経時的な細胞の分化万能性の変化は、分化万能性に関連するマーカーの発現レベルの変化を検出することで決定できる。分化万能性の変化は、別の細胞型と関連した分化、またはマーカーと関連したマーカーの発現レベルの変化を検出することによって観察することができる。培養で増殖し、その後、別の細胞型への分化を促進するようなやり方で処理する。他の細胞型は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。細胞型は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。細胞型は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。細胞型は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞であってもよい。本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、本分野における任意の適切な方法により、他の様々な細胞型へと分化してもよい。同様のものへと分化してもよい。【0154】たとえば、本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、国際公開第2007030870号に記載の方法にしたがって、神経前駆細胞、および心筋細胞へと分化してもよい。別の例では、本発明の方法にしたがって処理された分化万能性幹細胞は、米国特許第6,458,589号に開示の方法にしたがって、肝細胞へと分化してもよい。本分野における任意の方法により、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。(2005))に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。(2004))に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。(2007))に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。(2006))に開示の方法にしたがって、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。protein、FGF4、CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA6、CXCR4、C−Kit、CD99、およびOTX2から成る群から選択される。本発明での使用に適しているのは、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞である。本発明の1つの態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、原条前駆細胞である。別の態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様では、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、最終内胚葉である。本分野における任意の方法により、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。(2006))に開示の方法にしたがって、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーは、Pdx1、HNF−1β、PTF1a、HNF−6、HB9、およびPROX1から成る群から選択される。本発明での使用に適しているのは、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞である。本発明の1つの態様では、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内胚葉細胞である。本分野における任意の方法により、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。(2006))に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。(2006)に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。2006)に開示の方法にしたがって、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーは、NGN−3、NeuroD、Islet-1、Pdx−1、NKX6.1、Pax−4、Ngn−3、およびPTF−1αから成る群から選択される。1つの実施態様では、膵臓内分泌細胞は、以下のホルモンのうちの少なくとも1つを発現することができる。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。本発明での使用に適しているのは、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞である。本発明の1つの態様では、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、膵臓内分泌細胞である。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であってもよい。膵臓内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であってもよい。本発明の1つの態様では、膵臓内分泌細胞は、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞である。β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、Pdx1と、以下の転写因子のうちの少なくとも1つとを発現する。その転写因子とは、NGN−3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl−1、HNF−3β、MAFA、Pax4、およびPax6である。本発明の1つの態様では、β細胞系統に特徴的なマーカーを発現する細胞は、β細胞である。vivoで用いられ、本願発明の方法を実施する際に使用するのに適切である。A1号、米国特許第4,557,264、同第6,333,029号に開示された材料を参照のこと。薬剤を組み込まれた支持体を形成するために、支持体を形成する前に、薬剤をポリマー溶液と混合することができる。織られた支持体上に薬剤をコーティングすることができ、それは好ましくは薬学的キャリアの存在下である。薬剤は、液体、細かく分割された固体、または他の任意の適当な物理的形態で存在してもよい。薬剤の放出速度を変えるために賦形剤が支持体に加えられてもよい。別の実施態様では、支持体は、少なくとも1つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,509,369号に開示された化合物のような、抗炎症性化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれる。支持体は、少なくとも1つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,793,945号に開示された化合物のような、抗アポトーシス化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。支持体はまた、少なくとも1つの薬学的化合物であって、たとえば米国特許第6,331,298号に開示された化合物のような、線維症阻害剤である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。2004/0220393号、および同第2004/0209901号に開示された化合物のような、血管形成を促進することができる、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。2004/0171623号に開示された化合物のような、免疫抑制化合物である、薬学的化合物とともに組み込まれ得る。以下の実施例により、本発明をさらに説明するが、それらにより限定するものではない。細胞クラスターでのhESCの継代および維持ヒト胚性幹細胞株H1およびH9を、マイトマイシンC不活性化初代マウス胚線維芽細胞(MEF)上で維持した。hES細胞を、反復継代の後、MEF支持細胞からMATRIGEL(商標)へと移した。CA)で1:30に希釈した。各6cmディッシュ(2mL)または6ウェルプレート(1mL)の各ウェルに、覆うのに十分な量を加え、室温で1時間インキュベーションした。プレートは、数時間以内に使用するか、4°Cで2週間目まで保存した。MO)を含むDMEM/F12中で、10分間インキュベーションし、その後、ピペットで掻爬することにより、支持細胞から採取した。1000rpmで4分間遠心分離することにより、細胞の塊をペレット化し、ペレットを2mLピペットでやさしく分散して、コロニーを細胞の小さなクラスターへと砕いた。MN)を補ったMEF−CMを入れたMATRIGEL(商標)コーティングのディッシュ上に、5mLの成長培地を入れた6cmディッシュ当たり50〜150個のコロニーで播種した。MEF−CM中のMATRIGEL(商標)上のコロニーが大きくなり、それらが表面領域の70〜80%を占めると、約3〜4日ごとに継代した。コロニー中のhES細胞は、高い核対細胞質比率を有し、顕著な核小体を有していた。これは、支持細胞上で維持されたhES細胞と同様である(図1)。分化した細胞は、培養中の全細胞の5%未満であった。【0181】MATRIGEL(商標)上のMEF−CM中の細胞の定期的な継代のために、1mg/mLコラーゲナーゼIVを含むDMEM/F12で、最大60分間、細胞をインキュベーションし、掻爬とともにDMEM/F12の強力な水流により、ディッシュから除去した。細胞をペレット化し、分散し、そして1:3または1:4の比率で播種した。単細胞としての胚性幹細胞の継代:酵素の評価hES細胞の取扱いを容易にするために、継代技術は、他の酵素溶液であって、より短いインキュベーション時間が必要だが、掻爬の工程を含まないような酵素溶液を用いてもよい。細胞を細胞クラスターとしてコラーゲナーゼにより継代することは、播種される細胞の数値定量化を可能にしない。多くの酵素溶液が、1つの迅速な工程で単細胞を放出するために利用可能である。以下の実験により、最小の細胞損傷をもたらし、細胞付着または細胞成長を遅らせないような即効性の酵素が同定された。【0183】クラスターとして6ウェルディッシュ中で成長したヒト胚性幹細胞H9p33細胞を、以下の酵素とともに、36°Cで2分間インキュベーションした。その酵素とは、TrypLE(商標)Express、TrypLE(商標)Select、トリプシン/EDTA(0.05%)、またはトリプシン(0.25%)である。トリプシンを除き、すべての酵素が2分間以内に細胞を放出した。トリプシンによる放出は、36°Cで5分後に達成された。MATRIGEL(商標)でコーティングした6ウェルプレートに、細胞を200,000細胞/ウェルで再播種し、3日間増殖させた。ヒト胚性幹細胞もコラーゲナーゼによりクラスターとして継代し(30分インキュベーション)、そしてMATRIGEL(商標)コーティングウェル上に1:5希釈で再播種した。これは、計数したTrypLE(商標)Express細胞と同様である。3日後、TrypLE(商標)Expressによる5分間のインキュベーションにより、hESCを放出した。細胞を、0.01%トリパンブルーとともにインキュベーションし、その後計数した(表1)。放出直後の細胞の生存率は、試験したすべての酵素で98%を超えていた。コラーゲナーゼによるヒト胚性幹細胞の継代は、標準的な継代方法である。TrypLE(商標)Select、およびTrypLE(商標)Expressは、3日間の培養後、コラーゲナーゼと同様の回復した細胞計数をもたらした。細胞の付着/成長を維持することについて、トリプシン/EDTA、およびトリプシンは明らかに効果が少なかった。TrypLE(商標)Select、およびTrypLE(商標)Expressは、評価したなかで最も良い酵素であり、実施例3のタイムコース実験でさらに試験した。Select、およびTrypLE(商標)Expressは、試験したすべての酵素のなかで最適であることが明らかになった。hES細胞に対するこれらの酵素の理想的なインキュベーション時間を決定するために、TrypLE(商標)Select、およびTrypLE(商標)Expressを、H9p34hESCクラスターとともに、37°Cで2分間または10分間インキュベーションした。細胞をウェルから取り除き、計数し、遠心分離によりペレット化した。200,000細胞/ウェルの分量を、6ウェルプレートに播種した。細胞を3日間成長させ、その後、TrypLE(商標)Expressにより放出し、0.01%トリパンブルーの存在下で計数した。両方の酵素の両方のインキュベーション時間について、細胞生存率は98%を超えていた。表3は、播種後36時間の回復した細胞/ウェル数を示している。TrypLE(商標)Expressにより継代した細胞は、3日後に開始播種密度に到達した。このことは、大部分の細胞が、播種後再付着しないこと、および付着した細胞も増殖し増えることができるということを示している。一度付着すると細胞が同じ速度で増殖すると仮定するならば、これらのデータは、TrypLE(商標)Expressによる2分間の処理が、結果的に最も良い付着速度を生ずるということを示している。それゆえ、すべてのその後の実験において、単細胞を作るために2分間のTrypLE(商標)Express処理を用いた。胚性幹細胞は複数の細胞系統へと分化することができる。単細胞として継代されたヒトES細胞によって、細胞入力の定量化、および取扱いの容易さを助けるための顕著な改良がもたらされる。これらの単細胞のhES細胞の分化能力を決定した。MATRIGEL(商標)上のH9またはH1細胞クラスターの入った6cmプレートを、2mLのコラーゲナーゼ(1mg/mL)を含むDMEM:F12とともに、37°Cで最大60分間インキュベーションした。細胞を、ピペッティングおよび掻爬により取り除き、900rpmで4分間遠心分離した。MATRIGEL(商標)でコーティングした6ウェルプレートに、細胞クラスターを播種した。この継代方法は、結果的に、細胞クラスター(cc)を播種することをもたらす。MATRIGEL(商標)上のH9またはH1細胞クラスターの入った6cmプレートを、TrypLE(商標)Express(2mL)とともに、37°Cで5分間インキュベーションし、ピペッティングにより分散した。MATRIGEL(商標)でコーティングした6ウェルプレートに細胞を播種し、それを単細胞(sc)と命名した。Systems)を補ったDMEM:F12培地に2日間曝露した。その後、2%FBSおよび100ng/mLアクチビンAを補ったDMEM/F12培地により、さらに3日間処理した。protein(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、goosecoid(GSC)、HNF−3β、およびGATA4については、リアルタイムPCRにより、培養物を分析した。AFP、およびSOX−7は臓側内胚葉マーカーと考えられる一方、GATA4、HNF−3β、およびSOX−17は最終内胚葉マーカーであり、GSC、Bry、およびCXCR4は原条のマーカーである。結果として生じたCXCR4陽性細胞の割合(%)を観察すると(図2)、単細胞は、細胞クラスターと同様程度まで、DEに分化した。1392-1401)に開示されたプロトコルにしたがって、さらなる分化を試験した。細胞は、実施例4に記載されたDEプロトコルの後、膵臓内胚葉へとさらに分化した。4からの細胞クラスターおよび単細胞を用いた、H9(p37)DE実験のうちの1つが膵臓内胚葉へとさらに分化した。hedgehog(ソニックヘッジホッグ)阻害剤、KAADシクロパミン(2.5μM;Sigma-Aldrich)、および2%FBSを含むDMEM:F12培地とともに、細胞を3日間インキュベーションした。glucose(DMEM低グルコース)とともに、細胞をさらに3日間インキュベーションした。glucoseとともに、細胞をさらに3日間インキュベーションした。6ウェルプレートのうちの1つのウェルから、各細胞型について、RNAサンプルを採取し、その後、膵臓マーカーPdx1、Nkx6.1、Nkx2.2、Pax4、NeuroD、HNF3b、Ptf1a、Insulin(インスリン)、およびAFPについて、リアルタイムPCRにより、この段階で分析した。Systems)、およびエキセンディン4(50ng/mL)、ならびに1%B27を含むCMRL培地(Invitrogen)により、3日間、分化が継続した。この段階で、同じ膵臓内胚葉マーカーの評価を反復した。処理したサンプルと平行して、同じ株の未処理のhES細胞由来のRNAサンプルに対して、リアルタイムPCRを行った。未処理の対照に対して1の倍数変化を設定し、処理したサンプルを正規化した。Pdx1発現を観察し、単細胞と細胞クラスターとを比較した。膵臓内胚葉マーカー発現の誘導は、単細胞と細胞クラスターの間で同等であった(図3)。したがって、hES単細胞は、hES細胞クラスターと同様の遺伝的な分化能力を有している。単細胞としてhES細胞を継代することは、培養をスケールアップし、製造過程を容易にすることを可能にするだろう。○単細胞の生成および継代についての説明H9細胞をMATRIGEL(商標)上で、上記のとおり成長させた。TrypLE(商標)Expressとともに、37°Cで5分間インキュベーションした。細胞をDMEM:F12に再懸濁し、900rpmで4分間遠心分離した。MATRIGEL(商標)コーティングしたプレート上に1:4の比率で、細胞を再播種した。約5代継代後、再播種し、14,000細胞/cm2の密度で蒔く前に、細胞を計数した。この密度で継代し再播種することを、各4日間の間隔で継続した。細胞は、単細胞から成長したが、密集したクラスターを形成することがないような緻密な構造を保持していた(図1と図4を比較のこと)。hES単細胞の分化万能性の分析hES細胞の分化万能性の維持は、あらゆる継代技術で必要とされる。したがって、TrypLE(商標)Expressを用いた複数の継代後の分化万能性について、単細胞を評価した。○FACS分化万能性分析H9単細胞を、クラスターとして38代継代培養した後、単細胞として16代継代培養した。これには凍結保存の凍結解凍が1回含まれる。その後、分化万能性マーカーの発現について、FACSで細胞を分析した。TrypLE(商標)Express溶液とともに5分間インキュベーションすることにより、付着細胞を培養プレートから取り除いた。MO)、0.05%アジ化ナトリウムを含むPBSから成る染色バッファーに再懸濁した。必要に応じて、0.1%γグロブリン(Sigma)溶液を15分間用いて、細胞をFc受容体についてブロッキングした。表3に示したとおり、モノクローナル抗体を結合したフィコエリスリン(PE)もしくはアロフィコシアニン(APC)(106細胞あたり5μL抗体)のいずれかとともに、または非結合一次抗体とともに、分量(約105細胞)をインキュベーションした。染色された細胞が含まれた。抗体によるすべてのインキュベーションを4°Cで30分間行い、その後、染色バッファーで細胞を洗浄した。非結合一次抗体により染色されたサンプルを、PEまたはAPCで標識した二次結合抗体とともに、4°Cでさらに30分間インキュベーションした。用いられた2次抗体の一覧については表3を参照のこと。Biosciences)を用いて同定し、少なくとも10,000回の事象を収集した。hESCコラーゲナーゼ継代したH1p40およびH9scp16は、同等の分化万能性タンパク質の発現プロファイルを有している(図5)。ヒト胚性幹細胞の単細胞の核型安定性の分析hES単細胞の核型は、複数の継代の後も安定なままであるべきである。H9単細胞を、クラスターとして38代継代培養し、その後、単細胞として複数継代培養した。WI)により決定した。situハイブリダイゼーション)により200個の中期の細胞核を分析した。細胞が正常な数の常染色体を有し、様式的な染色体数は46本であることを示した。H9単細胞の核型決定を、13代継代および20代継代で実施した。20代継代の細胞は、冷凍保存の凍結解凍事象を1回経験していた。13代継代の細胞および20代継代の細胞は、核型としては正常だった(図6)。最終的な利用のために、単細胞として継代されたhES細胞は、分化能力を保持しなくてはならない。以下のとおり、単細胞に対して最終内胚葉分化プロトコルを行った。TrypLE(商標)Expressによる複数の継代(sc−p)後のH9細胞を、分化のためのMATRIGEL(商標)(1:10希釈)上の継代された単細胞(6代継代および21代継代)から、TrypLE(商標)Expressにより放出した(sc)。Wnt3a、および100ng/mLアクチビンAを補ったDMEM:F12培地に2日間曝露し、その後、さらに3日間、2%FBSおよび100ng/mLアクチビンAを補ったDMEM/F12培地により処理した。protein(AFP)、CXCR4、Brychyury(Bry)、goosecoid(GSC)、HNF−3β、およびGATA4については、リアルタイムPCRにより、細胞を分析した。AFP、およびSOX−7は臓側内胚葉マーカーと考えられ、一方、GATA4、HNF−3β、およびSOX−17は最終内胚葉マーカーであり、GSC、Bry、およびCXCR4は原条のマーカーである。複数回(6代継代および21代継代)継代した単細胞は、細胞クラスター(36〜55代継代)と同様に、DEへと分化する能力を保持している(図7)。以下の工程をその後行うことにより、細胞は膵臓内胚葉へとさらに分化した。glucose(DMEM低グルコース)とともに3日間インキュベーションすることである。細胞の評価は11日目に行なった。glucoseとともに3日間にわたり処理を続けた。14日目に、膵臓マーカーPdx1、Nkx6.1、Nkx2.2、Pax4、NeuroD、HNF3b、Ptf1a、Insulin、およびAFPについて、リアルタイムPCRにより、サンプルを分析した。50ng/mLのHGF、IGF、およびエキセンディン4、ならびに1%B27を含むCMRL培地により、いくつかの培養が分化を継続させた。17日目の終わりに、同じ膵臓内胚葉マーカーの評価を反復した。14日および17日目の終わりで、膵臓内胚葉マーカーNkx2.2、NeuroD、HNF6、HNF3bが主に発現した。Pdx1発現は、各処理段階で段階的に高まった(図8)。MEF支持細胞上のhES単細胞の分化hES細胞の膵臓内胚葉への最適な分化を達成するために、最終内胚葉集団は最大数でなければならない。従来、MEF支持細胞上でhESを育てると、最終内胚葉および膵臓内胚葉の達成可能な最も高い濃度がもたらされている。hES単細胞がこの目的を達成できるかどうか決定するために、H1scp4を、MEF支持細胞上に14,000細胞/cm2で播種した。2−メルカプトエタノール溶液を含んだDMEM−F12を含むES細胞培地上で、細胞を成長させた。7日後、細胞は60〜70%のコンフルエントになり、最終内胚葉プロトコルを細胞に適用した。FBSを含むDMEM:F12培地を、2日間、ウェル当たり100μL加え、その後、3日間、100ng/mLアクチビンAおよび2%FBSを含むDMEM:F12培地で処理した。その後、TrypLE(商標)Expressで細胞を取り除き、CXCR4、CD99、およびCD9発現について、FACSにより分析した(図9)。90%を超える細胞がCXCR4、およびCD99を発現した。予想したとおり、8%未満の細胞がCD9を発現した。CXCR4陽性細胞数により決定されるように、単細胞のH1細胞をMEF支持細胞上に播種することにより、最終内胚葉分化が改良される。96ウェルプレートにおけるhES単細胞の分化hES細胞をクラスターで継代することに伴う、ある共通の困難性は、定量することが難しく、等しい割合で成長させられないことである。単細胞は、コンフルエントな単層に成長することができ、実験目的のための等しい播種を確実にするように、継代の前に計数することができるという利点を有する。これらの特質は、成功したスクリーニングを検証するための必須条件である。plates(96ウェルプレート)(Perkin-Elmer)上に、14,000細胞/cm2の密度で播種した。3〜4日間、MEF馴化培地で細胞を成長させ、その後、DE分化プロトコルを用いて処理した。Wnt3a、100ng/mLアクチビンA、および0.5%FBSを含むDMEM:F12で2日間)処理した。その後、両方のサブセットを100ng/mLアクチビンAおよび2%FBSを含むDMEM:F12で3日間処理した。PBSで一晩保存した。CA)の入ったPBSにより、室温で30分間ブロッキングした。Systems)]を、4%ニワトリ血清の中に1:100希釈し、室温で一時間加えた。CA)]をPBSの中に1:200希釈し、PBSで3回洗浄した後の細胞に加えた。Switzerland)を、室温で5分間細胞に加えた。細胞をPBSで1回洗浄し、画像化するため、100μL/ウェルのPBS中に残し、分化したDE細胞の数を決定した。NJ)でプレートを読み取った。Wnt3aによる処理により、ウェル間の変動がほとんど存在しない、最も多いウェル当たりの細胞核数がもたらされた(図10)。Gsk3β阻害剤による処理は、低い細胞生存率を示した。96ウェルフォーマットにおけるロバストで再現性のあるやり方において、Wnt3a処理により、単細胞のES細胞がDEを形成することができることは明らかである。単細胞が96ウェルフォーマットに播種し分化することができることを示した後、新規化合物による処理の感度を決定した。MATRIGEL(商標)でコーティングした96ウェルプレートに、14,000細胞/cm2の密度で播種した。3〜4日間、MEF馴化培地で細胞を成長させ、その後、DE分化実験を進めた。DE分化プロトコルにおけるWnt3aを小分子阻害剤で置換して、全体で13個の新規化合物を、1μMまたは3μMの濃度で3回繰り返し試験した。Wnt3a(10ng/mL)、またはGsk3b阻害剤IX(100nM)を含むウェルを、陽性対照として用いた。単一の化合物を100ng/mLアクチビンA、および0.5%FBSを含むDMEM:F12を加えたもので、すべての分化ウェルを2日間処理し、その後、化合物を含まない100ng/mLアクチビンA、および0.5%FBSを含むDMEM:F12で2日間処理した。上記の実施例11に記載したとおり、プロトコルの終わりで、細胞を固定し、透過化し、ブロッキングし、染色して、Sox17発現および核を決定した。Analyzer上で読み取った。このスクリーニングは、H9scp21が、DE分化プロトコルにおけるWnt3aと同様のやり方で、13個の化合物のうちの3つに対して応答したことを示した(図11)。化合物Aは1μM未満の用量で効果的であり、化合物Bおよび化合物Cは、1μMおよび3μMで効果的であった。効果的な処理範囲(60%を超えるSox17陽性細胞)では、ウェル間の標準偏差は小さかった。したがって、スクリーニング技術により新規の化合物を同定する能力において、単細胞は一貫している。目的物を製造するためのスケールアップを容易にするために、hES細胞は、多くの量になるまで容易に増殖される必要がある。従来、hES細胞を継代するためのコラーゲナーゼ処理では、ローラーボトルまたはシェーカーフラスコでスケールアップすることができない。単細胞として繰り返し増殖し、成長してきたHES細胞は、異なる表面に均等に付着する能力を有する。本実施例では、可能性があるスケールアップ容器として、ローラーボトルを試験した。MA)に14,000細胞/cm2で播種した(6.7×106細胞)。細胞を維持するために、ボトル当たり100mL量のMEF馴化培地を用い、2日ごとに交換した。ボトルを、24時間20rev/時に設定し、残りの時間で60rev/時まで増加させた。細胞はローラーボトルに均等に付着し、4日目の評価時点の後も視認できるほど増殖した。TrypLE(商標)Expressを用いて細胞を取り除き、計数した。ボトル当たり13×106細胞を示す回復した計数を入手し、これは元の播種と比較して、最小の細胞倍化を示している。開始播種細胞の半分未満の細胞がローラーボトルに付着したと推量され、これはより多い実際の細胞増殖がローラーボトルの中で起こったということを示唆している。このことは、単細胞として継代したhES細胞を、自動化されたローラーボトルシステムで増殖することが可能であることを示している。分化万能性を維持しながらの増殖速度を決定するためのさらなる実験を実施するだろう。単細胞hES細胞のトランスフェクション形質転換した細胞型を作るためにDNAを細胞に導入することは、有用な特徴である。DNAには、分化を促進し、または、細胞の選択を可能にする発現ベクター、またはレポーター遺伝子が含まれてもよい。hES細胞は、クラスターではトランスフェクションすることが困難であることが示されてきた。hES単細胞は、トランスフェクション技術を適用できるかもしれない。MATRIGEL(商標)コーティングのプレート上に、20,000細胞/cm2で播種した。MATRIGEL(商標)コーティングの6ウェルプレートの1つのウェル中に播種した。3日後、細胞をCMV−GFPによりトランスフェクションした。ここで、GFPはCMVウイルスプロモーター下でいずれの細胞でも発現する。Opti−MEMに希釈した。5分後に、混合物を室温で組み合わせる。培養細胞を2mLのMEF馴化培地に加える前に、室温で20分間、組み合わされた試薬をインキュベーションした。その後24時間ごとに、培地をMEF馴化培地で置換した。3日後、4%パラホルムアルデヒドにより、室温で20分間、細胞を固定し、その後、PBSで2回洗浄し、PBS中に4°C一晩放置した。Platform)を、室温で5分間、細胞に加えた。Analyzer上で画像化するため、1mL/ウェルのPBS中に残し、トランスフェクション効率を決定した(図12)。HES単細胞は、hESクラスターよりも、トランスフェクション効率において2倍の改良を示している。したがって、hES単細胞は、改良されたトランスフェクション能力を有し、遺伝子組換えすることがより容易である。最適化とともに、おそらく他のトランスフェクション方法、または試薬を用いることにより、単細胞ES細胞トランスフェクションの、より劇的な改良を達成することが可能になるかもしれない。支持細胞層上で培養されたhES細胞クラスターを、細胞外マトリックス上で培養された単細胞のhES細胞へ変換することは、支持細胞の除去を必要とする研究および製造上の設定における、トリプシン、組換えトリプシン(TrypLE(商標))、またはAccutase(商標)(無脊椎動物由来のトリプシン様酵素)のような酵素による哺乳動物細胞の継代は、初代細胞株および不死化細胞株の両方の細胞培養について、従来の標準である。これらの酵素は、細胞の均質な単細胞懸濁液を生み出し、それは、高いスループットフォーマットの384ウェルプレート、またはマルチリットルで測量可能な培養容器と同様の多様な設定で播種することが可能な再現性のあるやり方で、計数し、分析し、操作し、または継代することができる。単細胞継代に明確に利点がある場合、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代する方法を開発することは非常に興味深い。従来の、ヒト胚性幹細胞による最良の実施形態は、胚性細胞をクラスターで維持するような、手動による分解または酵素(コラーゲナーゼまたは中性プロテアーゼ)による継代のいずれかによって、クラスターとして細胞を継代することを必要とする。2008)をもたらしてきた。本願は、TrypLE(商標)またはAccutase(商標)のいずれかを用いたバルク継代方法において、支持細胞から直接MATRIGELへとhES細胞を採取するための単細胞の継代方法を開発するための試みである。この結果は、クラスター状の支持細胞から直接MATRIGEL(商標)へ、hES細胞を継代する方法を採用することは、分化した細胞集団の外観、および外観のために均質でロバストな細胞培養をもたらさない見込みがあるので、不適当であるということを示している。ここで、その方法として、TrypLE(商標)またはAccutase(商標)バルク継代のいずれかであって、MATRIGEL(商標)上へのコラーゲナーゼ継代に基づくクラスターの中間工程を有さないバルク継代を用いている。基づく培養から、支持細胞のないhES細胞の培養へと移行する目的で、H1の37代継代のhES細胞を継代した。そのhES細胞は、hESC培地のMEF支持細胞層により支持され、6ウェルプレートの10cm2ウェル上で5日間育てられてきた。TrypLE(商標)、Accutase(商標)、または1mg/mLのコラーゲナーゼのいずれかにより、細胞を継代した。PBS(Ca2+またはMg2+を全く含まない)を各ウェルに加え、その後、1mLの室温の酵素(コラーゲナーゼ、Accutase(商標)、またはTrypLE(商標))を、各ウェルに加えた。Accutase(商標)またはTrypLE(商標)を、室温にした後のストック濃度で用いた。DMEM/F12とともに混合し、滅菌ろ過し、使用前に室温にした。細胞を酵素中で、37°Cで10分間インキュベーションした。Accutase(商標)またはTrypLE(商標)により、10分間処理の後、全細胞が完全にディッシュから浮き上がった。コラーゲナーゼは、10分間のインキュベーション後、細胞を浮き上がらせなかった。そこで、10分間のインキュベーション後、10mLガラスピペットで、細胞をスクラッピングした。1mLの2%Probumin(プロブミン)を含んだDMEM−F12を各ウェルに加え、ウェル中の組み合わせた全量を、50mL滅菌コニカルチューブに移して、可能な限り多くの細胞を浮き上がらせ、懸濁した。細胞を、200×gで5分間遠心分離し、その後、2%Probuminによりさらに洗浄し、200×gで5分間遠心分離した。その後、細胞をMEF馴化培地に再懸濁し、1〜3.5比率でMATRIGEL(商標)(DMEM中に1:30希釈)コーティングしたT25フラスコに蒔き、37°C、5%CO2の高湿度インキュベーター中に置いた。hemocytometer(改良Neubauer血球計数器)により計数することで、細胞数を計算した。Accutase(商標)により浮き上がった細胞は、3.8×106細胞/10cm2ウェルの密度であった。TrypLE(商標)により浮き上がった細胞は、3.7×106細胞/10cm2ウェルの密度であった。コラーゲナーゼは、コロニー状のため、計数できなかった。1〜3.5分割比である場合、Accutase処理細胞を、2.72×106細胞/T25フラスコ、すなわち108,000細胞/cm2の播種密度で蒔き、TrypLE(商標)処理細胞を、2.65×106細胞/T25フラスコ、すなわち105,000細胞/cm2の播種密度で蒔いた。コラーゲナーゼ処理細胞は同様の密度(105,000〜108,000細胞/cm2)で蒔いたとみなす。いうのも、酵素処理前のウェルからウェルへのhES密度に、感知できるほどの違いがないからである。次の継代で計数する目的のために、さらなるフラスコを、コラーゲナーゼで浮き上がらせた細胞によりプレーティングした。【0215】16μg/mLのbFGFを補ったMEF馴化培地を毎日交換して、4日間、細胞を維持した。培養4日後、培養物はコンフルエントになり、単細胞処理したhES細胞は、線維芽細胞の偶発的なポケットを有するhES細胞の単層を形成した。hES細胞を継代したクラスターは、hES細胞の大きなコロニー状のクラスターを形成した(図13)。その後、これらの細胞を再び継代した。上記に説明したとおり、細胞を酵素中で、37°Cで10分間インキュベーションした。Accutase(商標)およびTrypLE(商標)により、10分間処理の後、細胞がプラスチックおよびMATRIGEL(商標)から浮き上がった。コラーゲナーゼは細胞を浮き上がらせなかった。そこで、細胞をさらに、37°Cで、全体で45分間インキュベーションした。Accutase(商標)でさらなるフラスコを浮き上がらせた。hemocytometerにより単細胞を計数した。【0217】その後、2mLの2%Probuminを含むDMEM−F12を、酵素インキュベーション後、各フラスコに加えた。フラスコの全量(〜4mL)を5〜10回ピペッティングで上下させ、可能な限り多くの細胞が懸濁するようにした。その後、懸濁液を、50mLコニカルチューブに移し、200×gで5分間遠心分離した。その後、16μg/mLのbFGFを補ったMEF馴化培地に、細胞を再懸濁し、その後、1:30MATRIGEL(商標)をプレコーティングしたT25フラスコに、1:4の比率で蒔いた。培養4日後のAccutase(商標)継代細胞は、全部で5.6×106細胞(223,000細胞/cm2)の密度であり、培養4日後のTrypLE(商標)継代細胞は、全部で5.05×106細胞(202,000細胞/cm2)の密度であり、培養4日後のコラーゲナーゼ継代細胞は、3.45×106細胞(138,000細胞/cm2)の密度であった。細胞を1:4比率で継代したならば、Accutase(商標)継代については、58,000細胞/cm2の密度で細胞を蒔き、TrypLE(商標)継代については、51,000細胞/cm2の密度で細胞を蒔き、35,000細胞/cm2であった。【0219】その後、16ng/mLのbFGFを補ったMEF馴化培地を毎日交換して、細胞をさらに6日間成長させた。コラーゲナーゼにより継代した細胞は、密で均質な細胞の大きなコロニーを形成し、分化した線維芽様細胞はあまり見られない。Accutase(商標)またはTrypLE(商標)により継代した細胞は、ゆっくりと、成長を止める時点を超えて成長するか、または、分化中のhES細胞から形成されたような線維芽様細胞を過剰成長させた(図14)。【0220】これらの結果は、クラスター状の継代(コラーゲナーゼまたは中性プロテアーゼ)を助けるような手動継代または酵素を用いた、支持細胞から支持細胞のない(MATRIGEL(商標))培養へと移行させる中間段階が、単細胞継代を開始する前に、細胞をMATRIGEL(商標)上の支持細胞のない培養に慣れさせるのに最も良いということを示唆している。本明細書全体を通じて引用された文献を、参照により、その全体を本願に組み入れる。実施例や好ましい実施態様を参照することにより、本発明の様々な態様を例示してきたが、本発明を、前述の記載により規定するものではなく、特許法の理念の下、適切に解釈された特許請求の範囲により規定するということが、よく理解されるだろう。〔実施の態様〕なお、本願の実施態様は以下のとおりである。分化させる工程と、を含む、方法。トリプシン、TrypLE(商標)SELECT、TrypLE(商標)EXPRESS、およびトリプシン/EDTAから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。約0.5g/L〜約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。約1×〜約0.001×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。1×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。MATRIGEL(商標)、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。MATRIGEL(商標)である、方法。前記MATRIGEL(商標)が、約1:30〜約1:10希釈で用いられる、方法。前記MATRIGEL(商標)が、1:10希釈で用いられる、方法。胚性幹細胞である、方法。前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。その後分化する、方法。組織培養基質上に蒔く工程と、を含む、方法。トリプシン、TrypLE(商標)SELECT、TrypLE(商標)EXPRESS、およびトリプシン/EDTAから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。約0.5g/L〜約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。約1×〜約0.001×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。1×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。MATRIGEL(商標)、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。MATRIGEL(商標)である、方法。MATRIGEL(商標)が、約1:30〜約1:10希釈で用いられる、方法。MATRIGEL(商標)が、1:30希釈で用いられる、方法。胚性幹細胞である、方法。前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。その後分化する、方法。新しい組織培養基質上に蒔く工程と、を含む、方法。トリプシン、TrypLE(商標)SELECT、TrypLE(商標)EXPRESS、およびトリプシン/EDTAから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。約0.5g/L〜約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。約1×〜約0.001×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。1×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約2分〜約5分の処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。MATRIGEL(商標)、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。MATRIGEL(商標)である、方法。MATRIGEL(商標)が、約1:30〜約1:10希釈で用いられる、方法。MATRIGEL(商標)が、1:30希釈で用いられる、方法。胚性幹細胞である、方法。前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。前記細胞を放出し、放出された前記細胞を別の組織培養基質上に蒔くことによって、別の組織培養基質上へ継代される、方法。その後分化する、方法。MATRIGEL(商標)上で育てられたH9ccp33ヒトES細胞の4倍拡大図。【図2】最終内胚葉を導くための分化処理後のCXCR4を発現する細胞の割合(%)。MATRIGEL(商標)上で育てられたH9scp22ヒトES単細胞の4倍拡大図。【図5】hES細胞の分化万能性マーカー発現についてのFACSによる評価。【図6】クラスターとして38回継代した後、単細胞として20代継代したH9hES単細胞の染色体標本。【図7】最終内胚葉分化の間のH9単細胞およびH9細胞クラスターの比較。【図8】H9単細胞(22代継代)を分化させた後の膵臓内胚葉マーカーにおける増加。【図9】hES単細胞はMEF上で分化することができる。【図10】hES単細胞(H9scp18)は、96ウェルフォーマットで、最終内胚葉へと分化することができる。【図11】hES単細胞(H9scp19)によるファーマコフォアスクリーニング。【図12】H9p33hES細胞クラスターおよびH9p33単細胞間のトランスフェクション効率の評価。14】MEFから単細胞として直接MATRIGEL(商標)へと継代したH1hES細胞は、自発的に分化する。分化させる工程と、を含む、方法。トリプシン、TrypLE(商標)SELECT、TrypLE(商標)EXPRESS、およびトリプシン/EDTAから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。約0.5g/L〜約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。約1×〜約0.001×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。1×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。MATRIGEL(商標)、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。MATRIGEL(商標)である、方法。前記MATRIGEL(商標)が、約1:30〜約1:10希釈で用いられる、方法。前記MATRIGEL(商標)が、1:10希釈で用いられる、方法。胚性幹細胞である、方法。前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。その後分化する、方法。組織培養基質上に蒔く工程と、を含む、方法。トリプシン、TrypLE(商標)SELECT、TrypLE(商標)EXPRESS、およびトリプシン/EDTAから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。約0.5g/L〜約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。約1×〜約0.001×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。1×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。MATRIGEL(商標)、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。MATRIGEL(商標)である、方法。MATRIGEL(商標)が、約1:30〜約1:10希釈で用いられる、方法。MATRIGEL(商標)が、1:30希釈で用いられる、方法。胚性幹細胞である、方法。前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。その後分化する、方法。新しい組織培養基質上に蒔く工程と、を含む、方法。トリプシン、TrypLE(商標)SELECT、TrypLE(商標)EXPRESS、およびトリプシン/EDTAから成る群から選択される酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。約0.5g/L〜約2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。2.5g/Lの濃度の酵素による処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約2分〜約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。酵素による約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。約1×〜約0.001×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。1×の濃度のTrypLE(商標)EXPRESSによる処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約2分〜約5分の処理によって、単細胞として放出される、方法。TrypLE(商標)EXPRESSによる約5分間の処理によって、単細胞として放出される、方法。MATRIGEL(商標)、フィブロネクチン、ラミニン、ヒト血清、およびコラーゲンから成る群から選択される、方法。MATRIGEL(商標)である、方法。MATRIGEL(商標)が、約1:30〜約1:10希釈で用いられる、方法。MATRIGEL(商標)が、1:30希釈で用いられる、方法。胚性幹細胞である、方法。前記胚性幹細胞が、ヒト由来である、方法。前記細胞を放出し、放出された前記細胞を別の組織培養基質上に蒔くことによって、別の組織培養基質上へ継代される、方法。その後分化する、方法。ekouhou.net。