックスする。室温で遠心する16000×gで5分間の穿孔。慎重に上部の水相を取り出し、新しいチューブに移す。ピペッティング中にフェノールを持ち込まないように注意してください。OAc)(pH4.2)を加え、チューブを指で数回フリックすることによって混合する。2.5容量の氷冷した100%エタノールを加え、ボルテックスで5秒間混合する。Nを-20°Cでインキュベートするか、-80°Cで少なくとも1時間インキュベートする。xgで30分間サンプルを遠心分離し、cDNAをペレットにします。ペレットを破壊することなく上清を注意深く除去する。1mLのRT、70%エタノールを添加し、チューブを数回反転させる。4°C、16,000×gで2分間サンプルを遠心分離する。慎重に上清を除去する。ペレットを室温で5〜10分間乾燥する。1%TAEを用いたゲル電気泳動のために、精製されたDNAの5および10μLアリコートを使用するアガロースゲル。bpのDNAパターンをもたらす。せん断がうまくいかない場合、せん断工程(ステップ2.12)のインキュベーション時間を5分、10分および15分に変更することによって、特定の細胞の最適なせん断条件を決定する。残りのサンプルを使用して、サンプルのDNA濃度を分析します。剪断したクロマチンサンプル中のDNA濃度を逆算する(ステップ2.16)。免疫沈降のための各処置群について同じDNA量を用いる(セクション4)。NaCl)、および1μLのPICを含む。Oを最終容量100μLに加える。注:上記の直接免疫沈降法の代わりに、間接免疫沈降法を、最初にクロマチンを抗体と組み合わせ、続いてプロテインG磁気ビーズを添加することにより使用することができる。サンプルを4〜12時間4°Cでエンドツーエンド回転子にインキュベートする。磁気スタンドにチューブを置きます。磁性ビーズがチューブの側面に集まったら、慎重に上清を除去して捨てる。NaCl)800μLでビーズを3回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドに磁気ビーズがチューブの側面で凝集すると、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。NaCl)でビーズを1回洗浄する。チューブを数回反転させて混ぜる。チューブを磁気スタンドの上に置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まったら、注意深く洗浄バッファーを取り出して廃棄します。)に再懸濁し、サンプルをRTで15分間エンドツーエンド回転子にインキュベートする。チューブを磁気スタンドに置き、磁気ビーズがチューブの側面に集まると、上清を新しいチューブに移す。NaClを添加して架橋を逆転させ、2μLのプロテイナーゼK(0.5μg/μL)を加える。サンプルを混合した後、サンプルを65°Cで2時間インキュベートする。注:サンプルはタンパク質結合部位(セクション5)について直接解析することも、-20°Cで保存することもできます。6.結合部位分析PCRまたはqRT-PCRを使用して、既知の核酸配列内の特異的結合部位の分析を行います。プライマー設計については、従来のPCRまたはqRT-PCRプロトコールに従う。Oとしての特異性を保証するために、4つの異なるDNA鋳型を用いてPCRをセットアップする。場合免疫沈降したタンパク質の既知の結合部位に特異的な異なるプライマーセットを用いて第5の鋳型を選択する。注:c-KITリガンドプロモーター分析の場合、従来のPCRを使用して、c-KITリガンドプロモーター領域内のSBEでのTGF-β誘導SMAD結合を実証する。陽性対照として、TGF-β誘導性SMAD結合の既知の標的としてプラスミノーゲンアクチベーターインヒビター-1(PAI-1)でPCRを行う。3転写因子のセリンリン酸化をもたらし、次いで共通メディエーター、SMAD4とのそれらの会合をもたらす。SMAD複合体は核に移行する。TGF-βは、標的遺伝子の調節領域内のSBEへのSMAD結合を介して、または関心対象の遺伝子の発現を引き続き制御する転写活性化因子またはリプレッサーのSMAD調節発現を介して間接的に、遺伝子転写を調節することができる。