mlの好中球の密度を有する350μlの/分である。​​ーティングされた表面に付着した好中球のサンプルビデオからのスクリーンショット。(A:0時点、B:1分の時点、C:2分の時点、およびD:4分の時点)。mlの好中球の密度を有する350μlの溶液/である。65.9異なる器官及び異なる種の表1。*参考文献13、16、19、及び20からの集計。Discussionこのプロトコルは、全くのストレス条件下で好中球の接着を慎重に定量化のための最小限の活性化好中球の分離および単離をガイドします。好中球の接着は、炎症において重要なプロセスである。このプロセスにおける複数の分子の遺伝的変異体が自己免疫疾患の発症1,2素因が実証されているので、定量的に、ヒト好中球の強固な接着を評価することが可能なアッセイ系が必要である。vitro環境での好中球の強固な接着性を慎重にかつ定量的な測定を可能にする。直接的な比較は接着分子14における遺伝的変異の重要性を決定することを可能にする。この方法にはいくつかのステップがachievを十分考慮に値するEの高い定量的かつ再現性のある結果。HUVECの調製においては、フローチャンバーでそれらを使用する前に100%の細胞集密度を達成するために重要である。精製されたリガンドで被覆された表面を使用するため、基板の塗布面積は、リガンドの変性を避けるために完全に乾燥した許可すべきではない。ヒト好中球の調製は、実験の成功に不可欠です。血液は室温で行われるべき氷および遠心分離ステップに記憶されるべきではない)と、単離および実験を完了含む可能な限り最短の時間内。これらのアッセイ17,18用の細胞を調製するために利用することができる追加の好中球の単離方法がある。新たに単離されたヒト好中球を使用した実用的な観点からは、接着アッセイから参加者の瀉血後3-6時間以内に開始しなければならない。好中球は取り扱いに非常に敏感であるため、採血と使用の間に長期の時間が検定結果に影響を与える可能性があります。従来のフローチャンバーアッセイに好中球細胞濃度を注意深く決定は、正確で再現性のある結果を達成することも必要である。フローチャンバーアッセイ中に、流速が一致しており、実験期間全体にわたって乱流が存在しないことを保証するために慎重にビデオ記録を監視することが重要である。流速の変化や乱流の存在は、実験が繰り返されることを必要とするであろう。実験後は、好中球が凝集されないことを保証するために、微視的に残り、好中球を評価することも重要である。この時点での凝集は、好中球が有意に実験中の好中球の密度を変化させる可能性が活性化されたことを示すであろう。=高さを作成しますフローチャンバ15)。0.01インチ、水の粘度37°CでC(0.007ポアズ))をRMPI培地の粘度の近似値として使用した。特定のフローチャンバーは、一方が異なる生理学的条件を模倣するせん断応力の異なるレベルを達成するために流量を変更することができる。20に列挙したができる。私たちの方法は、ヒトneutrophiの付着の研究に焦点を当てているがlsの、この方法は、好中球に限定されず、容易に接着または単純な変更を加えて他の細胞タイプの圧延の研究に適用することができる。この方法では基板は、異なる目的のために変更することができる。このプロトコルは異なる研究に容易に適合しているが、いくつかの制限があります。ここに実装されているプロトコルは、分析のための主要な多数の細胞を必要とします。これは、小さな動物からの初代細胞の分析を排除することがあります。アクティブ/使用可能なコンホメーションで精製された接着リガンドを固定化する必要性は配位子の範囲を制限することができる。Fc融合タンパク質の使用が大幅に板面に適切なリガンドコンフォメーションを達成する可能性を高める。それにもかかわらず、我々の方法は、接着事象の定量分析を可能にする重要な柔軟性を有する。リガンド対の理解、および遺伝的変異の可能性のある機能の重要性を強化しますこれらのタンパク質は、ヒト疾患の病因である。Disclosures著者らは、開示することは何もありません。UL1-TR00165が主催しています。我々は彼の継続的な支援のためにロバートP.キンバリーに感謝します。gdpr@jove.com.。