hydroxymethylcytosineを分析し、定量するために使用することができます。HMCがCCGGのコンテキストで発生すると、この変更は、非切断部位に切断可能なMspIのサイトを変換します。here.AbstractDNAのhydroxymethylationは、DNAの長い知られている変更ですが、最近ではエピジェネティクス研究の焦点となっている。番目の炭素の位置に変更されます。HMCへの酵素的酸化に適している。HMCの生物学的役割は十分に理解されていないが、バイオマーカーとしての可能性があるため、多くの関心を生成している。hydroxymethylcytosineを識別するいくつかの画期的な研究によるものです。HMCを区別することはできません。hydroxymethylcytosineのグローバルな量を測定することができますが存在する。DNAの沈殿のために使用されるが、これらの抗体は、単一の基地resolution.Inの加算がない、解像度が免疫沈降されたDNAのサイズとするために依存することができる、存在している抗体マイクロアレイ実験には、プローブの設計に依存します。hydroxymethylcytosineはゲノムやエピジェネティックな調節におけるその役割に存在する場所を正確に、新しい技術は、遺伝子座特異的hydroxymethylationを識別できる必要があります。MCの分析キットは、特定の遺伝子座で、これら2つの変更を区別するためのソリューションを提供します。hydroxymethylcytosineの同定と定量のためのシンプルかつ堅牢な方法です。MspIとHpaIIの差のメチル化の感度を利用しています。MCを含むDNAは影響を受けません。このグルコシル化は、制限エンドヌクレアーゼ消化が続いている。MspIとHpaIIは、同じシーケンス(CCGG)を認識しますが、異なるメチル化状態に敏感です。ghmC):HpaIIは完全無修正サイトを切断する。ghmCを認識し切断する。プロトコルの3番目の部分は、PCRによる遺伝子座の尋問です。ngのを使用することができます。bp)を隣接するプライマーとターゲットDNAの増幅が行われます。hydroxymethylcytosineが含まれている場合は、バンドがグルコシル化と消化の後、ではなく、非glucosylatedコントロール反応で検出される。リアルタイムPCRはhydroxymethylcytosineは、この特定のサイトにどれだけの近似を与える。hydroxymethylcytosine量を分析します。4の31マイクロリットルを混ぜるとまでヌクレアーゼフリー水を310リットル〜310マイクロリットルの総容積をもたらす。155マイクロリットルずつの2つのチューブにこの反応混合物を分割する。-β-グルコの30台、または3マイクロリットルを、追加します。静かにピペッティングでよく混ぜる。hydroxymethylcytosineグループの水酸基にグルコースを加えるとなる時間の間に、12〜18時間37°Cで、両方のチューブをインキュベートします。0.2ミリリットルのPCRストリップチューブ番号1〜3。それぞれに反応混合物のアリコート50μlの。0.2ミリリットルのPCRストリップチューブ番号4〜6です。それぞれにコントロールの混合物のアリコート50μlの。100単位、または1マイクロリットルを、追加。静かにピペッティングでよく混ぜる。チューブ2と5にHpaIIの50台、または1マイクロリットルを、追加。静かにピペッティングでよく混ぜる。彼らはコントロールであるとして、チューブ3と6には何も追加しないでください。少なくとも4時間、37°Cでの全6チューブをインキュベートします。各チューブにプロテイナーゼKの1マイクロリットルを追加し、30分間40°Cでインキュベートする。10分間、摂氏95度でインキュベートしてプロテイナーゼKを不活性化する。Taqを使用しています。他のPCRのプロトコルを代用することができます。Taq反応バッファー、10ミリモルのdNTP、10マイクロモルフォワードプライマーの1マイクロリットル、10マイクロモルリバースプライマーの1マイクロリットル、テンプレートの3マイクロリットルの1.5マイクロリットルの10マイクロリットル:氷の上で0.2ミリリットルのPCR反応チューブに以下のコンポーネントを追加します。ポリメラーゼの1マイクロリットル、およびヌクレアーゼフリー水50リットルまでのDNA。これらのボリュームは、使用されるPCRのプロトコールにしたがって変更される可能性があります。穏やかに反応を混在させる。必要に応じて、迅速なスピンでチューブの底にすべての液体を集める。フタがなく、サーマルサイクラーを使用する場合はミネラルオイルでサンプルをオーバーレイ。摂氏94度に予熱したブロックと氷からサーマルサイクラーにPCRチューブを転送し、サイクリングプログラムを起動します。1つの初期変性ステップがあるはずです20秒、またはkbあたり50秒。これは、5分間摂氏65度に一つの最終的な拡張子が続く必要がある。hydroxymethylcytosineの量を定量するために実行することができます。具体的な情報については、neb.com上で見つかった、製品のマニュアルを参照してください。