真核生物におけるDNA複製には増殖細胞核抗原(PCNA)、複製因子C(RFC)等の補助タンパク質が同定されたが、反応の素過程などは明らかになっていない。本年度はヒトDNAポリメラーゼδ(polδ)と相互作用因子であるヒトPCNAとのDNA合成反応を1分子レベルで解析する事を試みた。具体的にはp125の触媒サブユニットのみを持つpolδを調製し、活性を確認した。その後、液滴移動法を用いてPCNAの存在下または非存在下でのDNA合成反応への影響を調査した結果、PCNAの存在下及び非存在によるDNA合成長に大きな差は見られなかった。従ってヒトpolδ触媒サブユニットのみではPCNAと相互作用しない事を示唆している。1分子レベルでのDNA合成長の計測を効果的に行うためには、数多くのDNA分子をガラス基板上に固定し、同時に多くのDNA分子の挙動を観察する必要がある。これまで、末端にビオチンを導入したDNAの溶液をアビジン修飾した微細流路中に連続的に流すことにより、DNA末端で固定化を行ってきた。微細流路中では、流路内に形成される層流によりDNA分子末端が流路中心に引きずられるために、DNA分子末端が微細流路表面に衝突する機会が減り、その結果として、十分なDNA分子固定数が得られていないと考えた。そこで、DNA分子供給のための「流す時間」と固定化のための「流れを止める時間」の総和を90分とし、最大の固定化数を得られる条件を検討した。その結果、流れの停止時間30分,流動時間60分が最大の固定化数が得られ、単純に微細流路中にDNA試料を連続的に供給した場合の30倍程度の固定化数が得られた。この成果により、今後の1分子観察実験を効率的に進めることが可能になると期待される。末端固定化DNAが効率よく調製できないために、今年度の進捗状況としては「やや遅れていると」との評価になってしまったが、本年度の研究の結果、効率よくDNA分子を末端で固定できることが可能になったので、来年度はこの遅れを取り戻すように研究を進めていきたい。I、polα・δ・εを中心とした各酵素単独での1分子解析することで、各段階のDNA複製反応の中間過程を明らかにする。polεとPCNAとの相互作用を1分子レベルで解析し、他のDNAポリメラーゼの性質との違いを1分子レベルで解析を進める。I、polα・δ・εなどの各種DNA複製因子のタンパク質複合体形成時における挙動解析を、鋳型DNAへの超らせん導入の有無の条件下にて行う。この実験で、超らせんが各種DNA複製因子の反応に与える影響を明らかにする。不具合が発生したが、H29年度の予算では更新が困難であったので、H30年度の予算と合わせて、更新を行うこととした。