CLIPSTMtechnology.J.Mol.Recognit.20:283−00)。Scaffolds)と呼ばれる‘PepScan’社固有の構造を有するペプチドを作製する方法であって、huAbF46抗体を対象に線状ペプチドおよびCLIPSペプチドの全てに対して結合力を測定した。CLIPSペプチドは、3個のシステインがループを形成した構造をペプチドに付与する。T2T3またはT2T2のような結合型ペプチドを作製することもできる。0140エピトープマッピングのために総6063個のペプチドを作製し(ペプチドアレイの作製はPepScan社に依頼)、1〜529番のペプチドは、典型的な線状ペプチドであって、一部領域がオーバーラッピング(overlapping)されるように15個のアミノ酸長で作製された。CLIPSペプチドに1〜529番のペプチドを導入して作製した。CLIPSペプチドに15個のアミノ酸を有するペプチド2個を連結して総956個を作製した。2015〜6063番ペプチドは、8乃至35個のアミノ酸残基を有するペプチドグループ間の結合を通じて線状および非連続的な構造を有するエピトープを探すためのペプチドで、総4048個が作製された。CLIPSペプチドを含むペプチドアレイは、次のような方法で作製する。CLIPSペプチドが含まれている1,3−ビス(ブロモメチル)ベンゼン溶液をアンモニウムビカーボネート(20mM、pH7.9)/アセトンニトリル(1:1(v/v))に溶解させ、前記結果物溶液をペプチドアレイに添加した。前記CLIPS鋳型は、ペプチドアレイ(3ulのウェルを有する455個のウェルプレート)の固相結合されたペプチド内に存在する2個のシステインの側鎖に結合する。前記溶液が完全に覆われるように30〜60分間かけて前記溶液内でペプチドアレイを徐々に振る。最後に、前記ペプチドアレイを過量の水で十分に洗浄し、PBS(pH7.2)内に1%SDS/0.1%β−メルカプトエタノールが含まれている破砕−緩衝液で30分間かけて70°Cの温度条件で超音波粉砕した後、45分間水で追加的に超音波粉砕を行った。CLIPSペプチドは、前記方法と同一であるが、3個のシステインの側鎖に結合するようにする。0142前記ペプチドを用いてELISAを通じてエピトープマッピングを行った結果、huAbF46の核心エピトープは、c−Metタンパク質の168番目アミノ酸から171番目アミノ酸からなるペプチドであるEEPSQ(配列番号73)であることを確認することができた。01432)huAbF46抗体のエピトープマッピング(mapping)のためのELISA分析エピトープマッピングのために総529個の線状ペプチドおよびCLIPSペプチドを用いてPEPSCANベースのELISA分析を行った。前記ペプチドは、5%ブロッキング溶液(4%卵アルブミン(ovalbumin)、5%ウマ血清および1%のTween80)を用いて30分間常温で反応させた。以降、1%のTween80が添加されたPBSで4°Cで一晩中反応させた1〜100μg/ml範囲のhuAbF46抗体を前記ペプチドに反応させた後、洗浄した。以降、ウサギ抗ヒツジ抗体(SIGMA)で処理し、PBSで洗浄した後、ペルオキシダーゼが付着されたブタ抗ウサギ抗体(SIGMA)で処理し、PBSで洗浄した。以降、3%のH2O2に2μl/mlのペルオキシダーゼ2,2’−アジノ−ジ−3−エチルベンズチアゾリンスルホネート(ABTS)(SIGMA)で処理し、1時間後に発色反応を測定した。epitope)を全て認識する抗体であることを確認することができた。SEMA部位の代表的な突然変異であるE168D変異が形成されたポリペプチドを用いて上記と同様な方法でELISAを行った結果、下記表3のような結果を得た。SEMAには結合できず、したがって、前記抗体は癌発病情報を提供するための診断方法に利用可能であることを意味する。前記実験から、huAbF46抗体は、c−Metタンパク質の168番目アミノ酸から171番目のアミノ酸からなるペプチドの「EEPSQ」配列を含む線状ペプチドおよびCLIPSペプチドの全てにおいて、非特異的な反応なしに特異的な結合反応を示した。4.1(NCBI))、図16に示したように、huAbF46抗体のエピトープは、SEMAドメインに位置し、HGFの結合部位でも、直接的な結合部位と近い方のループ(loop)に相当する位置であることを確認することができた。Scanning結果分析EEPSQ配列の各アミノ酸部位を元来のアミノ酸でない他の20種のアミノ酸で置換し、これらそれぞれのペプチドがhuAbF46抗体との結合力に如何なる変化が発生するかを7種のペプチドアレイを通じて詳細に分析した。0150分析の結果、EEPSQのアミノ酸配列中のいずれのアミノ酸が前記抗体の結合に重要であるかを確認し、特に前段のEEP配列が抗体の結合に非常に重要な要素であることを確認することができた。healthcare)を用いて測定した。CM5チップ上にhuAbF46抗体を約80〜110RUだけ固定させた後、抗原である前記配列番号132〜配列番号137のペプチドを100nMから0.39nMまでの濃度範囲内で互いに異なる9個の濃度で、且つ30μl/minの速度で注入して、下記表4のようにkon値とkoff値を求め、これからKD値を計算した。その結果、アミノ酸が置換されたペプチドにはhuAbF46抗体が結合できず、このような結果を通じて「EEPSQ」配列がhuAbF46抗体における必須のエピトープであることを確認することができた。01520153参考例2:抗EGFRscFvの作製EGFRに結合する抗体の配列は、抗EGFR抗体のscFv配列に基づいて重鎖可変部位と軽鎖可変部位の間に(G4S)3リンカーペプチドを入れて作製した。(Bioneer社に依頼)でヒト化抗EGFR抗体の重鎖可変部位(配列番号109)コードDNA配列(配列番号110)と軽鎖可変部位(配列番号111)コードDNA配列(配列番号112)との間に(GGGGS)3リンカーペプチドコードDNA配列を添加して抗EGFR抗体のscFvをコードするDNAを合成した。(配列番号109)の51番目のアミノ酸FをIで置換し、62番目のアミノ酸QをSで置換し、軽鎖可変部位(配列番号111)の46番目のアミノ酸RをLで置換し、83番目のアミノ酸FをEで置換したことを除いては、上記と同様な方法で1次変形された抗EGFRscFvを作製した。このような変形で抗体の熱安定性を増進させることができる。scFv(重鎖可変部位:配列番号113;軽鎖可変部位:配列番号114)を作製した。(pharmacokinetics)を改善させることができる。前記抗体内のアミノ酸の位置は、カバットナンバリングに従った。scFvを下記の二重特異性抗体の作製に使用した。scFvの作製Her2に結合するscFv抗体の配列は、トラスツズマブ(ハーセプチン)の配列に基づいて重鎖可変部位と軽鎖可変部位との間にペプチドリンカー(G4S)3を入れて作製した。(Bioneer社)で抗HER2抗体(ハーセプチン)の重鎖可変部位(配列番号115)コードDNA配列(配列番号116)と軽鎖可変部位(配列番号117)コードDNA配列(配列番号118)との間に(GGGGS)3リンカーコードDNA配列を添加して抗HER2抗体のscFvコードDNAを合成した。scFv)を下記の二重特異性抗体の作製に使用した。その融合過程は次のとおりである。Kitに前記軽鎖に該当するDNA断片を挿入した。以降、pcDNATM3.3に挿入されたL3−1Y−IgG2のFcのC末端に前記参考例2で作製された抗EGFRscFvを(G4S)2からなる10個のアミノ酸長を有するリンカーペプチドを用いて融合することによって二重特異性抗体の発現のためのベクターを構築した。System(invitrogen)を用いて行った。Mediumを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。1×106細胞/mlになったときに一過性発現を行った。SFM2mlを混合(チューブB)した後、(チューブA)と(チューブB)とを混合して15分間インキュベーションした後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、37°C、80%湿度、8%CO2、130rpmの培養器内で5日間培養した。healthcare)を用いて精製した。Scientific、21004)で溶出した。これをPBSbufferで交換して最終的に抗cMet/抗EGFR二重特異性抗体を精製した。scFvが融合された抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体をME−03Sと命名した。T100(GE)を用いて確認した。healthcare)をCM5チップ(♯BR−1005−30、GE)の表面に製造会社の説明書に従って固定化させた。Systems)を前記捕捉された抗体に注入した。ここに10mMのグリシン−HCl(pH1.5)溶液を注入して前記表面を再生させた。software)を用いてフィッティングした。0164前記得られた結果を下記の表5に示した。01650166表5に示したように、前記製造された抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体は、2種の抗原に全て結合することを確認することができた。その融合過程は次のとおりである。Kitに前記抗cMet抗体L3−1Y−IgG2の軽鎖に相当する塩基配列(配列番号68)を有するDNA断片を挿入した。scFvコードDNAを(GGGGS)2からなるペプチドリンカーのコードDNA配列を用いて融合することによって二重特異性抗体の発現のためのベクターを構築した。System(invitrogen)を用いて行った。Mediumを培地として用いて浮遊培養方式で培養を行った。1×106細胞/mlになったときに一過性発現を行った。SFM2mlを混合(チューブB)した後、(チューブA)と(チューブB)とを混合して15分間インキュベーションした後、一日前に準備した細胞に混合液を徐々に混合した。形質導入の完了後、37°C、80%湿度、8%CO2、130rpmの培養器内で5日間培養した。healthcare)を用いて精製した。Scientific、21004)で溶出した。これをPBSbufferで交換して最終的に抗cMet/抗HER2二重特異性抗体を精製した。scFvが融合された抗c−Met/抗HER2二重特異性抗体をMH2−01と命名した。T100(GE)を用いて確認した。healthcare)をCM5チップ(♯BR−1005−30、GE)の表面に製造会社の説明書に従って固定化させた。Systems)を前記捕捉された抗体に注入した。ここに10mMのグリシン−HCl(pH1.5)溶液を注入して前記表面を再生させた。software)を用いてフィッティングした。0173前記得られた結果を表6に示した。前記実施例1.1および1.2で作製された抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体および抗c−Met/抗HER2二重特異性抗体の癌細胞の増殖抑制効果を胃癌細胞株であるMKN45を用いて確認した。0176全ての細胞株は、RPMI1640培地(♯11875−093、Gibco)に10%(v/v)FBSと1%(v/v)ペニシリン−ストレプトマイシンを添加して5%CO2および37°Cの条件で培養した。0177前記実施例1.1および1.2で作製された抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体のc−Metタンパク質の分解の程度を確認するために、相対的な総c−Met量を測定した。相対的な総c−Met量を測定するのは、抗体がc−Metに結合して内在化を起こしてc−Metの分解を引き起こすという事実を利用して、総c−Met量の増減を把握することにより抗体の効能を検査するためである。JCRB細胞バンク)2×105細胞/mlと前記実施例1で作製された抗体5μg/mlを96ウェルプレートに同時にアプライした後、24時間培養した。Systems、DYC358)を用いて総c−Met量の変化を測定した後に分析した。0179前記得られた結果を図4に示した。図4に示されているように、c−Metが過発現される細胞であるMKN45胃癌細胞株を抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体ME−01およびME−03で処理することによって、c−Metの86.8%および88.4%が分解されることが観察された。抗c−Met/抗Her二重特異性抗体MH2−01で処理することによって、c−Metの約80%が分解されることが観察された。抗c−Metドメインである抗c−Met抗体L3−1YおよびL3−1YIgG2を単独処理した場合のc−Met分解活性と比較して顕著に増進されたものである。このような結果は、抗c−Met抗体が抗EGFR抗体(scFv)または抗HER2抗体(scFv)との融合により上昇したc−Met分解活性を有することを示す。JCRB細胞バンク)を2×104細胞/ウェルの量で準備し、ここにL3−1Y−IgG2(参考例1)、抗EGFRモノクローナル抗体(下記参照)、および抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体ME−03(実施例1.1)をそれぞれ単独処理または併用処理の方法で各ウェル当たり5μg/mlの濃度になるように添加して4時間かけて37°Cで処理した。併用投与の場合にも各抗体を5μg/mlの濃度で添加した。対照群として、抗体処理なしにPBSのみを処理した群を準備した。ここに4%(v/v)ホルムアルデヒドを15分間処理して細胞をプレートに固定させ、PBSで3回洗浄した。x−100および5%のロバ血清)を常温で1時間処理した。signaling)に対する1次抗体を1:100に希釈して100μlの量で15時間かけて4°Cで処理した。lab)でプレートを準備した。前記準備された細胞を共焦点顕微鏡(Zeiss、LSM710)で細胞を観察した。FcのN末端に融合させて作製したものである。0182前記得られた結果を図5に示した。図5に示されているように、細胞膜上にc−Metが過発現された状態で抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体を処理すると(右側)、標的細胞膜タンパク質であるEGFRが細胞内に移動および分解されることが観察された。c−Metに対するモノクローナル抗体を処理した場合には、EGFRの細胞内移動は観察されなかった。ab)処理によっても何ら変化がなかった。これは抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体によって細胞膜に位置するEGFRが細胞内に移動して分解されることを裏付ける結果である。ab)、L3−1Y−IgG2(参考例1)、および抗c−Met/抗EGFR二重特異性抗体ME−03(実施例1.1)をそれぞれ単独処理または併用処理の方法で各ウェル当たり5μg/mlの濃度になるように(併用投与の場合、各抗体の濃度がそれぞれ5μg/mlになるように添加)処理し、前記図5の結果を得た方法と同様な方法で実験を行った。図50184前記得られた結果を図6に示した。形態でなく、単純に複合して処方する場合には、EGFRの細胞内移動および分解が誘発されない反面、抗cMet/抗EGFR二重特異性抗体(ME−03)で処理した場合には、EGFRの細胞内移動および分解が誘発されることが確認された。これは、EGFRの細胞内移動および分解が誘発される理由は、ドライバーとして作用するc−Metと抗cMet/EGFR二重特異性抗体(ME−03)を用いた細胞膜タンパク質除去システムが作用したためと説明されうる。反面、それぞれのモノクローナル抗体を併用処理する場合にはEGFRの細胞内位置には何ら変化がなく、c−Metモノクローナル抗体(L3−1Y−IgG2)処理時にはc−Metのみが細胞内に移動/分解されるのが観察される。図60185MKN45胃癌細胞株での多様な抗c−Met抗体、抗EGFR抗体、およびこれらの併用処理と、抗c−Met/EGFR二重特異性抗体の処理時の細胞膜タンパク質(EGFRおよびc−Met)の細胞内位置変化を観察した。ページトップへこの技術を出願した法人この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedInこの技術を発明した人物この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedInページトップへ関連する挑戦したい社会課題この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedIn環境にやさしいエネルギーを実現する環境にやさしいエネルギーの実現は、経済成長と環境や健康面への配慮を両立させる社会につながります。発電やエネルギー創出時の環境への影響は、大気汚染などの健康被害にもつながり、また人命にかかわる気...最終更新日:2018/06/13放射性廃棄物のない社会を実現する放射性廃棄物のない社会を実現することで、安心・安全な地球環境を実現しながらリスクの少ない電力創出が可能になると考えられています。2019/10/03)【課題】オレキシン2型受容体作動活性を有する複素環化合物を提供すること。【解決手段】式(I):[式中、各記号は明細書記載のとおりである。