parkinの大量発現を試みている。M9培地では常に不溶性画分に発現されて問題となっていた。様々な発現タグも試したが可用性画分に目的タンパク質を得ることができなかった。そのため、不溶性画分からの抽出およびリフォールディングを試したところ、活性をもったparkinが少量ではあるが得られることが分かった。そこで、まずは収量を上げるために、様々、条件検討を行った。parkinのUBLドメインを欠損させたRORBR領域(ドミナントアクティブ体)にHis6-SUMOタグを付加したものが最もよいコンストラクトであった。このコンストラクトの発現ベクターを用いて、37°Cでタンパク質発現させると最も収量が高かった。リフォールディングについては、4M尿素でタンパク質を可溶化し、アルギニンやZnCl2(parkinはZnフィンガードメインを持つ)を加えたバッファーから透析で尿素を段階的に除去した。得られたparkinには自己ユビキチン化活性を持ち、さらにそのNMRスペクトルを測定することができた。リフォールディング後に切断したSUMOが非共有結合でparkinと会合し、これがまだ除去しきれていなかった。そのため得られたNMRスペクトルにはSUMO由来のシグナルが混入していた。parkinと比較してSUMOの方が分子量が小さいため、SUMO由来のシグナルのほうがより強く観測されてしまった。Status平成30年度が最終年度であるため、記入しない。Activity平成30年度が最終年度であるため、記入しない。