新規に導入する定量的リン酸化プロテオーム解析により、ウイルスPKがハイジャックする宿主細胞因子のリン酸化制御を網羅的に同定すること、の2点を目標とした。(i)に関する実績:同定済みのウイルス因子のリン酸化部位の大半に関して、組換えウイルスの作製と培養細胞系におけるウイルス増殖およびマウス感染モデルにおける病態発現への影響の解析を終了した。system)の破壊能すなわち神経病原性(Neurovirulence)を促進することを見い出した。transport)を促進することを見い出した。後半の知見は、より詳細な解析を継続中である。5264-5277.に報告した。(ii)に関する実績:定量的リン酸化プロテオーム解析の導入に成功し、ウイルスPKがリン酸化を促進する宿主細胞因子の10種類の同定に至った。新規に導入する定量的リン酸化プロテオーム解析により、ウイルスPKがハイジャックする宿主細胞因子のリン酸化制御を網羅的に同定すること、の2点を目標とし、その2点ともに既に完了に近い結果を得るに至っている。(i)に関しては、研究実績の概要の記載通り、HSV疾患のアンメットメディカルニーズの一つであるヘルペス脳炎の発症を司る分子機序の解明に至ったことから、十分な成果が得られたと考える。(ii)に関しても、申請時の目標としたウイルスPKがリン酸化を促進する宿主細胞因子の網羅的の同定が既に完了し、同定した新規宿主細胞基質の1つであるSNX3に関して、詳細な解析が、培養細胞系と動物実験系で進展していることから、当初の計画以上に進展していると考えられる。申請当初の予定では、本年度は以下の(i)~(iv)を解析予定であった。(i)において、著しい弱毒化が確認された組換えウイルスが得られた場合は、HSV性器ヘルペスモデルに対する感染抑制能を解析する。定量的リン酸化プロテオーム解析において、同定されたウイルスPKがハイジャックする宿主細胞基質をshRNAによりknockdownした細胞を作製後、リン酸化部位に上記アミノ酸置換を導入した変異宿主標的基質を外来的に発現させ、リン酸化の影響を基質の機能に準じた手法を用いて解析する。(i)(ii)において、興味深い役割を果たことが明らかとなったリン酸化部位に関して、ウイルスPKによって直接リン酸化されうるか否かを、申請者が確立したウイルスPK試験管内反応系を用いて解析する。(iii)および(iv)に関しても、既に興味深い2分子に関して、解析を進めている。そこで、本年度は、(ii)に着手し、作製した組換えウイルスのワクチン能をスクリーニングする。(iii)に関しては、現在進行中の2分子に関して、より詳細な機能解析を継続する。手法等の変更は特になし。申請時の予定と大幅な変更点はなし。ウイルス感染実験には消耗品が必要である。本研究ではリン酸化現象を集中的に解析するため、アイソトープおよびPhos-tagは必須である。リン酸化現象とHSVの病態の関連を解析するため、マウス実験も多用することとなる。したがって、マウスも数100匹単位で必須となる。旅費:国内外の学会に参加し、研究打ち合わせおよび情報収集を行うのに国内外旅費が必要である。2回=100千円/年、外国旅費、400千円/年。宿主因子のリン酸化の解析が順調であるため、上記の残金をcDNAや抗体の購入に回すことで、効率的に多数の宿主因子の解析も実施したい。