AchievementsGタンパク質共役型受容体(GPCR)は様々な生理活性物質をリガンドとする細胞膜上受容体であり、創薬の主要な標的として重要な分子である。GPCRは特異的なリガンド分子の結合より活性化されるが、その不活性化はエンドサイトーシスによる細胞膜からの排除により制御されている。これまでの研究で、研究代表者らは、活性化したGPCRを特異的に標識する新しい蛍光GPCRマーカーの開発に成功し、そのマーカーを用いたエンドサイトーシス関連遺伝子の網羅的なスクリーニングを行なった。その結果、エンドサイトーシスに異常のある多数の出芽酵母変異体の単離に成功した。本研究は、スクリーニングにより得られた変異体の詳細な解析を通して、GPCRのエンドサイトーシス機構の全容を明らかにすることを目的とする。現在までに開発された医薬品の約50%はGPCRに作用する薬剤であり、本研究はそれらの疾患の原因の解明や、治療法の開発のための基盤となることが期待される。GPCRのクラスリン小胞への取り込みにおける細胞膜脂質成分の役割、(2)細胞内へと取込まれたGPCRの初期エンドソームへの輸送機構、(3)GPCR輸送におけるゴルジ体-エンドソーム-リソソーム間の輸送制御機構の解明、の3つのプロジェクトが進行中である。本年度は主に研究課題(1)について、PtdIns(4)とPtdIns(4,5)P2のGPCRの取り込みにおける役割と、細胞内輸送における役割の詳細な解析を行った。エンドサイトーシス過程においてPtdIns(4)PとPtdIns(4,5)P2はそれぞれ異なる役割を持ち、エンドサイトーシスを段階的に制御していることを明らかにした。PtdIns(4)Pによるポストゴルジ体輸送経路を介したエンドサイトーシス制御の可能性を示唆する実験結果を得た。GPCRのクラスリン小胞への取り込みにおける細胞膜脂質成分の役割、について予定していた研究を実施し、一定の成果を得た。これまでの研究で、細胞膜の脂質組成がクラスリン小胞の形成もしくはGPCRの小胞への取り込みに重要であることが示唆されている。mss4-1変異体)におけるPtdIns(4)PおよびPtdIns(4,5)P2の変化を調べた。その結果、stt4-1変異体では細胞膜におけるPtdIns(4)Pの著しい減少が、mss4-1変異体ではPtdIns(4,5)P2の著しい減少が認められた。これらの結果から、エンドサイトーシス過程においてPtdIns(4)PとPtdIns(4,5)P2はそれぞれ異なる役割を持ち、エンドサイトーシスを段階的に制御していることを明らかにした。PtdIns(4)Pは、ゴルジ体に局在するPtdIns4キナーゼであるPik1によっても産生される。作成し、クラスリン小胞の形成やその取り込みに与える影響を解析した。その結果、クラスリン小胞の形成には異常が見られない一方,エンドソーム―液胞間の輸送に著しい遅延が見られた。酵母ホモログであるVps21pの局在を調べたところ、pik1変異体では部分的な活性の低下が認められた。この結果は、PtdIns(4)Pによるポストゴルジ体輸送経路を介したエンドサイトーシス制御の可能性を示唆している。Activity研究課題(1)についてはPik1によるゴルジ体のPtdIns(4)Pの産生がエンドサイトーシスに及ぼす影響を詳細に解析する。酵母ホモログであるVps21pの局在やその活性化因子であるvps9の局在を解析する。ゴルジ体からの小胞輸送に働くクラスリンアダプタータンパク質の局在やその欠損体を作製し、エンドサイトーシスへの影響を調べる。研究課題(2)についてはRhoファミリータンパク質の温度感受性変異体を作製し、更にこれらの多重変異体を作製することで、ファミリー間の機能重複性を明らかにしていく。(3)については、正常細胞と変異体細胞でpHRodo-α-factorの取り込みの比較を行う。