FavoritesSummary好中球の接着を定量する方法が報告されている。この方法は、血管内に発生したものと同様の動的流れ環境を作成する。これは、せん断応力との生体内環境に似コンテキストで精製された接着分子(リガンド)のいずれかへの好中球の接着や内皮細胞基質(HUVEC)の調査を可能にする。here.Abstract内皮細胞への好中球の強固な接着は、健康と病気の両方で炎症において重要な役割を果たしている。好中球の強固な接着の方法は、β2インテグリンファミリーのメンバーおよびICAMファミリーのカウンター受容体を含む多くの異なる接着分子を含む。最近では、両方で天然に存在する遺伝的変異は、2インテグリンβとのICAMは、自己免疫疾患と関連することが報告されています。したがって、これらの接着分子の様々な対立遺伝子型を持つ個体からの好中球の定量的接着能力は自己免疫の発生のメカニズムに関連して検討することが重要である。インビボで血管環境で観察されたものと同様の流体せん断応力を有する環境を作成することができる。ここで、我々は、ヒト末梢血の好中球の定量的な接着特性を研究するために、フローチャンバーアッセイ系を用いる方法を提示ヒト臍帯静脈内皮細胞(HUVEC)を、精製されたリガンド基板秒。この方法では、接着受容体の異なる対立遺伝子変異体を有するドナー由来の好中球の接着能力を評価し比較することができる。この方法はまた、他の一次細胞型または細胞株の接着を評価するために修飾することができる。1,2の発症に関連すると認識されている。これらの変異型を持つ個体に由来する細胞におけるこれらの変異体の機能的結果の決定は、これらの変異体は、自己免疫疾患の病因に寄与するかについての我々の理解のために必要である。そのような機能的研究は、天然に存在する遺伝的変異は、健康および疾患の両方における免疫応答を形成する機構の決定を可能にする。SLEの具体例において、我々は今、ITGAMにおける変異(のCD11b)およびそのリガンド、ICAM-1、1,2強く疾患の発症に関連付けることを知っている。ICAMの炎症を変える方法遺伝的変異に機械論的な洞察を提供することがあります。Neutrop細胞(EC)を内皮HIL強固な接着は、高度に制御されたプロセスであり、炎症反応3,4において重要な役割を果たしている。好中球の強固な接着は、ECの初期好中球の転がりとキャプチャをたどり、最終的には、生体内で輪廻する可能性があります。このように、接着分子の異なる対立遺伝子変異体を有するドナーからの好中球の接着を慎重に定量化は、これらの遺伝的変異の機能的および病理学的結果を理解することが重要になります。vitro環境を作成することができる。vivo環境を模倣することができる。この方法を使用すると、1は、内皮細胞に向けた全体的な細胞接着性を学ぶことができます。リガンド相互作用の研究を容易にするために、例えばICAM-1などの精製された接着リガンドへの結合を可能にする。ここでは、HUVECに、精製されたリガンドの基材に、ヒト末梢血の好中球の接着特性を研究するためのフローチャンバー接着アッセイ系を利用する方法を提示する。別の接着分子の対立遺伝子変異体を発現するドナーからの細胞を用いてこの方法を使用すると、私たちは、これらの遺伝的変異は、ヒト好中球の強固な接着を変更することができますどのように評価することができます。Protocolこの研究のために募集され、すべてのドナーが書面によるインフォームドコンセントを与え、研究はバーミンガム治験審査委員会のアラバマ大学によって承認された。補充した(材料のリストを参照)。完全培地37°Cで最初に調製し、次いで製剤の1カ月以内に使用するために4°Cで保存することができる。2で平衡させて添加する少なくとも30分間。2の密度で、この平衡化した培養フラスコに直接播種する。メディアが平衡化されているが、すぐに37°Cの水浴中でストックHUVECのクライオバイアルを解凍する。2の密度を達成するために事前に平衡化HUVEC完全増殖培地を含む培養フラスコに直接加える。優しく均等に細胞を分配して、インキュベーターにフラスコを返すために、フラスコを揺する。<細胞が70〜80%コンフルエントになるまで李>中2日ごとに変更する必要があります。EDTAで培養フラスコから収穫することができる。培養培地を細胞から任意の残留タンパク質およびカルシウムを除去するためにPBSでリンスし、培養フラスコから吸引される。0.25%トリプシン-EDTA溶液を添加し、光学顕微鏡により評価されるように2-6分間の細胞の剥離の中には明らかである。90%の細胞がプレートから切り上げたとき、2×トリプシンインヒビターを等量加えることによって、トリプシン処理を停止する。細胞の収穫を容易にするために、完全な増殖培地の他の同等の量を追加します。無菌15mL遠心管に分離した細胞を移す。室温で5分間225×gで分離した細胞を遠心分離する。血球計およびトリパンブルーを用いて細胞濃度および生存率を測定。cmで2万個の細胞の密度で細胞と2フラスコを採取し、2.2に進みます。細胞は、将来の研究のために、この時点で凍結することができる。細胞凍結のために、室温で5分間、225×gでの遠心分離により細胞をペレット化。mlの濃度で10%DMSOを含むFBS中で細胞ペレットを再懸濁する。細胞懸濁液を、細胞凍結容器内に細胞を凍結した後凍結バイアルに移し、-80°Cで保存する。HUVECの使用:復活と文化。活発に増殖する細胞を用いる場合は、2.2に進みます。番目の通路のHUVECを含有するクライオバイアルを解凍する。15ミリリットル滅菌遠心管に凍結バイアルから細胞を移し、10ミリリットルの成長MEDIを追加UM。室温で5分間、200×gで細胞を遠心し、残留DMSOを除去し、上清を吸引除去する。2のフラスコに細胞を移す。2でインキュベートする。視覚的メディアとの毎日は、2日ごとに変化し、合流のための細胞培養を調べる。通常2-4日以内に、細胞は、フローチャンバーアッセイにおける使用のための準備ができ、その時点で80〜90%コンフルエンスに達する。v)のゼラチンを数回追加必ずプレート全体表面が被覆されている。タンパク質マトリックスの形成を最適化するために、少なくとも30分間、プレートを乾燥させ、過剰なフィブロネクチンとゼラチン水溶液と空気を除去。Fibronectinゼラチン溶液を10倍まで再利用することができる。ステップ1.5から1.7で説明したようにトリプシン-EDTAを使用して、ステップ2.2からHUVEC細胞を収穫。各コーティングされた組織培養皿に500,000細胞を播種する。2でインキュベートする。細胞はステップ2.2のように密集するまで成長させる。細胞は、視覚的に、2日ごとに培地交換を毎日点検してください。mlのヒトTNF-αでのHUVECの素数。精製リガンドコーティング35mm組織培養皿の中央にマーカーやペンで直径0.5cmの円を描きます。mlのプロテ​​インAの20μL。タンパク質を直径0.5cmの円内全域をカバーするソリューションを広めるためにピペットチップを使用してください。それは、Dの表面に触れたり傷つけたりしないことが重要ですISH。1時間37°Cでインキュベートする。1mlのPBS(pH8.0)でタンパク質コートプレートの3回洗浄します。プレートに非特異的結合をブロックするマークされたエリア内のプレートに50μlの1%BSA。4°Cで2時間インキュベートステップ3.3のように、1mlのPBSでブロックし、プレート3回洗浄します。コー​​ティング用のFc接着受容体リガンドキメラタンパク質溶液を調製する。mlの少なくともP-Selectin/Fcキメラ液(pH8.0)を用いた。コー​​ト基板50μlとマークされたエリア。4°Cで一晩インキュベート料理は2日以内に使用されるべきであり、コーティングされたエリアは、乾燥させてはならない。プレート上の50μlのソリューションを維持するために必要な場合には、PBSを追加します。好中球の分離(室温で実行されるすべてのステップ)インフォームドコンセントを得た後、に瀉​​血によって参加者の血液を集めるnは抗凝固採血管またはバキュテナー(EDTAまたはヘパリン)。採血後、分離前のPBSで血液1:1希釈する。50ミリリットル遠心管にPBMCおよび好中球を分離するための2層のFicollを準備します。1.077から1.080を参照)フィコールを照らす。軽フィコールと重いフィコール層の間の鋭い境界線があるはずです。最後に、注意深くフィコール層を乱すことなく光のFicollの上に希釈された血液サンプル25mlのレイヤ。室温で30分間250×gでチューブを遠心分離する。注:これらのスピンは、遠心分離の終了時にローター減速中の細胞分離の可能性混乱を最小限に抑えるために遠心ローターブレーキはオフにする必要があります。遠心分離した後、(上から下へ)以下の層が存在している:トップ層は、プラズマfolloです光フィコール層の上にPBMC層によって結婚、いくつかの赤血球(RBC)と好中球の層がチューブの底に重フィコール層および赤血球続い軽鎖および重フィコールの間である。して好中球と混合したRBCがあってもよい。ダウン10ミリリットルマークに上清を吸引除去する。二回目の洗浄後、上清を吸引除去する。Oを、ゆっくりと渦を追加します。1.8%NaClを25ミリリットルを加え、すぐに混ぜる室温で10分間、225×gで遠心分離することによって。汚染したRBCは現在、白、好中球の細胞ペレットを残して溶解する必要があります。PBSで好中球の細胞ペレットを洗浄します。10%FBSを含むRPMI培地中で孤立した好中球を再懸濁し、血球計算板と光学顕微鏡下で細胞濃度を決定する。mlに細胞濃度を調整。フローチャンバー接着アッセイフローチャンバーを組み立てます。顕微鏡テーブルの上にコンフルエントのHUVECまたは精製された接着性受容体リガンドを含む35mmディッシュを置きます。シリンジポンプ、真空システムと平行板フローチャンバーを接続し、好中球の入力のために開いた1行のままにします。プレートの上部にフローチャンバーを挿入し、フローチャンバアセンブリ13を固定します。図1を参照してください)T接続されたコンピュータ上のビデオ録画プログラムを開始顕微鏡O。リガンド塗布領域内に十分に成長したHUVEC細胞またはフィールドとの明確なフィールドが表示されるまで、顕微鏡のフィールドとフォーカスを調整します。シリンジポンプを用いて、RPMI培地でフローチャンバーをすすぐ。チャンバー内に気泡や好中球の入力行がないことを確認してください。M)のfMLPで下塗りしてもよい。これは異なるドナー14の間に好中球活性化の基礎レベルのマッチングを可能にする。2の剪断応力がこの研究で使用されているに等しい350μlの/分の速度)でのフローチャンバーへの好中球を注入するためにシリンジポンプを使用する。好中球の接着が急速に発生する可能性があるため、4〜5分の長さのビデオは、分析のための接着事象を定量するために通常は十分です。接着細胞は、1つのセル直径よりも小さいセルを移動させるように定義されるHUVECまたはリガンドでコーティングされた表面15,16上の5秒以内。このルールを使用して記録された映像に存在するフィールドで接着細胞の総数をカウントします。異なるドナーの好中球と同様の長さの動画を記録することによって、人は異なるドナーとの密着性を比較するために接着細胞/分を計算することができる。図3)に結合する好中球への結合が示されている。図に示すように、好中球は連続的な流れの条件でコーティングされた表面またはHUVECに付着/蓄積し続ける。私たちの典型的な実験条件の下で、私たちはしっかりと4分間の記録期間中にコーティングされた表面またはHUVECに付着した50〜70人の好中球を観察することができます。基質(精製リガンドまたはHUVEC)における対立遺伝子変異体の対立遺伝子変異体は、実質的に定量的な好中球の接着14を変化させることができる。我々はまた、我々の研究で観察された好中球の接着のイベントの時間依存性を評価している。我々は、一定の流量条件を維持している間、それは細胞の接着特性が経時的に変化することが可能である。However、私たちの研究では、比較的短い時間のコースにわたって、我々は時間をかけて接着力率のいずれかの一貫性の違いを観察しません。3〜4分間の時間点の間で観察さ接着と比較して1〜2分の時点での密着性の評価は、一貫して異なっていない。細胞が接着実験中に刺激されている場合はもちろん、次いで、経時的な接着特性の変化が期待できる。内皮細胞(私たちの研究でHUVEC)を、最適な白血球強固な接着のための接着分子の発現をアップレギュレートする前に活性化を必要とする。前処理の非存在下で、内皮細胞(HUVEC)は、非常に少ない好中球の接着を支援する。mlの使用前に4-6時間、TNFα治療を用いる。mlの)はまた、内皮細胞を予め活性化するために使用することができる。内皮細胞相互作用によって引き起こされることを保証するためにネガティブコントロールとして使用することができる。抗受容体抗体は、密着性の特異性を評価するために、特定の受容体を遮断するために使用することができる。顕微鏡ステージ上の図1。この図の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。