×この技術を簡単クリック査定この機能をご利用いただくには、会員登録(無料)が必要です。出願した特許の牽制数、引用された数などを知る事ができます。気になる技術や特許をブックマークしておけば、いつでも後から読むことができます。後で印刷するために、公報をPDFでダウンロードできます。会員登録してastamuseを使えば、もっと簡単に便利にお使いいただけます。会員登録(無料)「astamuse」は世界中の挑戦したい社会課題に挑戦し、未来を創る人のプラットフォームです。※この項目の情報は公開日時点(2015年2月12日)のものです。よる標的細胞膜タンパク質除去用組成物は、ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第1結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第2結合ドメインを含む二重結合分子を含み、前記ドライバー細胞膜タンパク質は、前記標的細胞膜タンパク質と同一の細胞の細胞膜に位置し、前記第1ドメインが結合したときに細胞内に移動して分解される。Protein)は、細胞膜に存在するタンパク質を意味し、それぞれ特異的な機能を有している。これら細胞膜タンパク質の正確な機能に対する研究は、主にsiRNAを用いたタンパク質の発現阻害によって行われている。このようなsiRNAを用いたタンパク質の発現阻害による方法によると、細胞膜上におけるタンパク質の正確な機能の究明には限界がある。細胞膜タンパク質の機能の判別のためのより有利な方法は、これら膜タンパク質が正常に発現して正常に細胞膜に配置された後にこれらを除去するものである。kinase;RTK)は、ある程度共通する構造を有している。多様な活性に関与している。細胞膜タンパク質の機能は、細胞膜タンパク質が正常に発現し、また正常に細胞膜に配置されて細胞外部の信号を細胞内部に伝達できてこそ、正常に発揮されることになる。細胞膜タンパク質は、細胞膜に存在しながら細胞内の位置に応じてそれぞれの特異的な機能を有しているため、これらの正確な機能に対する研究は主にsiRNAを用いたタンパク質の発現阻害によって行われているが、上述したように、細胞膜上における正確な機能の究明には限界がある。細胞膜タンパク質の機能の判別のためのより好適な方法として、これらの膜タンパク質が正常に発現して正常に細胞膜に配置された後にこれらを除去できる技術の開発が好ましい。depletion)方法を提供できると考えられる。したがって、RTKタンパク質をはじめとした多様な細胞膜タンパク質の正確な機能分析および効果的な抑制のために、正常に発現および細胞膜に配置された細胞膜タンパク質を除去する技術の開発が求められている。タンパク質除去用組成物を有効成分として含む抗癌組成物、並びに前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物を用いた細胞膜タンパク質の除去方法を提供する。本発明による標的細胞膜タンパク質除去用組成物は、ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第1結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第2結合ドメインを含む二重結合分子を含み、前記ドライバー細胞膜タンパク質は、前記標的細胞膜タンパク質と同一の細胞の細胞膜に位置し、前記第1ドメインが結合したときに細胞内に移動して分解される。含む軽鎖可変領域を含み、前記配列番号4〜配列番号9は、それぞれ、下記一般式I〜一般式VIで表されるアミノ酸配列である抗体である、請求項8に記載の標的細胞膜タンパク質除去用組成物:前記一般式Iにおいて、Xaa1は、存在しないかまたはProもしくはSerであり、Xaa2は、GluまたはAspであり、前記一般式IIにおいて、Xaa3は、AsnまたはLysであり、Xaa4は、AlaまたはValであり、Xaa5は、AsnまたはThrであり、前記一般式IIIにおいて、Xaa6は、SerまたはThrであり、前記一般式IVにおいて、Xaa7は、His、Arg、GlnまたはLysであり、Xaa8は、SerまたはTrpであり、Xaa9は、HisまたはGlnであり、Xaa10は、LysまたはAsnであり、前記一般式Vにおいて、Xaa11は、AlaまたはGlyであり、Xaa12は、ThrまたはLysであり、Xaa13は、SerまたはProであり、前記一般式VIにおいて、Xaa14は、Gly、AlaまたはGlnであり、Xaa15は、Arg、His、Ser、Ala、GlyまたはLysであり、Xaa16は、Leu、Tyr、PheまたはMetである。タンパク質除去用組成物を有効性分として含む抗癌組成物、および前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物を用いた細胞膜タンパク質除去方法が提供される。Protein)は、細胞膜に存在するタンパク質を意味し、それぞれ特異的な機能を有している。これら細胞膜タンパク質の正確な機能に対する研究は、主にsiRNAを用いたタンパク質の発現阻害によって行われている。このようなsiRNAを用いたタンパク質の発現阻害による方法によると、細胞膜上におけるタンパク質の正確な機能の究明には限界がある。0003細胞膜タンパク質の機能の判別のためのより有利な方法は、これら膜タンパク質が正常に発現して正常に細胞膜に配置された後にこれらを除去するものである。kinase;RTK)は、ある程度共通する構造を有している。多様な活性に関与している。細胞膜タンパク質の機能は、細胞膜タンパク質が正常に発現し、また正常に細胞膜に配置されて細胞外部の信号を細胞内部に伝達できてこそ、正常に発揮されることになる。0004細胞膜タンパク質は、細胞膜に存在しながら細胞内の位置に応じてそれぞれの特異的な機能を有しているため、これらの正確な機能に対する研究は主にsiRNAを用いたタンパク質の発現阻害によって行われているが、上述したように、細胞膜上における正確な機能の究明には限界がある。細胞膜タンパク質の機能の判別のためのより好適な方法として、これらの膜タンパク質が正常に発現して正常に細胞膜に配置された後にこれらを除去できる技術の開発が好ましい。depletion)方法を提供できると考えられる。0005したがって、RTKタンパク質をはじめとした多様な細胞膜タンパク質の正確な機能分析および効果的な抑制のために、正常に発現および細胞膜に配置された細胞膜タンパク質を除去する技術の開発が求められている。12:330発明が解決しようとする課題0008本発明の一形態は、ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第1結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第2結合ドメインを含む二重結合分子を含む標的細胞膜タンパク質除去用組成物を提供する。0009また、本発明の他の形態は、標的細胞膜タンパク質除去用組成物を有効成分として含む癌の予防および/または治療用組成物を提供する。0010さらに、本発明のさらに他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物を用い、生体から分離された細胞を処理する段階を含む標的細胞膜タンパク質の除去方法を提供する。課題を解決するための手段0011本発明の一形態は、ドライバー(driver)細胞膜タンパク質に結合する第1結合ドメイン、および標的細胞膜タンパク質に結合する第2結合ドメインを含む二重結合分子を含む標的細胞膜タンパク質除去用組成物を提供する。0012前記ドライバー細胞膜タンパク質に結合する第1結合ドメインと標的細胞膜タンパク質に結合する第2結合ドメインとを含む二重結合分子は、細胞膜に位置する第1結合ドメインを通じてドライバー細胞膜タンパク質と結合する一方、第2結合ドメインを通じて細胞膜タンパク質にも同時に結合する。この際、ドライバー細胞膜タンパク質は、第1結合ドメインとの結合によって細胞内に移動するようになり、これによって前記二重結合分子とこれに結合した標的細胞膜タンパク質がともに細胞内に移動して、細胞内で分解が行われる(図1および図2参照)。図1図20013図1は、本発明に係る細胞膜タンパク質除去技術の原理を模式的に示す。具体的に、図1は、標的の細胞膜タンパク質が細胞膜表面に存在する場合、この標的を認知すると同時に細胞膜上のドライバーと同時に結合して、除去しようとする標的の細胞膜タンパク質をともに細胞内移動(エンドサイト—シス)させて分解することができる二重結合分子(trigger)を細胞外部から処理して細胞膜タンパク質を除去する様子を示す図である。図10014図2は、本発明に係る標的特異的な細胞膜タンパク質除去技術の原理を模式的に示す。細胞膜上には様々な種類の細胞膜タンパク質が存在するが、二重結合分子(trigger)の特異性により他の細胞膜タンパク質には結合せず、標的しようとする特定の細胞膜タンパク質にのみ結合し、このタンパク質の細胞内移動(internalization)および分解(degradation)を誘発することができる。図20015前記ドライバー(driver)細胞膜タンパク質は、上述したとおり、二重結合分子を通じて標的の細胞膜タンパク質を細胞内に移動させる役割を果たすことを表現するために本明細書で命名したものである。0016前記ドライバー細胞膜タンパク質は、細胞膜に位置するタンパク質であって、各種リガンド、抗体、または抗体以外のタンパク質(もしくはペプチド)の結合によって細胞内在化(internalization)が誘発される全てのタンパク質でありうる。前記標的細胞膜タンパク質は、細胞膜に位置するタンパク質であって、二重結合分子を通じて前記ドライバー細胞膜タンパク質と結合されると細胞内在化される全てのタンパク質でありうる。enzymes)、リポタンパク質(lipoprotein)、インテグリン(integrin)、細胞表面の多様なマーカーなどからなる群より選ばれたものでありうる。C、Mucin1、EGFRvIII、Mesothelin等)等からなる群より選択されうる。domain)にリガンドまたは抗体が結合されると効率的に細胞内に移動する性質を有する全ての細胞膜タンパク質の中から選択されうる。前記ドライバー細胞膜タンパク質のうちの一部は、それ自体は細胞内移動を起こさないが、突然変異を通じてタンパク質にリガンドまたは抗体を処理した際に人為的に細胞内移動が誘発されうる細胞膜タンパク質に変形するものであってもよい。0018前記ドライバー細胞膜タンパク質は、前記標的細胞膜タンパク質と同一の細胞の細胞膜に位置するものであってもよいし、前記標的細胞膜タンパク質と同一の細胞の細胞膜に位置するように導入されたものであってもよい。前記ドライバー細胞膜タンパク質は、当該タンパク質に前記第1結合ドメインが結合したときに細胞内に移動し、その後に分解されるものでありうる。C、Mucin1、EGFRvIII、Mesothelinなど)。0019一実施形態において、前記ドライバー細胞膜タンパク質は、c−Metタンパク質であってもよく、ここに結合する二重結合分子の第1結合ドメインは、c−Metタンパク質のSEMAドメインのアミノ酸配列(配列番号79)の143番目から147番目のアミノ酸配列(配列番号73;EEPSQ)に結合するものでありうる。0020前記標的細胞膜タンパク質は、タンパク質の種類および性質、または機能に関係なしに細胞膜に存在する全ての種類の細胞膜タンパク質より選ばれたものであってもよく、自体的な性質としては、細胞膜から細胞内に移動しない細胞膜タンパク質まで全て含まれうる。0021一例において、前記標的細胞膜タンパク質は、受容体チロシンキナーゼのように腫瘍誘発(oncogenesis)等の非正常的細胞状態と関連した細胞シグナルを媒介する受容体、チャネルなどの細胞膜タンパク質でありうる。関連した疾病、例えば癌の治療標的になるものでありうる。proteins)等、全ての種類の細胞膜タンパク質からなる群より選ばれた1種以上のものでありうる。designation;CD)等)などからなる群より選ばれた1種以上でありうる。receptors;PDGFR)などからなる群より選ばれたものでありうる。0023前記「c−Metタンパク質」は、肝細胞成長因子と結合する受容体チロシンキナーゼを意味する。1)等のような齧歯類由来のものなどでありうる。NP_000236に提供されたアミノ酸配列を含むタンパク質、またはその細胞外ドメインを含む。多様なメカニズムに関与する。protein)は、それぞれ、EGFR(HER1)、HER2、HER3およびHER4から構成されているHERファミリーの受容体チロシンキナーゼ(RTKs)の一員である。EGFR、HER2、またはHER3の細胞外ドメインに対するリガンドの結合は、他のErbB受容体とのレセプターホモまたはヘテロ二量体化を誘導し、これは特異的なチロシン残基の細胞内自己リン酸化を誘発する。転移に影響を与えるMAPKおよびPI3K/Akt活性化を含むダウンストリームシグナル伝達ネットワークを率いる。再配列は、多様な種類のヒト悪性腫瘍で頻繁に観察され、癌治療の不良な予後および悪い臨床的結果と関連している。このような理由で、これらEGFR、HER2、および/またはHER3は、抗癌療法において重要な標的になる。0025前記EGFR、HER2、またはHER3は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。No.JQ739160、JQ739161、JQ739162、JQ739163、JQ739164、JQ739165、JQ739166、JQ739167、NM_005228.3、NM_201284.1、NM_201282.1、またはNM_201283.1等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。No.X03363.1等に提供されるヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。No.NM_001982等に提供されるヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。(VEGF)と結合して血管新生を起こし、癌細胞に必要な養分を供給する。VEGFRの過発現は、多様な疾病の原因になり、特に癌の発生のみならず、浸湿、転移などの悪い予後にも関与する。このような理由で、VEGFは、抗癌療法において重要な標的になる。前記VEGFRは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。NumberAF063657.2等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。調節および癌を起こす多くの疾病と関連している。前記PDGFRは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。Nos.NM_006206.4(PDGFR−A)、NM_002609.3(PDGFR−B)、NM_016205.2(PDGFR−C)等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。Receptor;IGF1R)は、受容体チロシンキナーゼのうちの一つであって、インシュリン様成長因子1(IGF−1)により活性化される膜通過受容体である。前記IGF1Rは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。No.NM_000875.3等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。receptors)は、表面受容体チロシンキナーゼのうちの一つであって、軸索ガイダンス、組織境界の形成、細胞遊走、セグメンテーションなどの胚発生過程を調節する。前記エフリン受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。Nos.NM_004440.3、NM_004438.3、NM_004431.3、NM_004442.6、NM_017449.3、NM_004093.3、NM_004441.4、NM_182472.2、NM_005232.4、NM_005233.5、NM_173641.2、NM_001099439.1、NM_001080448.2、NM_001080448.2、NM_004443.3、NM_182689.1、NM_004428.2、NM_004439.5、NM_001962.2、NM_004429.4、NM_182644.2、NM_004952.4、NM_173655.2、NM_182690.2、NM_020526.3、NM_001406.3、NM_005227.2、NM_182685.1等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。receptors)は、トランスフェリンのキャリアタンパク質であって、受容体媒介性エンドサイトーシスを通じて鉄の細胞内移動に関与し、細胞内鉄濃度を調節する。前記トランスフェリン受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。Nos.NM_001128148.1、NM_003234.2、NM_001206855.1、NM_003227.3、BC001188.1、M11507.1等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。Lipoprotein;LDL)受容体は、トランスフェリンのキャリアタンパク質であって、受容体媒介性エンドシトシスを通じて鉄の細胞内移動に関与し、細胞内鉄濃度を調節する。前記LDL受容体は、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。Nos.NM_000527.4、NM_001195802.1、NM_001195799.1、NM_001195803.1、NM_001195800.1、NM_001195798.1等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。Nos.(NM_000610.3、NM_001728.3、X55150.1)等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。pathway)および細胞反応を活性化し、多様な疾病に関与する。receptors);クラスEまたはクラス5(CyclicAMPreceptors);およびクラスFまたはクラス6(Frizzled/Smoothened)。前記GPCRは、ヒト、サルなどの霊長類、マウス、ラットなどの齧歯類などの哺乳類から由来したものでありうる。Nos.NM_001123041.2、NM_005508.4、NM_005201.3、NM_016602.2等に提供されたヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされたポリペプチドでありうる。Proteins)であって、ほとんど全ての細胞および組織類型で原形質膜上でまたは多様な細胞内小器官および顆粒内で多様に発見される。他の多くの細胞表面タンパク質とは異なり、テトラスパニンは明確な受容体機能を示してはいない。テトラスパニンは、エンドソームシステムおよびライソゾーム関連小器官で発見される。II(MHCII))等を含む。bodies)が細胞表面と融合するように誘発され、癌の進行および転移と機能的に関連があるエキソソーム(exosome)を分泌することができる。depletion)のためのドライバーまたは標的として使用可能であることを提案する。Nos.NM_001769またはNM_007657のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_004356またはNM_133655のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_001039490またはNM_001111049のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_001040034またはNM_001042580のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_001040031またはNM_007645のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_000560またはNM_007651のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_001047160またはNM_001047159のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_012338またはNM_173007のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_014399またはNM_025359のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_001278743、NM_001278742、NM_001278741、NM_001278740、NM_003270、またはNM_019656のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_005725、NM_001243132、またはNM_027533のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_001168412、NM_198902、NM_005724、またはNM_019793のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。Nos.NM_001282510、NM_001282509またはNM_012466のヌクレオチド配列(mRNA)によりコードされるアミノ酸配列を含むことができる。関連した細胞信号を媒介したり癌などの疾病に関連した標的細胞膜タンパク質と単純結合して活性を抑制することにとどまらず、これら標的細胞膜タンパク質を細胞内に移動させて分解させる、より根本的な除去作用を示す。0036前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物による標的細胞膜タンパク質除去のために、前記ドライバー細胞膜タンパク質と標的細胞膜タンパク質は、同一の細胞(例えば、同一の細胞の細胞膜)に位置するものでありうる。発現水準)を考慮すると、ドライバー細胞膜タンパク質との距離において特に制限はない。mimetics)等から独立して選択されるものでありうる。Domains)、ナノボディー(nanobody)、ペプチボディ(peptibody)、ペプチド(peptide)、アプチド(aptide)などからなる群より選ばれたものでありうる。0038例えば、前記第1結合ドメインは、ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片であり、前記第2結合ドメインは、標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片でありうる。前記ドライバー細胞膜タンパク質との結合部位と前記標的細胞膜タンパク質との結合部位を含む、ドライバー細胞膜タンパク質および標的細胞膜タンパク質に対する二重特異性(二重結合)抗体でありうる。ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片、および前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片のC末端またはN末端に連結された、標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片を含むものでありうる。二重特異性抗体のN−末端とC−末端とが構造的に相異するもの(例えば、Fc部位を基準に、N−末端部分とC−末端部分が互いに異なり、scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、F(ab’)2、およびDARPinsなどの抗体模倣体からなる群より選ばれたもの)、および/または機能的に相異するもの(例えば、C−末端とN−末端とが互いに異なるタンパク質を特異的に認識および/または結合するもの)でありうる。前記一本鎖の形態のドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体または抗原結合断片と標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片とが接合して左右非対称形態を形成するものでありうる。左右非対称形態の二重特異性抗体でありうる。左右非対称形態の二重特異性抗体は、互いに異なるタンパク質を特異的に認識および/または結合する2個の一本鎖抗体を含むものでありうる。form)を有するものでありうる。標的細胞膜タンパク質に対する抗体は、標的細胞膜タンパク質に対する特異的認識および結合が重要であるので、ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体は、完全な形態のみならず抗原結合断片形態のものであってもよい。ドライバー細胞膜タンパク質に対する完全な抗体および前記抗体のC末端に連結されたドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体の抗原結合断片を含むものでありうる。0044また、ドライバー細胞膜タンパク質と標的細胞膜タンパク質との距離を考慮すると、ドライバー細胞膜タンパク質との結合部位と標的細胞膜タンパク質との結合部位とが柔軟性のある連結部位を通じて連結されている構造が有利でありうる。おいてドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片と標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片は、ペプチドリンカーを通じてまたは通じることなく連結されうる。前記ペプチドリンカーは、1乃至100個、2乃至50個、または5乃至20個のアミノ酸からなるものであってもよく、それに含まれているアミノ酸の種類には制限がない。前記ペプチドリンカーは、Gly、AsnおよびSerからなる群より選ばれた1種以上の残基を含むことができ、Thrおよび/またはAlaのような中性アミノ酸も含むことができる。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は、当業界に公知となったものでありうる。機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。0046具体的な例において、前記標的細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片は、抗EGFR抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗VEGFR抗体、抗PDGFR抗体、抗IGF−1R抗体からなる群より選ばれた抗体またはその抗原結合断片でありうる。前記抗EGFR抗体は、セツキシマブ(Cetuximab;Erbitux)、パニツムマブ(Panitumumab)、マツズマブ(Matuzumab)、ネシツムマブ(Necitumumab)、ニモツズマブ(Nimotuzumab)、ザルツムマブ(Zalutumumab)、MM−151(EGFRの重複しないエピトープに結合するように設計された3個の完全なヒトのモノクローナル抗体の混合物からなるオリゴクローナル治療剤)、配列番号109または配列番号113の重鎖可変部位および配列番号110または配列番号114の軽鎖可変部位を有する抗体などからなる群より選ばれたものでありうる。前記抗HER2抗体は、トラスツズマブ(Trastuzumab;Herceptin)、ペルツズマブ(Pertuzumab)などからなる群より選ばれたものでありうる。前記抗HER3抗体は、RG−7597(ヒト化IgG1単クローン抗体)等でありうる。前記抗VEGFR2(KDR)抗体は、ラムシルマブ(Ramucirumab)等より選ばれたものでありうる。前記抗PDGFR抗体は、オララツマブ(Olaratumab、IMC−3G3)等でありうる。前記抗IGF−1R抗体は、シクスツムマブ(Cixutumumab;IMC−A12)等でありうる。前記標的細胞膜タンパク質に対する抗体が完全な抗体の形態で含まれていてもよいし、抗原結合断片として含まれていてもよい。0048前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体またはその抗原結合断片は、抗c−Met抗体、または細胞膜タンパク質を効率的に細胞内に内在化(internalize)させるタンパク質に対する抗体からなる群より選ばれた抗体またはその抗原結合断片でありうる。前記ドライバー細胞膜タンパク質に対する抗体は、完全な抗体の形態で含まれていてもよいし、抗原結合断片として含まれていてもよい。0049前記抗原結合断片は、免疫グロブリン構造全体に対するその断片であり、抗原が結合できる部分を含むポリペプチドの一部を意味する。scFv、(scFv)2、Fab、Fab’またはF(ab’)2でありうるが、これに限定されない。0050前記抗原結合断片のうちのFabは、軽鎖および重鎖の可変領域と軽鎖の不変領域および重鎖の第一不変領域(CH1)を有する構造で、1個の抗原結合部位を有する。region)を有するという点でFabと異なる。F(ab’)2抗体は、Fab’のヒンジ領域のシステイン残基がジスルフィド結合を形成しつつ生成される。0052Fvは、重鎖可変部位および軽鎖可変部位のみを有している最小の抗体断片であり、Fv断片を生成するための再構成技術は当業界に広く知られている。Fv)は、一般にペプチドリンカーを通じて重鎖の可変領域と単鎖の可変領域が共有結合で連結されたり、またはC末端に直結されていて、二重鎖Fvのようにダイマーのような構造をなすことができる。前記ペプチドリンカーは、1乃至100個、2乃至50個、または5乃至20個のアミノ酸からなるものであり、それに含まれているアミノ酸の種類には制限がない。前記ペプチドリンカーは、Gly、AsnおよびSerからなる群より選ばれた1種以上の残基を含むことができ、Thrおよび/またはAlaのような中性アミノ酸も含むことができる。ペプチドリンカーに適したアミノ酸配列は、当業界に公知となったものでありうる。機能に影響を与えない限度内で、その長さを多様に決定することができる。通じて作製することができる。抗c−Met抗体、および前記抗c−Met抗体のC末端に連結された標的細胞膜タンパク質に対する抗体(例えば、抗EGFR抗体、抗HER2抗体、抗HER3抗体、抗VEGFR抗体、または抗PDGFR抗体など)のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’またはF(ab’)2、例えばscFvを含むものでありうる。前記抗EGFR抗体のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’またはF(ab’)2は、配列番号109または配列番号113のアミノ酸配列を含む重鎖可変部位と配列番号110または配列番号114のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部位とを含むものでありうる。抗c−Met抗体、および前記抗c−Met抗体のC末端に連結された、配列番号109または配列番号113のアミノ酸配列を含む重鎖可変部位と配列番号110または配列番号114のアミノ酸配列を含む軽鎖可変部位とを含む抗EGFR抗体のscFv、(scFv)2、Fab、Fab’またはF(ab’)2を含むものでありうる。0055前記抗c−Met抗体は、c−Metに作用して細胞内移動(internalization)および分解(degradation)を誘導する全ての抗体またはその抗原結合断片であってもよく、c−Metの特定部位、例えばSEMAドメイン内の特定部位をエピトープで認識するものでありうる。domain)からなる。c−Metタンパク質のSEMAドメインは、配列番号79のアミノ酸配列を有するものであってもよく、c−Metの細胞外部位に存在するドメインであって、HGFが結合する部位に相当する。SEMAドメイン中の特定部位、例えば、106番目から124番目までに相当する配列番号71のアミノ酸配列を有する領域は、c−Metタンパク質のSEMAドメイン内のエピトープ中の2番と3番プロペラドメイン間のループ(loop)部位に相当し、本発明で提案される抗c−Met抗体のエピトープで作用することができる。determinant)であって、抗体により認識される抗原の一部分を意味する。一つの具体的な例によれば、前記エピトープは、c−Metタンパク質のSEMAドメイン(配列番号79)内の連続する5個以上のアミノ酸を含む部位、例えば、c−Metタンパク質のSEMAドメイン(配列番号79)内の106番目から124番目までに該当する配列番号71内に位置する連続する5個乃至19個のアミノ酸を含むものでありうる。前記エピトープは、配列番号71のアミノ酸配列中の配列番号73(EEPSQ)を含む連続する5乃至19個のアミノ酸からなるものでありうる。前記配列番号73のアミノ酸配列は、c−Metタンパク質のSEMAドメイン(配列番号79)の143番目位置から147番目位置までのアミノ酸配列である。前記エピトープは、配列番号71、配列番号72または配列番号73のアミノ酸配列を有するポリペプチドでありうる。0058前記配列番号72のアミノ酸配列を有するエピトープは、c−Metタンパク質のSEMAドメイン内の2番と3番プロペラ構造のドメイン間のループ部位のうち最も外側に位置する部位に相当し、前記配列番号73のアミノ酸配列を有するエピトープは、一つの具体的な例による抗体または抗原結合断片が最も特異的に結合する部位である。0059したがって、抗c−Met抗体は、配列番号71のアミノ酸配列のうち、配列番号73(EEPSQ)を含む連続する5乃至19個のアミノ酸を含むエピトープに特異的に結合するものであってもよく、例えば、配列番号71、配列番号72、または配列番号73のアミノ酸配列を有するエピトープに特異的に結合する抗体または抗原結合断片でありうる。前記一般式VIにおいて、Xaa14は、Gly、AlaまたはGlnであり、Xaa15は、Arg、His、Ser、Ala、GlyまたはLysであり、Xaa16は、Leu、Tyr、PheまたはMetである。0063一つの具体的な例において、前記CDR−H1は、配列番号1、配列番号22、配列番号23および配列番号24からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。前記CDR−H2は、配列番号2、配列番号25、および配列番号26からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。前記CDR−H3は、配列番号3、配列番号27、配列番号28、および配列番号85からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。0064前記CDR−L1は、配列番号10、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33および配列番号106からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。前記CDR−L2は、配列番号11、配列番号34、配列番号35、および配列番号36からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。前記CDR−L3は、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号37、配列番号86、および配列番号89からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するものでありうる。0065一つの具体的な例において、前記抗体または抗原結合断片は、配列番号1、配列番号22、配列番号23および配列番号24からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド(CDR−H1)、配列番号2、配列番号25、および配列番号26からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド(CDR−H2)、および配列番号3、配列番号27、配列番号28、および配列番号85からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド(CDR−H3)を含む重鎖可変領域;および配列番号10、配列番号29、配列番号30、配列番号31、配列番号32、配列番号33および配列番号106からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド(CDR−L1)、配列番号11、配列番号34、配列番号35、および配列番号36からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド(CDR−L2)、および配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号37、配列番号86、および配列番号89からなる群より選ばれたアミノ酸配列を有するポリペプチド(CDR−L3)を含む軽鎖可変領域を含むものでありうる。antibody)が開発された。キメラ抗体は、遺伝工学的方法を用いて抗アイソタイプ(anti−isotype)反応の原因になる動物由来抗体の不変領域をヒト抗体の不変領域で置換したものである。キメラ抗体は、動物由来抗体に比べて抗アイソタイプ反応において相当部分改善されたが、依然として動物由来アミノ酸が可変領域に存在していて、潜在的な抗イディオタイプ(anti−idiotypic)反応に対する副作用を有している。antibody)である。regions)部位をヒト抗体骨格(framework)に移植して作製される。structure)の分析、分子モデリング技術などが活用される。最適化したヒト抗体骨格に動物由来抗体のCDR部位を移植しても動物由来抗体の骨格に位置しながら抗原結合に影響を与えるアミノ酸が存在することがあり、抗原結合力が保存されない場合が相当数存在するため、抗原結合力を復元するための追加的な抗体工学技術の適用は必須といえる。0068一つの具体的な例によれば、前記抗体は、マウス由来抗体、マウス−ヒトキメラ抗体またはヒト化抗体でありうる。length)軽鎖および2個の全長重鎖を有する構造であり、それぞれの軽鎖は重鎖と二硫化結合で連結されている。抗体の不変領域は、重鎖不変領域と軽鎖不変領域に分けられ、重鎖不変領域は、ガンマ(γ)、ミュー(μ)、アルファ(α)、デルタ(δ)およびイプシロン(ε)タイプを有し、サブクラスとしてガンマ1(γ1)、ガンマ2(γ2)、ガンマ3(γ3)、ガンマ4(γ4)、アルファ1(α1)およびアルファ2(α2)を有する。軽鎖の不変領域は、カッパ(κ)およびラムダ(λ)タイプを有する。chain)」という用語は、抗原に特異性を付与するために十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVHおよび3個の不変領域ドメインCH1、CH2およびCH3とヒンジ(hinge)を含む全長重鎖およびその断片を全て含む意味として解釈される。chain)」という用語は、抗原に特異性を付与するための十分な可変領域配列を有するアミノ酸配列を含む可変領域ドメインVLおよび不変領域ドメインCLを含む全長軽鎖およびその断片を全て含む意味として解釈される。region)のアミノ酸配列を意味する。重鎖および軽鎖は、それぞれ3個のCDRを含むことができる(CDRH1、CDRH2、CDRH3およびCDRL1、CDRL2、CDRL3)。前記CDRは、抗体が抗原またはエピトープに結合する際の主な接触残基を提供することができる。本明細書において、「特異的に結合」または「特異的に認識」という用語は、当業者に通常公知されている意味と同一なものであって、抗原および抗体が特異的に相互作用して免疫学的に反応することを意味する。配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号75、配列番号88、配列番号95、配列番号96、配列番号97、配列番号98、配列番号99または配列番号107のアミノ酸配列を含むものでありうる。region)に特異的に結合するモノクローナル抗体でありうる(韓国公開特許第2011−0047698号参照;前記文献は本明細書に参照として含まれる)。0074前記の抗c−Met抗体は、韓国公開特許第2011−0047698号に定義された抗体を全て含むことができる。0075前記抗c−Met抗体の上記で定義されたCDR部位または軽鎖可変部位と重鎖可変部位を除いた軽鎖不変部位と重鎖不変部位は、全てのサブタイプの免疫グロブリンの軽鎖不変部位と重鎖不変部位でありうる。0076一つの具体的な例によれば、前記抗c−Met抗体は、配列番号62のアミノ酸配列(このうち1番目から17番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである)または配列番号62の18番目から462番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号68のアミノ酸配列(このうち1番目から20番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである)または配列番号68の21番目から240番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体;配列番号64のアミノ酸配列(このうち1番目から17番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである)または配列番号64の18番目から461番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号68のアミノ酸配列または配列番号68の21番目から240番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体;または配列番号66のアミノ酸配列(このうち1番目から17番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである)または配列番号66の18番目から460番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号68のアミノ酸配列または配列番号68の21番目から240番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体でありうる。0077他の具体的な例によれば、前記抗c−Met抗体は、配列番号62のアミノ酸配列または配列番号62の18番目から462番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号70のアミノ酸配列(このうち1番目から17番目までのアミノ酸配列はシグナルペプチドである)または配列番号70の21番目から240番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体;配列番号64のアミノ酸配列または配列番号64の18番目から461番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号70のアミノ酸配列または配列番号70の21番目から240番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体;または配列番号66のアミノ酸配列または配列番号66の18番目から460番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号70または配列番号70の21番目から240番目までのアミノ酸配列のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体でありうる。0078他の具体的な例によれば、前記抗c−Met抗体は、配列番号62のアミノ酸配列または配列番号62の18番目から462番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号108のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体;配列番号64のアミノ酸配列または配列番号64の18番目から461番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号108のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体;または配列番号66のアミノ酸配列または配列番号66の18番目から460番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号108のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体でありうる。0079一つの具体的な例において、前記前記抗c−Met抗体は、配列番号66のアミノ酸配列または配列番号66の18番目から460番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号68の21番目から240番目までのアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体または配列番号66のアミノ酸配列または配列番号66の18番目から460番目までのアミノ酸配列を有する重鎖および配列番号108のアミノ酸配列を有する軽鎖からなる抗体でありうる。numbering)に従う、配列番号68内の62番目アミノ酸位置)ヒスチジン(histidine)がチロシン(tyrosine)で置換された形態のポリペプチドである。一実施形態によれば、前記置換によって、抗体の生産量を増加させることができる。前記配列番号108のアミノ酸配列を有するポリペプチドは、前記配列番号68のアミノ酸配列中の1番目から20番目までのシグナルペプチドを除いた21番目から240番目までのアミノ酸配列を有するポリペプチドでカバットナンバリングに従う27e位置(カバットナンバリングに従う、配列番号108内の32番目位置;CDR−L1内部)のセリン(Ser)がトリプトファン(Trp)で置換されたものであり、一実施形態によれば、前記置換によって、抗体の活性(例えば、cMetに対する結合親和度、c−Met分解活性およびAktリン酸化抑制活性など)がより増進されうる。0081本発明の他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子(または二重特異性抗体)を用いて細胞を処理する段階を含む標的細胞膜タンパク質の除去方法を提供する。本発明のさらに他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子(または二重特異性抗体)の標的細胞膜タンパク質除去のための用途を提供する。0082前記細胞は、哺乳類、例えば、ヒト、サルなどの霊長類、またはラット、マウスなどの齧歯類から由来した全ての細胞であって、生きている細胞でありうる。前記細胞は、例えば癌細胞であってもよく、ドライバー細胞膜タンパク質、例えばc−Metタンパク質が発現する細胞でありうる。前記細胞は、生体に存在するもの、または生体から分離したものでありうる。0083一方、代表的にEGFRを含むRTKと癌細胞で共に発現するc−Metは、他のRTKとのクロストーク(crosstalk)が存在しながら、これらに対する抗癌剤耐性と関連している。したがって、c−Metと共にEGFRまたはHER2のようなRTKを阻害することができれば、既存の抗癌剤の耐性および問題点を克服した新たな機能を有する抗癌剤の開発が可能になる。0085さらに他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子(または二重特異性抗体)の薬学的有効量を癌の予防および/または治療を必要とする患者に投与する段階を含む癌の予防および/または治療方法が提供される。他の形態は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子(または二重特異性抗体)の癌の予防および/または治療のための用途が提供される。なる群より選ばれた1種以上でありうる。前記癌は、原発性癌または転移性癌でありうる。前記癌は、既存の抗癌剤、例えば前記標的細胞膜タンパク質に対する拮抗剤に対して耐性が生じた癌でありうる。0087前記薬学的組成物は、前記標的細胞膜タンパク質除去用組成物またはこれに含まれている二重結合分子(または二重特異性抗体)の薬学的有効量と、薬学的に許容される担体、希釈剤、および/または賦形剤などとともに提供されうる。なる群より選ばれた1種以上をさらに含むことができる。0089前記薬学的組成物は、経口または非経口で投与することができる。直腸内投与などで投与することができる。経口投与の時、タンパク質またはペプチドは消化されるため、経口用組成物は活性薬剤をコーティングしたり前記の分解から保護されるように剤型化しなければならない。前記組成物は、活性物質が標的細胞に移動可能な任意の装置により投与されうる。反応感応性のような要因により多様に処方されうる。いう用語は、癌の予防または治療に効果を奏する量を意味する。0091前記薬学的組成物は、本技術分野の当業者が容易に実施できる方法により、薬学的に許容される担体および/または賦形剤を用いて製剤化することによって、単位容量の形態で製造されてもよいし、または多容量容器内に内蔵させて製造されてもよい。カプセル剤形態であってもよく、分散剤または安定化剤をさらに含むことができる。個別治療剤で投与したり他の治療剤と併用して投与することができ、従来の治療剤とは順次的または同時に投与することができる。抗体または抗原結合断片を含むため、免疫リポソームで剤型化することができる。抗体を含むリポソームは、当業界に広く知られた方法により製造されうる。前記免疫リポソームは、フォスファチジルコリン、コレステロールおよびポリエチレングリコール−誘導体化されたフォスファチジルエタノールアミンを含む脂質組成物であって、逆相蒸発法により製造されうる。抗体のFab’断片は、ジスルフィド交換反応を通じてリポソームに接合されうる。ドキソルビシンのような化学治療剤が追加的にリポソーム内に含まれうる。0094前記薬学的組成物の投与対象または前記予防および/または治療方法の投与対象患者は、哺乳類、例えばヒト、サルなどの霊長類、またはラット、マウスなどの齧歯類などでありうるが、これに制限されず、既存の抗癌剤、例えば前記標的細胞膜タンパク質に対する拮抗剤に対して耐性が生じた癌患者でありうる。0095上述したとおり、本発明による標的細胞膜タンパク質の除去技術において、特定の細胞膜タンパク質の除去が可能になるためには、細胞膜タンパク質のエンドサイトーシスおよび分解(degradation)を誘発するドライバー(Driver)が細胞膜上にともに存在することが必要であり、二重結合分子(Trigger)を通じてドライバーと標的とを連結させると同時に標的がドライバーとともに細胞内にエンドサイトーシスされて分解されなければならない。ドライバーは、細胞膜タンパク質で標的細胞膜タンパク質と同一の細胞膜に存在しながら、エンドサイトーシスおよび細胞内分解が可能な分子であり、二重結合分子(Trigger)は、標的細胞膜タンパク質とドライバーに同時に高い親和度で結合可能な分子で、ドライバーのエンドサイトーシスおよび分解を誘発すると同時に標的を引っ張ってドライバーとともに分解されるようにする。0096図3は、本発明の一実施形態において使用されるドライバーとトリガー(Trigger、二重結合抗体)を模式的に示す図である。抗癌標的としてよく知られた細胞膜タンパク質であるEGFRは、細胞の表面に存在し、EGFRに対する抗体を処理しても活性が抑制されるに過ぎず、生きている細胞膜で除去されない。一実施形態で使用されるドライバーは、特定のエピトープを含むc−Met細胞膜タンパク質であり、二重結合抗体は、特定のエピトープに高い親和度で結合される二重抗体で、c−Metが細胞内に移動されても副作用(agonism)を誘発せず、効果的にc−Metを分解させることができる特性を有している。図3発明の効果0097本発明に係る標的細胞膜タンパク質の除去技術は、実際の臨床サンプルに対して次のような効果を期待することができる:1.細胞生物学分野の細胞膜タンパク質機能研究のための新たなツールの提供で細胞膜タンパク質の機能研究と関連した画期的な方法を提供し、siRNA技術のように商品化が可能である2.二重抗体パイプラインの拡充:c−Metと共に併用投与などで相乗効果が期待される2次ターゲットに対する二重抗体を製造することで、基本的にこれら抗癌ターゲットを除去できる機能を用いて新たな新規抗癌治療剤のパイプラインの拡充が可能である3.EGFR、HER2等の抗癌関連主要標的に対する効能向上:ホモダイマーとヘテロダイマーの両方を分解して癌生成機能を阻害することができる4.c−Met関連耐性克服およびc−Met治療効能が向上した抗癌剤の製造が可能である。図面の簡単な説明0098一実施形態に係る細胞膜における標的特異的な特定の細胞膜タンパク質の除去原理を示す模式図である。一実施形態に係る細胞膜における標的特異的な特定の細胞膜タンパク質の除去原理を示す模式図である。一実施形態に係る細胞膜タンパク質の除去システム(二重特異性抗体:BsAb)の構成要素を示す模式図である。MKN45胃癌細胞株における抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるc−Met分解率を示すグラフである(Y軸:対照群(media)に対する相対的c−Met量;X軸:L3−1YIgG2:抗c−Met抗体、ME−01、ME−03:c−Met/EGFR二重特異性抗体、MH2−01:c−Met/HER2二重特異性抗体)。MKN45胃癌細胞株における抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるEGFR分解を示す蛍光画像である(黄色:抗−c−Met/EGFR二重特異性抗体;赤色:抗−c−Met抗体;緑色:抗−EGFR抗体)。MKN45胃癌細胞株における抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるEGFRの細胞内移動および分解を抗EGFR抗体(ICR62)単独または融合していない抗c−Met抗体と抗EGFR抗体(ICR62)をともに投与した場合と比較して示す蛍光画像である(黄色:抗−c−Met/EGFR二重特異性抗体;赤色:抗−c−Met抗体;緑色:抗−EGFR抗体)。MKN45胃癌細胞株における抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるEGFRの細胞内移動および分解を抗c−Met抗体単独または融合していない抗c−Met抗体と抗EGFR抗体(ICR62またはErbitux)をともに投与した場合と比較して示す蛍光画像である(黄色:抗−c−Met/EGFR二重特異性抗体;赤色:抗−c−Met抗体;緑色:抗−EGFR抗体)。EBC−1肺癌細胞株における抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるEGFRの細胞内移動および分解を抗c−Met抗体または抗EGFR抗体単独または融合していない抗c−Met抗体と抗EGFR抗体(ICR62またはErbitux)をともに投与した場合と比較して示す蛍光画像である(黄色:抗−c−Met/EGFR二重特異性抗体;赤色:抗−c−Met抗体;緑色:抗−EGFR抗体)。MKN45胃癌細胞株(上段)およびEBC−1肺癌細胞株(下段)における抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるEGFRの総量および活性をウエスタンブロッティングで試験した結果を示す図である。c−Metの発現が低いA431癌細胞株における抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるEGFRの総量および活性をウエスタンブロッティングで試験した結果を示す図である。HCC827肺癌細胞株およびHCC827エルロチニブ耐性細胞株(HCC827ER)におけるc−Met発現量増加によるEGFR分解をウエスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。MKN45胃癌細胞株における抗c−Met/Her2二重特異性抗体によるHER2の特異的分解をウエスタンブロッティングで確認した結果を示す図である。c−Met発現が低いA549癌細胞株でc−Metを過発現させた後の抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるEGFR分解誘導の効果を示す蛍光画像である。c−Met発現が低いHeLa細胞株でc−Metを過発現させた後の抗c−Met/EGFR二重特異性抗体によるEGFR分解誘導の効果を示す蛍光画像である。huAbF46抗体のエピトープマッピングのためのELISAの結果を示すグラフである。SEMAドメイン上のhuAbF46抗体のエピトープの位置を確認した模式図である。実施例0099以下、一つ以上の具体的な例を実施例を通じてより詳細に説明する。これら実施例は、一つ以上の具体的な例を説明するためのものであり、発明の範囲がこれら実施例に限定されない。Inc.)の腹腔内に注射した。adjuvant)と混合してマウスの腹腔内に注射した。その1週間後に最後のブースティング(boosting)を行い、さらに3日後、前記マウスの尻尾から採血して血清を得た後、1/1000の希釈倍率でPBSを用いて希釈し、ELISA法によりc−Metを認識する抗体の力価が増加することを確認した。上記の結果から、抗体の量が十分に得られるマウスを選別して下記の細胞融合過程を行った。Inc.)の腹腔内に注射し、免疫化されたマウスを麻酔した後、体の左側に位置する脾臓を摘出した。摘出した脾臓をメッシュで粉砕して細胞を分離し、培養培地(DMEM、GIBCO、Invitrogen)と混合して脾臓細胞懸濁液を調製した。前記懸濁液を遠心分離して細胞層を回収した。上記で得られた脾臓細胞1×108個と骨髄腫細胞(Sp2/0)1×108個とを混合した後、遠心分離して細胞を沈殿させた。遠心分離された沈殿物を徐々に分散させ、ポリエチレングリコール(PEG)の45%DMEM溶液(1ml)で処理し、37°Cで1分間維持させた後、培養培地(DMEM)1mlを添加した。以降、培養培地(DMEM)10mlを1分間添加し、37°Cの水で5分間放置した後、50mlに合わせて再び遠心分離した。培養して、ハイブリドーマ細胞群を作製した。前記参考例1.1.2で製造されたハイブリドーマ細胞群のうち、c−Metタンパク質にのみ特異的に反応する抗体を産生するハイブリドーマ細胞を選別するために、ヒトのc−Met/Fc融合タンパク質とヒトのFcタンパク質を抗原として用いたELISA分析方法を用いてスクリーニングを行った。0103マイクロタイタープレートにヒトのc−Met/Fc融合タンパク質を1ウェル当たり、それぞれ50μl(2ug/ml)ずつ加えてプレート表面に付着させ、反応しない抗原は洗浄して除去した。c−MetでないFcに結合される抗体を選別して除外するために、ヒトのFcタンパク質を上記と同様な方法でプレート表面に付着させた。0104前記参考例1.1.2で得られたハイブリドーマ細胞の培養液を前記準備されたそれぞれのウェルに50μlずつを加えて1時間反応させた後、リン酸緩衝溶液−Tween20(TBST)溶液で十分に洗浄して反応しない培養液を除去した。ここにヤギ抗−マウスIgG−ホースラディッシュペルオキシダーゼを加えて1時間かけて室温で反応させた後、TBST溶液で十分に洗浄した。ペルオキシダーゼの基質溶液(OPD)を加えて反応させ、ELISAリーダーを用いて450nmにおける吸光度を測定することにより、その反応の程度を確認した。0105上記のような反応の程度の確認によって、ヒトのFcには結合せず、ヒトのc−Metタンパク質にのみ特異的に高い結合力を有する抗体を分泌するハイブリドーマ細胞株を反復して選別した。dilution)してモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ細胞株1個のクローンを最終的に得た。寄託して受託番号KCLRF−BP−00220が与えられた(韓国公開特許第2011−0047698参照)。本明細書では、当該ハイブリドーマによって産生されるマウス抗体を「AbF46」と称する。前記参考例1.1.3で得たハイブリドーマ細胞を無血清培地で培養し、培養液からモノクローナル抗体を産生し、精製した。0108以降、遠心分離して、抗体を産生する細胞を除去し、抗体が分泌された培養液を分離して、4°Cにて保管するか、直ちに集めて抗体の分離精製に使用した。Healthcare)を用いて前記準備された培養液50ml〜300mlから抗体を純粋精製した後、タンパク質凝集用フィルター(Amicon)を使用してPBSで上層液を置換して精製された抗体を保管し、以降の実施例に使用した。region)がヒトIgG1抗体の配列で置換されてなるキメラ抗体chAbF46を作製した。sequence−VL−BsiWI−CL−TGA−XhoI」(配列番号39)から構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成した。No.8300−01)に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するDNA断片(配列番号39)をそれぞれEcoRI(NEB、R0101S)およびXhoI(NEB、R0146S)制限酵素を用いてクローニングすることによって、キメラ抗体の発現のための重鎖を含むベクターおよび軽鎖を含むベクターをそれぞれ構築した。System(invitrogen)を用いて行った。Mediumを培地として使用して浮遊培養方式で培養を行った。1×106細胞/mlになったときに一過性発現を行った。SFM2mlとを混合(チューブB)した後、(チューブA)と(チューブB)とを混合して15分間インキュベーション(incubation)した。その後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、37°C、80%湿度、8%CO2、130rpmの培養器内で5日間培養した。0112以降、10%(v/v)FBSが添加されたDMEM培地で37°C、5%CO2条件下で5時間培養した後、FBSが添加されていないDMEM培地で48時間にかけて37°C、5%CO2条件下で培養した。healthcare)を用いて精製した。Scientific、21004)で溶出させた。得られた溶出物をPBSバッファーで交換して最終的にAbF46のキメラ抗体(以下、chAbF46と命名する)を精製した。Blast/)を通じて前記参考例1.2で精製されたマウス抗体AbF46のVH遺伝子と最も相同性が高いヒトの生殖腺遺伝子を分析した。その結果、VH3−71がアミノ酸レベルで83%の相同性を有することを確認し、マウス抗体AbF46のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体AbF46のCDR部分がVH3−71のフレームワークに導入されるようにデザインした。この際、30番目(S→T)、48番目(V→L)、73番目(D→N)、78番目(T→L)のアミノ酸はもとのマウスAbF46抗体のアミノ酸配列に対して逆突然変異(back−mutation)させた。以降、H1は追加的に83番目(R→K)と84番目(A→T)アミノ酸に突然変異を与えて最終的にH1−heavy(配列番号40)とH3−heavy(配列番号41)を構築した。subtypeを用いてカバットナンバリングで定義されたマウス抗体AbF46のCDR−H1、CDR−H2、CDR−H3を導入した。これを通じてH4−heavy(配列番号42)を構築した。Blast/)を通じて、マウス抗体AbF46のVL遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した。その結果、VK4−1がアミノ酸レベルで75%の相同性を有することを確認し、マウス抗体AbF46のCDR−L1、CDR−L2、CDR−L3をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体AbF46のCDR部分がVK4−1のフレームワークに導入されるようにデザインした。この際、H1−lightは、36番目(Y→H)、46番目(L→M)、49番目(Y→I)の3個のアミノ酸を逆突然変異させ、H2−lightは、49番目(Y→I)の1個のみのアミノ酸を逆突然変異させて構築した。0117H3−light(配列番号45)のデザインのために、Blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/IgBlast/)を通じてマウス抗体AbF46のVL遺伝子と最も相同性が高いヒト生殖腺遺伝子を分析した結果の中で、前記VK4−1以外にVK2−40を選定した。マウス抗体AbF46VLとVK2−40は、アミノ酸レベルで61%の相同性を有することを確認し、マウス抗体AbF46のCDR−L1、CDR−L2、CDR−L3をカバットナンバリングで定義し、マウス抗体AbF46のCDR部分がVK4−1のフレームワークに導入されるようにデザインした。この際、H3−lightは、36番目(Y→H)、46番目(L→M)、49番目(Y→I)の3個のアミノ酸を逆突然変異させて構築した。subtypeを用いてカバットナンバリングで定義されたマウス抗体AbF46のCDR−L1、CDR−L2、CDR−L3を導入した。この際、H4−lightは、36番目(Y→H)、46番目(L→M)、49番目(Y→I)の3個のアミノ酸をさらに逆突然変異させて構築した。Kitに、前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するDNA断片(H1−light;配列番号50、H2−light;配列番号51、H3−light;配列番号52、H4−light;配列番号53)をそれぞれEcoRI(NEB、R0101S)およびXhoI(NEB、R0146S)制限酵素を使用してクローニングすることによって、ヒト化抗体の発現のためのベクターを構築した。System(invitrogen)を用いて行った。1×106細胞/mlになったときに一過性発現を行った。SFM2mlを混合(チューブB)した後、(チューブA)と(チューブB)とを混合して15分間インキュベーションした。その後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、37°C、80%湿度、8%CO2、130rpmの培養器内で5日間培養した。healthcare)を用いて精製した。Scientific、21004)で溶出した。これをPBSbufferで交換して最終的にAbF46のヒト化抗体(以下、huAbF46と命名する)を精製した。以降の実施例で用いたヒト化抗体huAbF46の重鎖、軽鎖の組み合わせはH4−heavy(配列番号42)およびH4−light(配列番号46)である。01221.4.huAbF46抗体のscFvライブラリーの作製huAbF46抗体の重鎖可変領域および軽鎖可変領域を用いてhuAbF46抗体のscFvを作製するための遺伝子をデザインした。それぞれ重鎖可変領域および軽鎖可変領域を「VH−リンカー−VL」の形態になるようにし、前記リンカーは「GLGGLGGGGSGGGGSGGSSGVGS」(配列番号54)のアミノ酸配列を有するようにデザインした。このようにデザインされたhuAbF46抗体のscFvをコードするポリヌクレオチド(配列番号55)をBioneer社に依頼して合成し、これを発現させるためのベクターのヌクレオチド配列を配列番号56に示した。0123以降、前記ベクターから発現した結果物を分析して、c−Metに特異的な結合力を示すことを確認した。されたマウス抗体AbF46から「カバットナンバリング」により定義した。それぞれのCDRは下記表1のとおりである。01250126抗体CDRのランダム配列導入のために次のとおりプライマーを作製した。既存のランダム配列導入方式は、突然変異を与えようとする部位に同一比率の塩基(25%A、25%G、25%C、25%T)が導入されるようにNコドンを用いたが、本実施例ではhuAbF46抗体のCDRにランダムに塩基を導入するために、各CDRのアミノ酸をコードする3個の野生型ヌクレオチド中の1番目と2番目のヌクレオチドの85%はそのまま保存し、残りの3個の塩基をそれぞれ5%ずつ導入する方法を取った。3番目のヌクレオチドは同一に(33%G、33%C、33%T)導入されるようにプライマーをデザインした。01271.5.2.huAbF46抗体のライブラリー作製およびc−Metに対する結合力の確認CDRのランダム配列導入を通じた抗体ライブラリー遺伝子の構築を、前記参考例1.5.1のような方法で作製されたプライマーを用いて行った。PCR)方法を通じて、所望のCDRのみがそれぞれ突然変異したhuAbF46抗体のscFvライブラリー遺伝子を得て、作製された6個のCDRをそれぞれ標的とするライブラリーを構築した。図10128このように作製されたライブラリーは、野生型と各ライブラリーのc−Metに対する結合力を確認しており、それぞれのライブラリーは、野生型に比べてc−Metに対する結合力がだいぶ低くなる傾向を示したが、一部c−Metに対する結合力は維持される突然変異を確認した。前記構築されたライブラリーからc−Metに対するライブラリーの結合力を向上させた後、それぞれの個別クローンからscFvの遺伝子配列を分析した。得られた遺伝子配列はそれぞれ下記表2のとおりであり、これをIgG形態で変換した。下記クローンのうち、L3−1、L3−2、L3−3、L3−5から生産された4種の抗体を選別して後続の実験を行った。アミノ酸が変更されなかったため、huAbF46抗体の重鎖をそのまま使用した。ヒンジ領域は、ヒトIgG1のヒンジでなく、U6−HC7ヒンジ(配列番号57)で置換した。軽鎖は、「EcoRI−シグナル配列−VL−BsiWI−CL−XhoI」から構成されるようにそれぞれデザインして遺伝子を合成し、親和性成熟後に選別された前記4種の抗体の軽鎖可変領域を含んでコードするポリヌクレオチド(配列番号58〜配列番号61)をBioneer社に依頼して合成した。No.8300−01)に前記軽鎖に相当するヌクレオチド配列を有するDNA断片(L3−1由来CDR−L3を含むDNA断片:配列番号58、L3−2由来CDR−L3を含むDNA断片:配列番号59、L3−3由来CDR−L3を含むDNA断片:配列番号60、L3−5由来CDR−L3を含むDNA断片:配列番号61)をそれぞれEcoRI(NEB、R0101S)およびXhoI(NEB、R0146S)制限酵素を用いてクローニングすることによって、親和性成熟した抗体の発現のためのベクターを構築した。System(invitrogen)を用いて行った。Mediumを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。1×106細胞/mlになったときに一過性発現を行った。SFM2mlとを混合(チューブB)した後、(チューブA)と(チューブB)とを混合して15分間インキュベーションした後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、37°C、80%湿度、8%CO2、130rpmの培養器内で5日間培養した。healthcare)を用いて精製した。Scientific、21004)で溶出した。これをPBSbufferで交換して最終的に親和性成熟した4種の抗体(以下、huAbF46−H4−A1(L3−1由来)、huAbF46−H4−A2(L3−2由来)、huAbF46−H4−A3(L3−3由来)、およびhuAbF46−H4−A5(L3−5由来)と命名する)を精製した。前記参考例1.7で選別された4種の抗体のうち、c−Metとの結合親和性が最も高く、Aktリン酸化およびc−Met分化程度が最も低いという測定結果を示したhuAbF46−H4−A1を対象に、ヒンジ領域のみ、または不変領域およびヒンジ領域が置換された抗体を作製した。前記3種の抗体は、生産量増大のためにヒトのカッパ不変領域からなる軽鎖の36番目のヒスチジンを全てチロシン(tyrosine)で置換した。0136前記3種の抗体を作製するために、huAbF46−H4−A1の重鎖可変領域、U6−HC7ヒンジおよびヒトのIgG1不変領域からなるポリペプチド(配列番号62)をコードするポリヌクレオチド(配列番号63)、huAbF46−H4−A1の重鎖可変領域、ヒトのIgG2ヒンジおよびヒトのIgG1不変領域からなるポリペプチド(配列番号64)をコードするポリヌクレオチド(配列番号65)、huAbF46−H4−A1の重鎖可変領域、ヒトのIgG2ヒンジおよびヒトのIgG2不変領域からなるポリペプチド(配列番号66)をコードするポリヌクレオチド(配列番号67)、36番目のヒスチジンがチロシンで置換されたhuAbF46−H4−A1の軽鎖可変領域およびヒトのカッパ不変領域からなるポリペプチド(配列番号68)をコードするポリヌクレオチド(配列番号69)をBioneer社に依頼して合成した。No.8300−01)に前記軽鎖に相当する塩基配列を有するDNA切片を挿入して、前記抗体の発現のためのベクターを構築した。System(invitrogen)を用いて行った。Mediumを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。1×106細胞/mlになったときに一過性発現を行った。SFM2mlを混合(チューブB)した後、(チューブA)と(チューブB)とを混合して15分間インキュベーションした後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、37°C、80%湿度、8%CO2、130rpmの培養器内で5日間培養した。healthcare)を用いて精製した。Scientific、21004)で溶出した。