以上の結果から、実施例2以降は、細菌の増殖状態に相関して集積が変化し、かつ細菌の増殖活動が盛んな対数増殖期における集積量が最も多い3H-L-Alaを使用した。0038[アミノ酸のタンパク質への組込み率の解析]細菌が取り込んだアミノ酸をどのように利用しているのかについて調べるため、集積したアミノ酸のタンパク質への組込み率を評価した。FILTERを100°C下で1時間加熱処理することによりタンパク質を固定し、放射能を測定した。測定した放射能を「タンパク画分」への組込み率として評価した。菌体内に集積した3H-L-Alaのうち、タンパク質合成系に組み込まれた3H-L-Alaの割合を「タンパク(質)画分」、タンパク質以外の代謝産物として存在する3H-L-Alaの割合を「タンパク(質)画分以外」とした。各培養時間において、実施例1で測定した菌体内に集積した3H-L-Alaの放射能を100%とし、実施例2で測定した「タンパク画分」の3H-L-Alaの放射能から「タンパク画分」及び「タンパク画分以外」の割合(%)を算出し、「タンパク画分」の割合を「3H-L-Alaのタンパク質への組込み率(%)」とした。protein(μg/mL)により評価した。coliK-12由来株の各増殖期において菌体内に集積した3H-L-Alaのタンパク質への組込み率を検討した結果を図5に示す。誘導期(培養開始後2時間)の細菌において3H-L-Alaのタンパク質への組込み率が最も高くなり、約50%であった。増殖が進むにつれ3H-L-Alaのタンパク質への組込み率は減少し、対数増殖期から定常期(培養開始後4〜24時間)においては約10〜35%と低値を示した。K-12由来株の活動状態の変化に対する3H-L-Alaの集積の変化を評価した。詳しくは、大腸菌の増殖が停止した状態となる16°Cの低温で培養することにより、増殖の準備段階である誘導期の状態を延長させた。37°Cに温度変更して増殖を開始させ、増殖開始前後における細菌の活動状態及び3H-L-Alaの集積変化の関連性を評価した。rpm下で振盪培養を行った。培養開始後2、4、6、8又は12時間の時点で実施例1の方法により3H-L-Alaとのインキュベーションを行い、回収した菌体について実施例1の方法により菌体内に集積した3H-L-Alaの放射能を測定した。前記16°Cでの12時間培養の後、培養温度を37°Cに変更し、細菌の増殖を開始させて、増殖開始後2、4、6、8又は12時間(培養開始後14、16、18、20又は24時間)の時点で実施例1の方法により3H-L-Alaとのインキュベーションを行い、回収した菌体について実施例1の方法により菌体内に集積した3H-L-Alaの放射能を測定した。(37°C培養開始後2〜6時間)、細菌の増殖が最も活発な対数増殖期(37°C培養開始後6時間)に最大集積を示した。0044[阻害剤負荷による3H-L-Alaの集積変化の評価]集積に関与する集積機構の特徴を調べるため、L-alanine及びL-alanineと似た構造を持つglycineを集積阻害剤として負荷した場合の各増殖期における3H-L-Alaの集積変化を評価した。tesque)を用いた。実施例1の方法により前培養及び本培養を行った。分間インキュベーションした。インキュベーション後、実施例1と同様の方法によりPBS5mLで菌体を3回洗浄し、液体シンチレーションカウンターにて菌体内に集積した放射能を測定した(図6-a)。(コントロール)の3H-L-Alaの集積に対する各阻害剤負荷時の3H-L-Alaの集積を検討した。controlにより評価した(図6-b)。コントロールの集積率から各阻害剤負荷時の集積率を差し引くことで、3H-L-Alaの集積における各集積機構の集積寄与率を評価した(図6-c)。0046(結果)3H-L-Alaの集積変化の結果を図6-aに示す。glycineを負荷した場合において、特に対数増殖期(培養開始後6時間)の集積が低下し、コントロールと比較して約70%の低下を示した。(培養開始後6〜24時間)において90%以上と顕著に高かった(図6-b及びc)。そのうちglycineと共通の集積機構の集積寄与率が約50〜75%を示し、glycineとは無関係のL-alanine特異的な集積機構の集積寄与率は約20〜40%であった(図6-c)。0047[各増殖期における標識天然アミノ酸及び3H-2DGの菌体内への取り込みの評価]現在がん診断に用いられている18F-FDGと集積機序が同じであるグルコース誘導体[1,2-3H]-2-deoxy-D-glucose等について、各増殖期における集積を評価した。Chemicals)を用いた。(3H-2DG)を用いた。K-12由来株を37°C、好気条件下で14時間培養した。rpm下で振盪培養(本培養)した。rpmの振盪条件下で5分間インキュベーションした。gの条件下で5分間遠心し菌体を回収した。mLで菌体を3回洗浄した。mLにより菌体を懸濁した。mLとを混和後、液体シンチレーションカウンターで菌体内に集積した標識天然アミノ酸の放射能を測定した。FILTERを100°C下で1時間加熱処理することによりタンパク質を固定し、放射能を測定した。測定した放射能を「タンパク画分」への組込み量として評価した。菌体内に集積した3H-L-Alaのうち、タンパク質合成系に組み込まれた標識アミノ酸の割合を「タンパク(質)画分」とした。0051(結果)集積実験の結果を図7に示す。3H-L-Tyr及び3H-L-Metの集積は対数増殖期に高くなり、3H-L-His及び3H-2DGの集積は定常期に高くなることが明らかとなった。誘導期は全ての放射性トレーサーで低い集積となった。3H-L-Tyrでは、最も菌数が多い定常期と最も菌数が少ない誘導期とが同程度の集積となった。組込み量算出実験の結果を図8に示す。3H-L-Tyr及び3H-L-Metの組込み量は対数増殖期に高くなり、3H-L-Hisの組込み量は定常期に高くなることが明らかとなった。集積実験及び組込み量算出実験の結果より、標識アミノ酸の組み込み量の挙動と標識アミノ酸の集積の挙動が一致し、標識天然アミノ酸の集積が大腸菌の増殖に関連していることを確認した。K-12由来株の活動状態の変化に対する集積の変化を評価した。詳しくは、大腸菌の増殖が停止した状態となる16°Cの低温で培養することにより、増殖の準備段階である誘導期の状態を延長させた。その後、37°Cに温度変更して増殖を開始させ、増殖開始前後における細菌の活動状態と3H-L-Tyr及び3H-L-Hisの集積変化との関連性を評価した。CFU量播種し、16°C、160rpmの低温で振盪培養し、培養開始後2時間、6時間及び12時間の時点で実施例5の方法により3H-L-Tyr及び3H-L-Hisとのインキュベーションを行い、回収した菌体について実施例5の方法により菌体内に集積した3H-L-Tyr及び3H-L-Hisの放射能を測定した。(培養開始後24時間)の時点で実施例5の方法により3H-L-Tyr及び3H-L-Hisとのインキュベーションを行い、回収した菌体について実施例5の方法により菌体内に集積した3H-L-Tyr及び3H-L-Hisの放射能を測定した。0054(結果)各標識天然アミノ酸の集積を図9に示す。K-12由来株の増殖が停止している16°Cでは、全ての培養時間において菌数の少ない誘導期と同程度に集積が低かった。K-12由来株)の増殖に関連していることを確認した。0055[アミノ酸光学異性体による細菌と細胞の集積比較の検討]生体内では天然アミノ酸は正常細胞にも集積が見られるため、画像診断法に重要な正常組織との比較が行えるか検討した。天然アミノ酸の光学異性体であるD体アミノ酸に焦点を置き、細菌におけるD体アミノ酸の集積と非癌化細胞への集積を評価した。K-12由来株をモデル細菌として使用した。添加したTHY培地を用いた。前培養条件は、37°C、好気条件下で14時間とした。本実施例における実験においては、以上の条件を満たした菌を使用した。Osaka、Japan)を使用した。Plate上でconfluentにした。本実施例における実験は全てこの状態の細胞を使用した。天然アミノ酸として、L-Alanine、L-methionine、Glycineを選択し、人工アミノ酸として、D-Alanine、D-methionineを選択し、本実施例において上述のアミノ酸を放射性トリチウム(3H)で標識した[2-3H]-Glycine(3H-Gly)、[2,3-3H]-L-alanine(3H-L-Ala)、[methyl-3H]-L-methionine(3H-L-Met)、[2,3-3H]-D-Alanine(3H-D-Ala)、[metyl-3H]-D-methionine(3H-D-Met)を用いた。Osaka、Japan)を使用した。rpm下で振盪培養した。rpmの震盪条件下で5分間インキュベーションした。条件下で5分間遠心し、菌体を回収した。LSC-5100)で菌体内に集積した放射能を測定した。μL加え、37°C下で10分間コンディショニングを行った。rpmの震盪条件下で5、30、60分間インキュベートした。mLとを混和後、液体シンチレーションカウンターで菌体内に集積した放射能を測定した。震盪条件下で5、30、60分間インキュベーションした。インキュベーション後、上記(4)と同様の方法により、標識アミノ酸の集積を検討した。100°C下で1時間加熱処理することによりタンパクを固定し、測定した放射能をタンパク画分への組み込み率として評価した。K-12由来株の各増殖期において今回検討を行った二種の標識D体アミノ酸について、先の実施例により明らかとなったそれぞれの標識L体の集積と同様の傾向を示すことが認められた(図10)。K-12由来株の増殖の準備期間である誘導期に(培養開始後〜2時間)では集積量が低く、生菌の増殖活動が最も活発となる対数増殖期(培養開始後6〜8時間)で集積量が最大を示した。その後、生菌数が一定となり細菌の死滅が開始する定常期(培養開始後12時間〜)では集積量が低下することが先の実施例により明らかとなっている。今回検討した3H-D-Ala、3H-D-Metはどちらも標識D体アミノ酸は標識L体アミノ酸の集積量と比べ、全体的に低い集積量を示していたが、それぞれL体アミノ酸同様の集積傾向を示していた。ここで同種アミノ酸について着目すると、Alanineについては3H-L-Alaでは対数増殖期6時間で最大集積量を示し,3H-D-Alaでは対数増殖期8時間で最大集積量を示した。Methionineについて3H-L-Met、3H-D-Metのどちらも対数増殖期8時間で最大集積量を示した。K-12由来株において標識D体アミノ酸も標識L体アミノ酸と同様に対数増殖期に最大集積量を示すことが明らかとなった(図11)。3H-Glyでは、誘導期には集積量が低値であり、対数増殖期に移行するにかけて集積量が増大し、定常期には再び低値を示すことが先の実施例より明らかとなっている。図10図110064(HaCaT細胞における標識アミノ酸の取り込み経過時間による集積変化の結果)HaCaT細胞における3H-L-Ala、3H-D-Ala、3H-L-Met、3H-D-Metについて、標識体を取り込ませる時間を5分、30分、60分と三段階に振り分けてそれぞれの集積量を検討した。検討した4種の標識アミノ酸について、HaCaT細胞での集積量は添加後のインキュベート時間が経過するに従い、その集積量が増加傾向にあった。L体アミノ酸での集積量に比べ、D体アミノ酸では集積量が低い傾向となることが明らかとなった。標識体添加後にインキュベートした3タイムポイントの中で、L体とD体で最も集積量の差が大きいのは添加後60分であった。3H-Glyについて、他2種の標識L体アミノ酸と比較すると、集積量は低いという結果を示した。K-12由来株の培養時間において、細胞と同様に標識体を取り込ませる時間を三段階に振り分けてそれぞれの場合の集積量を検討した。3H-L-Alaについては培養開始後6時間での細菌を、3H-D-Alaについては培養開始後8時間の細菌、3H-L-Met、3H-D-Metについては培養開始後8時間の細菌を用いた。これらのタイムポイントにおける細菌の集積量とHaCaT細胞の集積量についての比較検討を行った。K-12由来株では添加後のインキュベート時間が長くなっても集積に増加傾向は見られなかった。K-12由来株において3H-D-Alaの集積量は、標識アミノ酸添加後のインキュベート時間が経過しても増加傾向は見られなかった。3H-D-Metについて、標識アミノ酸添加後にインキュベート時間が経過するにつれて、集積量が増加する傾向がみられた。K-12由来株とHaCaT細胞の集積を比較すると、経過時間が長くなるにつれて集積の比率差が大きくなる傾向にあった。添加後60分において、細菌の標識アミノ酸集積量は細胞での集積量に対して、3H-D-Alaでは約6.6倍、3H-D-Metでは約4.5倍の比率の集積量があることが明らかとなった(図13)。K-12由来株とHaCaT細胞において、L体アミノ酸の集積比率に比べ、D体アミノ酸の集積量比率が大きいということが示された。K-12由来株とHaCaT細胞について比較検討を行った。K-12由来株について、集積量は標識アミノ酸添加後のインキュベート時間が経過するにつれて減少傾向を示した。K-12由来株の集積量はHaCaT細胞での集積量に対して約20倍となった(図14)。K-12由来株についてそれぞれの標識アミノ酸の集積量が最大となった培養時間の細菌を使用し、菌体内に集積した3H-L-Ala、3H-D-Ala、3H-L-Met、3H-D-Metのタンパク質への組み込み率を検討した。HaCaT細胞についても同様に検討を行った。3H-L-Alaについて細菌と細胞におけるタンパク質への組込み率を検討すると、細菌では標識体添加直後から、その後インキュベート時間が経過しても約40%前後の高いタンパク組込み率を示した。HaCaT細胞では標識体添加直後のタンパク組み込み率は低かったものの、インキュベート時間が経過するに従いタンパク組込み率が高くなる傾向が見られ、添加後60分後には細菌と同程度のタンパク組込み率を示した。3H-D-Alaでは、L体に比べるとその差は小さいものの、細菌の方が細胞よりも高いタンパク組み込み率を示した。K-12由来株のみが高いタンパク組み込み率を示したものの、HaCaT細胞へは経時的なタンパク組み込み率の増加が見られ、投与後60分において大腸菌と細胞間でタンパク組み込み率に大きなが見られなかった。K-12由来株とHaCaT細胞におけるタンパク組み込み率の差が大きく、約10倍前後の差を示した(図15B)。Glycineについて、細菌でのタンパク組込み率はインキュベート時間が経過するに従い、組込み率が高くなる傾向がみられ、添加後60分後には約33%の組込み率を示した。それに対して、細胞でのタンパク組込み率は、添加後60分においても約10%前後を示し、他のL体アミノ酸の細胞へのタンパク組込み率と比較すると、低い結果となった(図15C)。以上の結果により、D体アミノ酸は細胞ではタンパク質へと組み込まれる割合が低く、それに対して細菌ではL体もD体も細胞に比べ、よりタンパク質へ組み込まれていることが明らかとなった。K-12由来株と7種類の標識天然アミノ酸を用いて検討した。3H-L-Ala、3H-L-Tyr及び3H-L-Metは増殖が最も活発な対数増殖期に最大集積を示した。塩基性標識天然アミノ酸である3H-L-Lys及び3H-L-Hisは、増殖活性が低下し死菌が増え始める定常期に最大集積を示した。以上の結果より、誘導期には酸性アミノ酸、対数増殖期には中性アミノ酸、そして定常期には塩基性アミノ酸が優先的に菌体内に取り込まれると考えられる(図2及び3)。3H-L-Alaは検討した全標識天然アミノ酸の中で集積変化が最も顕著であり、対数増殖期において最大の集積量を示したことから、3H-L-Alaが最も細菌の増殖活性を反映する。3H-L-Alaが最も集積した理由の1つとして、細菌の細胞壁の構成成分が挙げられる。mechanics.Biochemistry.2017;56(29):3710-3724.)。K-12由来株の増殖の活発化に伴い細胞壁の合成が促進され、ペプチドグリカンの構成成分であるL-alanineとして取り込まれたためと考えられる。K-12由来株の各増殖期において、菌体内に集積した3H-L-Alaのタンパクへの組込み率を評価した。このことから、菌体内に取り込まれた3H-L-Alaは、まずは主にタンパク合成に利用されることが示された。これは、誘導期の菌体は小さく、増殖を行うためには菌体を大きくする必要があり、対数増殖期における盛んな増殖活動に向け菌体を大きくするために3H-L-Alaが高い割合でタンパクへ組込まれたためであると考えられる。対数増殖期以降におけるタンパクへの組込み率が低下したことから、対数増殖期以降においては3H-L-Alaはタンパク合成系以外の代謝系に組み込まれている可能性が示された。K-12由来株の誘導期を延長させた状態における3H-L-Alaの集積を検討した。このことから、3H-L-Alaは細菌の細胞壁を非特異的に通過して菌体内に集積しているのではなく、細菌の増殖活性に伴い特異的に菌体内に取り込まれていることを確認した。3H-L-Alaの集積に関与すると考えられる各集積機構の集積への寄与率も算出した。そのうちglycineと共通の集積機構の関与は約50〜75%であり、またglycineとは無関係のL-alanine特異的な集積機構の関与は約20〜40%程度であった。このことから、対数増殖期以降において、3H-L-Alaは全集積量における約90〜95%が細菌の活性化により特異的に菌体内に集積したことが示唆された。そのうち約50〜75%がglycineと共通の集積機構、約20〜40%がglycineとは無関係のL-alanine特異的な集積機構を介して集積したことを見出し、細菌への3H-L-Alaの集積は主にglycineと共通の集積機構によるものであると考えられる。0071実施例5では、2DG等の各増殖期における集積及び組込み率を評価した。3H-L-Tyr及び3H-L-Metの集積は対数増殖期に高くなった。天然アミノ酸のL-tyrosineやL-methionineを基本骨格とし、構造を変化させない核種で標識したアミノ酸が有用であると考えられる。集積実験及び組込み率算出実験の結果より、標識アミノ酸の組み込み率の挙動と標識アミノ酸の集積の挙動が一致したことから、大腸菌への集積が最も高くなる際にタンパク質組み込みも多く、大腸菌の代謝が活性化していることも確認され、大腸菌の増殖に伴うタンパク質合成などの代謝の活性が天然アミノ酸の集積に関係していると考えられた。0072実施例6では、細菌の活動状態の変化に対する3H-L-Tyr及び3H-L-Hisの集積の変化を評価した。その結果、実施例5と同様に標識天然アミノ酸の集積が大腸菌の増殖に関連していることが確認できた。増殖開始後の3H標識アミノ酸の集積が最も高くなる際にタンパク質への組み込みも多くなり、代謝活性との相関性も確認できた。よって、大腸菌の増殖活性と3H標識アミノ酸の集積は関連性があり、増殖に伴うタンパク質合成等の大腸菌の代謝活性がアミノ酸集積に関係していると考えられた。実施例0073実施例7では、天然アミノ酸の光学異性体であるD体アミノ酸に焦点を置き、細菌におけるD体アミノ酸の集積と非癌化細胞への集積を評価した。K-12由来株での感染症の原因細菌の増殖活動が盛んな対数増殖期におけるアミノ酸の細菌と細胞への集積を調べたところ、ともに高い集積を示すことが明らかとなった。由来株での集積を比較検討したところ、D体Alanine及びD体Methionineについて、非癌化細胞では細菌に比べ、低い集積が見られた。集積実験の結果、3H-D-alanine及び3H-D-methionineは大腸菌に取込まれるがHaCaT細胞には取込まれないことが確認され、細菌と細胞間の高いコントラストを期待できることから、これを利用した細菌感染症の感染早期での画像診断が有用である可能性が示された。以上の結果より、D体アミノ酸をベースとした新規画像診断薬による迅速な診断法の可能性を示した。0074細菌性感染症の診断において、放射性診断薬による病変の検出をより正確に行うための手段を提供できる。ページトップへこの技術を出願した法人この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedInこの技術を発明した人物この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedInページトップへ関連する挑戦したい社会課題この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedIn環境にやさしいエネルギーを実現する環境にやさしいエネルギーの実現は、経済成長と環境や健康面への配慮を両立させる社会につながります。発電やエネルギー創出時の環境への影響は、大気汚染などの健康被害にもつながり、また人命にかかわる気...最終更新日:2018/06/13放射性廃棄物のない社会を実現する放射性廃棄物のない社会を実現することで、安心・安全な地球環境を実現しながらリスクの少ない電力創出が可能になると考えられています。2019/10/03)【課題】オレキシン2型受容体作動活性を有する複素環化合物を提供すること。【解決手段】式(I):[式中、各記号は明細書記載のとおりである。