SCFプロモーターへのSMAD2のTGF-β1誘発結合を確認するために、本明細書に記載のChIPアッセイを行った。)においてSCFプロモーターにSMAD2が結合する結果となった。TGF-β1刺激の非存在下では、SMAD結合は認められなかった。TGF-β1誘導SMAD活性化の陽性対照として、PAI-1に対するChIPが実施された。SMAD13の既知の標的である。SMAD2免疫沈降の特異性を確認するために、非特異的IgG抗体を用いた。SBEへのSMAD2の結合は、IgGによる免疫沈降後に認められなかった。)のTGFB開始コドンの2つの推定上のSTAT3結合部位を同定した。STAT3のTGF-βリガンド遺伝子へのTGF-β1誘導結合を確認するために、TGF-β1処理HepG2およびHep3B細胞を用いてChIPアッセイを行った。この実施例では、STB-2への正のSTAT3結合が内部陽性対照として働く。上記のChIP実験と同様に、STB-2へのSTAT3の結合は、IgGを用いた免疫沈降後も見られなかった。ong>:SCFプロモーターへのTGF-β誘発SMAD2結合。AGAC)として示す推定SBEを有するSCFプロモーターの模式図。SCF開始コドンとPCR産物のサイズとの相対的な位置を示す。SCFプロモーターへのSMAD2結合のChIP。タンパク質複合体を抗SMAD2抗体で免疫沈降させた。SCF特異的プライマーを用いてPCRを行った。左には、入力DNAを用いたPCR結果が示されている。途中で、SMAD2免疫沈降特異性の確認のために、非特異的IgGによる免疫沈降後のPCR結果を示す。PAI-1へのSMAD2結合に対するChIPを陽性対照として用いた。">この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。:TGF-β誘導TGF-β遺伝子へのSTAT3結合。)TGF-β遺伝子の概略図であり、推定STAT3結合部位は、開始コドンに対するそれらの相対位置を有する灰色のボックスとして示されている。ChIPプライマーの位置は、以下に示すTGF-β開始コドンおよびPCR産物サイズに対するそれらの相対的な位置とともに示される。)TGF-β1がSTAT3とTGF-β遺伝子との結合を誘導するChIP。タンパク質複合体を抗STAT3抗体で免疫沈降させた。TGF-β特異的プライマーを用いてPCRを行った。左には、入力DNAを用いたPCR結果が示されている。途中で、PCR非特異的IgGによる免疫沈降後の結果が、STAT3免疫沈降特異性の確認のために示される。上のパネルはSTAT3結合部位1(STB-1)に特異的なプライマーを用いたPCR結果を示し、下のパネルはSTAT3結合部位2(STB-2)へのSTAT3結合の結果を示す。この図の拡大版を見るには、ここをクリックしてください。librarian.Discussionこの報告では、我々は、c-KITリガンドプロモーター内のSBEへのSMAD2のTGF-β1誘導性結合およびTGF-β1リガンド遺伝子内のその認識配列へのSTAT3のTGF-β1誘導結合を実証する。本発明者らは、クロマチン免疫沈降を用いて、両方の転写因子のサイトカイン誘導性結合を実証する。クロマチン免疫沈降は、目的のタンパク質がDNAに直接結合することを実証し、タンパク質のDNA結合を誘導する刺激を特徴づけ、タンパク質が結合するDNA配列を特徴付ける強力なツールである。後者の情報は、目的の特定のタンパク質によって調節される遺伝子の同定を助けることができ、ChIP-on-chip、ChIP-seq、またはクローニング戦略7,8,9の使用によって達成される。他のものではインビトロで行われるということである。したがって、ChIPは、細胞の状況でのDNA-タンパク質の結合についての洞察を提供するが、他の技術は単離されたシステムを表す。ChIP分析は複雑で、結果に影響を与える可能性のある複数のステップが必要であり、最適化と経験が必要です。成功したChIPにとって重要な第1のステップの1つは架橋ステップ(ステップ2.2)である。UV架橋は不可逆的であり、したがって、ChIPには不適当である。ホルムアルデヒド架橋が好ましいが、ホルムアルデヒド濃度および架橋時間は両方ともクロマチン剪断および抗原沈降の効率に影響を及ぼし得る。v)およびより短い架橋時間(5〜10分)が、せん断効率を改善するので、好ましい。ホルムアルデヒドは効率的ではないタンパク質とタンパク質との架橋において、したがってDNA16に直接結合しないタンパク質に対しては最適ではない。そのような場合、ChIPは2段階アプローチで行うことができます。タンパク質架橋を行い、続いてホルムアルデヒド媒介DNA-タンパク質架橋を行います17。次の重要なステップはクロマチン剪断である。我々の研究では、マイクロコッカスヌクレアーゼを用いた酵素的剪断を用いた。酵素的剪断は、超音波処理がDNA-タンパク質結合を破壊する非架橋ネイティブChIP(N-ChIP)に特に有用である。N-ChIPは主にヒストンおよびヒストン修飾因子の分析に使用されます18。ミクロコッカールヌクレアーゼは比較的非特異的エンドエキソヌクレアーゼと考えられているが、配列特異的切断を誘発することが示されている19。これは、結果として生じるフラに配列依存性のバイアスをもたらす可能性がある特定の遺伝子座の過剰表現20。超音波処理は、配列偏りを伴わずに無作為にサイズの決められたDNA断片を作製し、一般に架橋ChIP(X-ChIP)に好ましい。音波処理条件は、各細胞または組織タイプおよび超音波処理機モデルについて経験的に決定されなければならず、得られるDNAフラグメントは一般に酵素的せん断よりも大きい16。サンプルの超音波処理または乳化は、タンパク質の変性および分解による抗体エピトープの消失をもたらし得る。免疫沈降工程は、ChIPの結果に大きく影響する別の重要なステップである。アガロースビーズはDNAを非特異的に結合し、添加されるビーズの数の変動は特定のシグナル対バックグラウンド比に影響を及ぼし得る。したがって、アガロースビーズ「スラリー」をDNA-タンパク質サンプルに添加する際に十分に懸濁された状態に保つことが重要である。本発明に使用される抗体一般に、ChIP等級の抗体を用いるべきであり、これらが入手できない場合には、少なくとも免疫沈降グレードの抗体が好ましいはずである。特定のエピトープは架橋中にマスクすることができるので、ポリクローナル抗体はいくつかのエピトープを認識するので有利である。添加される抗体の量は、沈殿する因子を超えるべきであり、したがって、各因子/抗体について経験的に決定されるべきである。抗体結合の平衡に達するための動力学は各抗体ごとに異なるので、最適なインキュベーション条件を各抗体について決定しなければならない。いくつかのコントロールを実験セットアップに含めることができます。PCRまたはqRT-PCR)において等しい鋳型DNA量を示すために、入力DNA対照を含むことが重要である。抗体コントロールが必要です目的のタンパク質の免疫沈降の特異性を確認する。通常、アイソタイプが一致した免疫グロブリンはネガティブコントロールとして適していますが、アガロースビーズも使用できます。場合によっては、陽性対照を用いてChIPの機能的実験フローを確認し、この目的のために抗ヒストン抗体が頻繁に使用される。刺激実験において、好ましい陽性対照は、関心対象のタンパク質の免疫沈降であり、引き続いて、タンパク質が刺激の際に結合する既知のDNA領域についての配列分析である。我々の代表的な結果では、PAI-1プロモーター内のSBEを、TGF-β1誘導SMAD結合の既知の標的として使用した。刺激されたタンパク質結合のない実験では、目的のタンパク質の標的ではないことが分かっているDNA配列を、その後のDNA分析に使用することができる。DNA分析に関しては、汚染を排除するために鋳型DNAなしの反応を含めることが重要である。ChIPは目的のタンパク質の遺伝子への結合を直接実証する優れた技術です。それは機能的な研究ではない。ルシフェラーゼ)などの機能的アッセイもまた必須である。これらのプロトコルでは、目的の遺伝子がレポーター遺伝子の調節位置にクローン化される。関心のある遺伝子の誘導は、それが調節機能を有する場合、レポーター遺伝子の発現をもたらす。対象の特異的タンパク質の調節的役割のさらなる確認のために、DNA結合タンパク質が遺伝子的にサイレンシングされるノックダウン細胞またはノックイン細胞を生成することができる。追加の対照として、調節遺伝子中のタンパク質結合部位を突然変異させて目的のタンパク質の結合を防止することができる。librarian.Disclosures著者らは競合する金銭的利益がないと宣言している。Acknowledgmentsこの研究はテキサス州ヒューストンのテキサス大学MDアンダーソンがんセンター(スタートアップファンド、BB)の支援を受けていました。gdpr@jove.com.。