麻酔後、迅速に断頭し、脊髄と脳幹のダブルピッシングによる鎮静金魚を安楽死させる。その後湾曲した先端のはさみや先の曲がったピンセットで目を削除します。(IACUC)によって承認されている。春のはさみで、目の前の周りに均等にカットすることでそれぞれの目を二等分する(15003〜08、ファイン科学ツール、はさみのヒントを穿刺することによりカットの開始)、およびチルドスライス液(低カルシウム)にアイカップを置きます。NECE場合ssary、ピンセット(レンズは通常目の前にデタッチされる)でレンズを取り外します。°傾斜先端微細な鉗子のペア(11251〜35、ファイン科学のツール)を使用して接続されている色素上皮と網膜を削除します。微細な鉗子や春のはさみのどちらかで視神経を切断するまたは切断。変更されたパスツールピペットまたは転送ピペット(大ヒント)から適用される角度の微細な先端の鉗子と吸引の組み合わせで軽く網膜を削除します。網膜に接続されている色素上皮の残りの部分を削除するには、斜め微細な先端の鉗子を使用してください。清浄で健康的な網膜の表面には、濃い滑らかで赤く表示されます。すべての暗い色素上皮細胞の完全な除去のために1時間(8、1992)のために網膜を暗適応させる。このインキュベーションの間に、氷冷スライスのソリューションを準備することができます。mLのプラスチック製の注射器の本体、および寒天溶液((1.2)で調製した)で満たされた小さなコンテナに網膜の一部を譲渡する。それは、液体培地に置かれるように網膜の周囲液の量を最小限に抑えるようにしてください。寒天20、18、9を固めるために氷冷スライスソリューション((3.3)で調製)に直接浸し。私たちは、小さな、手作りのコンテナを使用してください。996、Pechineyプラスチック包装)のパッチで密封した。スライス板の表面にそれをスライスチャンバーへのブロックを転送し、接着剤。スライスのチャンバーは、冷凍庫(-20°C)で事前に冷却される。1200S、ライカ)を使用して200から250μmの厚さのスライスにブロックをカット。5〜10スライスの合計は約5〜6時間実行可能である、得ることができます。録音室にスライスの1つを転送する。2mLとなる率)を連続的灌流)。トラブルシューティング:寒天ブロックに埋め込まれた網膜片をスライス中にデタッチまたは寒天から復帰されている場合は、一つは、20μm刻みで最大300μmの200μmからスライス厚を増やすことができます。それがロール"キムワイプ"紙の先端で余分なソリューションを吸引して液体培地に移し、配置されるように網膜の周囲液の量を最小限に抑えるようにしてください。この問題を回避する別の方法は、最初に寒天に配置された網膜の部分のサイズを小さくすることです。硝子体は完全に網膜の一部に付着する寒天を禁止しているので、それは新鮮なヒアルロニダーゼを作るか、またはインキュベーション時間を(ステップ(3.3))を調整する必要があるかもしれません。正立顕微鏡(例えばBX51WI、オリンパス)で網膜スライスを配置します。DIC)光学系と網膜スライスを表示します。CCDカメラの出力はアナログソニー13"BLAC上で可視化する前にコントラスト強調のためにカメラコントローラ(C2400、浜松ホトニクス)に送信されます。顕微鏡はXY移動ステージにマウントされている、と記録チャンバーは固定ステージ14上に配置されます。図1)の位置によって識別することができるいずれかの無傷とaxotomized(軸索カット)双極細胞の端子を、見つける。図2)の検査で区別することができます。bの最も近位層(神経節細胞層に隣接するON型層)に位置しています。MB端末は、彼らの鈍い面とフラットな外観で、簡単に神経節と相明るい球状現れる避難アマクリンSOMAの、区別することができます。C)の滑らかな、クリーンな表面と比較すると粗いと不規則に表示されます。図1c)が表示されます。破損または不健康な端末はしばしば腫れを見て、表面上のいくつかの小さな粒状の構造が表示されます。それは、これらの端末でGΩシールを得ることは可能ですが、しかし彼らはブレークでの後まもなく破裂する可能性があります。不健康な端末の他の徴候は中空外観、コントラストおよび/または周囲のスライス、そして時にはスライスの表面における位置と同一の明るさが含まれています。ともスライス(ADVの表面付近:スライスの深い健康な端末から(もっと無傷のシナプス回路の利点)の両方を記録することが可能ですantage:外液の灌流薬剤にすばやくアクセスできます。+動態のイメージング0.2μmのフィルターチップ(Nalgene)とシリンジを用いて、ピペットの背面からレベル1-2センチメートルに内部溶液とガラスのパッチピペットを埋める。200、サッターインストゥルメント)を使用してターゲットの端末に向かって移動する。スライス通って下方の先端を移動させながら、スライスが先端と一緒にアップされていないことを保証するために横方向の掃引方向にピペットを移動します。膜の表面をきれいにする、端末の周囲ピペットの先端を移動します。ディンプルを(インデント)を作成し、正圧を解放するために、端末の端に下向きの先端を押してください。GΩのシールがすぐに形成していない場合、わずかな負圧を適用します。mVに保持電位を変更する。FAST(高速キャパシタンス)補正を適用し、細胞全体の記録の設定を確立するために口の中で適用されるシャープ、穏やかな吸引を有する膜を50〜10GΩの間で安定させるためにシールを待ってから、破裂。細胞全体の構成が正しく確立されている場合、直列抵抗はMΩ14から30の間になります。1-3GΩ用MΩ200から500になります。図2Aおよび2C)容量性過渡電流を守ってください。pFのベースラインの膜の静電容量を持っている。msの期間に電圧クランプステップを適用します。図2b)の開設により活性化+電流を単離した。図3c)を監視することができます。図2cおよび2dに表示されます。+電流が原因Mbの双極細胞1の樹状突起におけるギャップジャンクション結合による大規模な"リーク"電流の観察されない。mVへのステップの脱分極によって誘発することができます。膜容量のジャンプは、形質膜とシナプス小胞の融合を示している。mVのピークツーピーク)は、70mVの保持電位に追加されました。9パッチクランプアンプのソフトウェアエミュレーションによって2つの直交位相角度で分析した。細胞体と双極細胞の樹状突起の膜は、このように高周波電圧クランプ正弦波13で除外されます。6806、Invitrogen社))で内部パッチピペット溶液を混合し、プロトコルをから繰り返す50.1から5.5。これは1つが蛍光イメージングと電気生理学的記録を組み合わせることができるようになります。mV〜200ミリ秒のステップに関連付けられたをすることが可能です。X1、横河)との直立オリンパスの顕微鏡を統合している。nmのレーザーラインを使用しています。用いたカルシウムイメージング技術の詳細については、24、17、3を参照してください。トラブルシューティング:いずれかの頻繁に細胞全体の構成を確立するために失敗した場合は、さらに安定したGΩシールを形成した後に、それは穿刺端末を私にするために使用される負圧を低減すると便利かもしれませんmbrane。全細胞の構成の確立のための最適な吸引圧は膜の曲率(相馬>ターミナル)の関数として変化する場合があります。mVの、時間振幅)を使用することも可能です。我々は、MΩ12を超えるバス​​の抵抗とピペットチップを使用するときにブレークインする場合に特に有用であることがZAPプロトコルを発見した。