容易にするための方法に関する。容易にするための方法に関する。胚性幹細胞のような分化万能性幹細胞は、あらゆる成熟細胞型へと分化する能力を有する。このように、胚性幹細胞は、疾患、感染、または先天性異常の結果、損傷された器官に対する置換細胞および置換組織の原料であるかもしれない。vitroで細胞を増殖することが困難なため、胚性幹細胞が置換細胞の原料として用いられる可能性が妨げられている。未分化の胚性幹細胞を培養する従来方法は、例えば、支持細胞層の存在下で胚性幹細胞を培養することのような、複雑な培養条件を必要としている。支持細胞培養物に曝すことにより入手された培地が、胚性幹細胞を培養するために用いられるかもしれない。これらの方法を用いる培養システムは、培養されるべき幹細胞とは異なる種から入手された細胞(異種細胞)をしばしば用いる。付加的に、これらの培養システムに、動物血清を補ってもよい。pp.1145-1147)が、マウスの胚線維芽細胞の支持細胞層を用いたヒト胚盤胞由来の胚性幹細胞株の培養を開示している。別の例では、国際公開第2005014799号が、哺乳類細胞の維持、増殖、および分化のための馴化培地を開示している。Hepatocyte)と命名された、分化し不死化された形質転換肝細胞の細胞分泌活性により馴化される。【0006】しかしながら、異種細胞、または異種細胞産物の使用によって、このような方法で作られた結果的な胚性幹細胞集団が、免疫原性のウイルスタンパク質、および/または、異種タンパク質により汚染されているかもしれない危険性が高まる。2003)は、ヒト胚性幹細胞培養を支持する能力について、11個の成人、胎児、および新生児の異なる支持細胞層を評価した。培養されたヒト胚性幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞の形態を保有し、分化万能性のままである。(pPS)の成長を助ける培地、およびこのような培地を産生するために有用な細胞株を開示している。米国特許第6642048号は、「本発明には、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株が含まれる。本開示では、このような細胞株を生み出し、培地を加工し、馴化培地を用いて幹細胞を成長させるための方法を説明し、例示する。成長を助ける培地を生み出すような細胞株を開示している。20020072117号はまた、初代支持細胞層としての細胞株の使用を開示している。2005)が、ヒト胚性幹細胞由来の支持細胞層上で、ヒト胚性幹細胞を長期間成長させるための方法を開示している。2004)が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子組換えしたヒト胚性幹細胞派生物から得られた馴化培地を開示している。2005)が、ヒト胚性幹細胞の自発分化に由来した支持細胞システムを開示している。2004)が、ヒト胎盤から得られた支持細胞の原料を開示している。2003)は、ヒト包皮由来の支持細胞層を開示している。支持細胞層を開示している。factor)を補った、血清を含まない培地を用いる。2005)が、支持細胞も血清も含まない培養システムを開示しており、そのシステムでは、未馴化の血清置換培地(SR)であって、胚性幹細胞の自己再生を引き起こすことができる異なる成長因子が補われた、血清置換培地中で、胚性幹細胞が維持される。2006)が、線維芽細胞または馴化培地の不存在下で、bFGFを補った培地を用いて、ヒト胚性幹細胞を長期間培養するための方法を開示している。原料から補われ、培地が、支持細胞または馴化培地なしに、未分化状態の幹細胞の増殖を助ける、幹細胞を培養することを含む。20050233446号が、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞を培養するのに有用な限定培地を開示している。溶液において、培地は、培養されるべき幹細胞と比較して実質的に等張である。所与の培養において、特定の培地は、基礎培地と、始原幹細胞の実質的に未分化な成長を助けるのに必要な各量のbFGF、インスリン、およびアスコルビン酸とを含む。別の例では、米国特許第6800480号が「1つの実施態様では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を育てるための細胞培養培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的である低浸透圧低内毒素の基礎培地を含む、細胞培養培地が提供される。基礎培地は、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的な栄養血清と、支持細胞および支持細胞由来の細胞外マトリックス成分から成る群から選択される基質と組み合わされる。培地は、非必須アミノ酸と、抗酸化剤と、ヌクレオシドおよびピルビン酸塩から成る群から選択される第1の成長因子とをさらに含む。培養する方法を提供する。原料から補われた線維芽成長因子の存在する培養において、幹細胞が培養される。添加により不必要になる。【0022】さらなる例では、国際公開第2005065354号が、本質的に支持細胞も血清も含まない規定の等張培養培地であって、(a)基礎培地と、(b)実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のbFGFと、(c)実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のインスリンと、(d)実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のアスコルビン酸とを含む、培地を開示している。(FGF)ファミリーの一員、またはニコチンアミド(NIC)に、所望の結果を達成するのに十分な時間、幹細胞を曝すことを含む。胚性幹細胞は、研究および薬剤スクリーニングのための潜在的な資源を提供する。現在のところ、ヒトES細胞株の大規模培養は、問題があり、実質的な課題を提供する。これらの課題に対して可能性のある解決策は、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代し、培養することである。計数、トランスフェクション、および同様のものといった標準的な組織培養技術に、単細胞はより適している。(FACS)により単離された単細胞から、hES細胞株を産生し増殖するための方法を提供する。2005158852号が、「単細胞のヒト胚性幹細胞の成長及び生存を改善するための」方法を開示している。「その方法には、単細胞の未分化のHES細胞を入手する工程と、単細胞の未分化の細胞を細胞外マトリックス(ECM)と混合し、細胞を取り囲む工程と、成長環境で栄養培地とともに、支持細胞上にその混合物を播種する工程と、が含まれる。61-9)が、「フローサイトメトリーで単細胞調製物を分取することによる、親株hES3に由来する3つのヒト胚性幹細胞(hESC)クローン(hES3.1、3.2、および3.3)についての最初の報告を開示している。細胞分取前後の単細胞調製物の生存率は、98%を超えたままであった」。【0028】しかしながら、ヒト胚性幹細胞を単細胞として継代し培養することにより、遺伝子異常、および分化万能性消失が引き起こされる。培養条件は、分化万能性および遺伝的安定性の維持において重要である。hES細胞株の継代は、手動で実施されるか、コラーゲナーゼ、リベラーゼ、またはディスパーゼのような酵素剤とともに実施される。JS他は、「3つの独立したヒト胚性幹細胞株における、5つの独立した場合での第17染色体長腕の獲得を伴う核型変化」の存在について記している。別の例では、Buzzard他が、「我々は、1つの核型変化事象を検出したのみであった。・・・・用いた培養方法は、我々の結果といくつかの関連があるかもしれない。いうのも、我々の方法は、他の大部分のグループが用いたものとはかなり異なっているからである。一般的に、先欠けピペットの角でコロニーをまず切除することにより、ヒトES細胞を7日後に継代する。・・・細胞分離の酵素的方法、または化学的方法を、この方法は全く伴わない。説明するかもしれないと推測する。提供できるよりも多い量のhES細胞を必要とする実験において、長期間の手動増殖条件後、その後、限定バルク継代をすることにより、hES細胞における正常核型を維持することが可能かもしれない。BC他が、「結果は、2番目のプロトコル(ゆるやかなピペッティングを伴うトリプシン処理)が、1番目のプロトコル(スクラッチングを伴うコラーゲナーゼ処理)よりも、細胞の生存率に対してそれほど有害ではないということを示した。このことは同じく、より高い凍結解凍生存率を説明する。K.他が、「我々は、完全解離に耐性のあるhESCサブラインを確立した。これらの細胞は、高い再プレーティング効率を示し、高いクローニング効率をも示しており、3つの胚葉に分化する能力を維持している。本発明は、酵素を用いて単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。本発明は、その後の分化万能性の消失、および染色体異常の獲得が全く存在しないような、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。分化させるための方法を提供し、その方法は、(a)分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、(b)分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、(c)単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、(d)細胞を分化させる工程と、を含む。維持するための方法を提供し、その方法は、(a)分化万能性幹細胞を入手する工程と、(b)分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、(c)単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。継代するための方法を提供し、その方法は、(a)分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、(b)分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、(c)単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、(d)単細胞の分化万能性幹細胞を増殖させる工程と、(e)単細胞の分化万能性幹細胞を放出する工程と、(f)単細胞の分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。MATRIGEL(商標)上で育てられたH9ccp33ヒトES細胞の4倍拡大図。図2:最終内胚葉を導くための分化処理後のCXCR4を発現する細胞の割合(%)。暗灰色:45〜55代継代のH1細胞クラスター(H1cc)による6つのDE分化実験の平均。黒色:47〜54代継代のH1単細胞(H1sc)による2つのDE分化実験の平均。白色:37〜55代継代のH9細胞クラスター(H9cc)による5つのDE分化実験の平均。明灰色:36〜48代継代のH9単細胞(H9sc)による3つのDE分化実験の平均。エラーバーは、反復実験の標準偏差を示す。図3:膵臓内分泌分化プロトコルに14日または17日曝した後のリアルタイムPCRによる遺伝子発現分析。(A)H9単細胞およびH9細胞クラスターを37代継代で分析した。(B)H1p47およびH9p37の細胞クラスターおよび単細胞の膵臓内胚葉段階への継続。14日および17日後のPdx1の発現。未処理細胞に対する指示マーカーの遺伝子発現を、各データセットについての値1として設定した。MATRIGEL(商標)上で育てられたH9scp22ヒトES単細胞の4倍拡大図。図5:hES細胞の分化万能性マーカー発現についてのFACSによる評価。X軸上に列記された指示マーカーについて陽性の細胞の割合(%)。図6:クラスターとして38回継代した後、単細胞として20代継代したH9hES単細胞の染色体標本。図7:最終内胚葉分化の間のH9単細胞およびH9細胞クラスターの比較。細胞を最終内胚葉分化プロトコルに曝した後のCXCR4について陽性の細胞の割合(%)を示す。H9sc−pについてはN=2、H9ccについてはN=5である。エラーバーは、反復実験の平均の標準偏差を示す。11日、14日、または17日後のリアルタイムPCRによる遺伝子発現分析を示す。14日および17日の値は、6ウェルプレートのうちの2つのウェルの平均である。図9:hES単細胞は、MEF上で分化することができる。FACSは、MEF支持細胞上で育てられ、最終内胚葉に分化したH1scp4細胞の結果である。最終内胚葉マーカーCXCR4(CD184)は、未分化細胞0%に対し、細胞のうちの89%で発現した(図5参照)。図10:hES単細胞(H9scp18)は、96ウェルフォーマットで、最終内胚葉へと分化することができる。Sox17陽性検出についての免疫蛍光データを示す。8つのウェルを、実験の間、MEF馴化培地で処理した:MEF培地。8つのウェルを、成分を含まない基礎分化培地で処理した:成分なし。8つのウェルの反復データセットを、各データバーについて平均した。全40個のウェルを、それぞれWnt3aまたはGsk3b阻害剤で処理し、各データセットについて平均した。エラーバーは、各反復セットについての標準偏差を示す。図11:hES単細胞(H9scp19)によるファーマコフォアスクリーニング。全13個の実験的な小分子化合物を、最終内胚葉分化プロトコルにおけるWnt3aを置換する能力について試験した。3つの有効な可能物を示す。データセットは、2つ以上のウェルにおけるSox17陽性細胞の平均を示す。MEF馴化培地または基礎培地により処理された細胞を、陰性対照として用いた。図12:H9p33hES細胞クラスターおよびH9p33単細胞間のトランスフェクション効率の評価。CA)、および4μgDNA(黒色バー)または8μgDNA(灰色バー)を用いて、CMV−GFPを細胞にトランスフェクションした。図13:MEF上で育て、その後クラスターまたは単細胞としてMATRIGEL(商標)へと継代したH1hES細胞の位相顕微鏡写真。MEFからMATRIGEL(商標)へと、コラーゲナーゼにより継代した37代継代のH1hES細胞は、いくつかのゆるく分化した細胞とともに別々の密接に固まったコロニーを形成する。Accutase(商標)またはTrypLE(商標)により1回継代したH1hES細胞は、密接に固まった分化細胞のポケットを伴う単層の培養物を形成する。図14:MEFから、単細胞として直接MATRIGEL(商標)へと継代したH1hES細胞は、自発的に分化する。パネルA:MEFからMATRIGEL(商標)へのAccutase(商標)による2代継代後も集団のままである細胞の割合(%)。パネルB:MEFからMATRIGEL(商標)へのAccutase(商標)による2代継代後のhES細胞での分化万能性および分化についてのマーカー発現。開示を明確にするために、しかし限定を目的とするものではないが、発明の詳細な説明を、本発明の特定の特徴、実施態様、または適用を開示し例示している以下のサブセクションに分割する。最終分化細胞が含まれる。vitroで、多様な胚葉(内胚葉、中胚葉、および外胚葉)から様々な細胞系統の機能性細胞へと分化する能力によっても特徴付けられ、移植後、多様な胚葉の組織を生じる能力や、胚盤胞への注入後、すべてとは限らないが、実質的にほとんどの組織に寄与する能力によっても特徴付けられる。幹細胞は発生能力に応じて、以下のように分類される。(1)すべての胚性細胞型および胚外性細胞型を生み出すことができることを意味する、分化全能性(totipotent)、(2)すべての胚性細胞型を生み出すことができることを意味する、分化万能性(pluripotent)、(3)すべてではないが特定の組織、器官、または生理系内の細胞系統のサブセットを生み出すことができることを意味する、分化多能性(multipotent)[例えば、造血幹細胞(HSC)は、HSC(自己再生)、血液細胞に限定された複分化性前駆体、ならびに血液の正常成分であるすべての細胞型および要素(例えば、血小板)を含む子孫細胞を生み出すことができる。]、(4)分化多能性幹細胞よりも限定された細胞系統のサブセットを生み出すことができることを意味する、複分化性(oligopotent)、(5)単一の細胞系統(例えば、精原幹細胞)を生み出すことができることを意味する、単分化性(unipotent)である。分化は、まだ特殊化されていない(「まだコミットしていない」)細胞、またはあまり特殊化されていない細胞が、例えば神経細胞または筋細胞のような、特殊化された細胞の特徴を獲得する過程である。分化した細胞、または分化を誘導された細胞は、細胞系統内のより特殊化された(「コミットした」)地位に就いたものである。用語「コミットした」とは、分化過程に適用される場合、分化経路をある時点まで進んだ細胞をいい、その時点とは、通常環境下で、特殊な細胞型または細胞型のサブセットへと分化し続けるだろうが、通常環境下で、異なる細胞型へと分化することができず、または、あまり分化していない細胞型へと戻ることができない時点である。脱分化とは、細胞系統内のあまり特殊化していない(すなわち、あまりコミットしていない)地位へと戻る過程をいう。本願で用いるように、細胞系統とは、細胞の遺伝的性質(すなわち、細胞がどの細胞に由来するか、どんな細胞を生み出すことができるか)を規定する。細胞系統は、発生および分化の遺伝的スキーム内に細胞を配置する。系統特異的マーカーとは、目的の細胞系統の表現型と特異的に関連付けられる特徴をいい、まだコミットしていない細胞の目的の系統に対する分化を評価するために用いられ得る。培養における細胞を説明するために、様々な用語が用いられる。「維持」とは、概して、細胞の成長および/または分裂を促進するが、細胞のより大きな集団を結果的に生じさせるかもしれないし、生じさせないかもしれないような条件下で、成長培地に細胞を置くことをいう。「継代」とは、ある培養容器から細胞を取り除き、細胞成長および/または分裂を促進するような条件下で、それらをその次の培養容器に置く過程をいう。特異的な細胞集団、または細胞株とは、時折、継代されてきた回数をいい、または、その回数で特徴付けられる。10回継代されてきた培養細胞集団を、P10培養と呼んでもよい。初代培養(すなわち、組織から細胞を単離した後の最初の培養)を、P0と表す。最初の継代培養後、その細胞を二次培養(P1または1代継代)という。2回目の継代培養後、その細胞は三次培養(P2または2代継代)となる。本分野の当業者には、継代中に多くの集団倍化があるかもしれず、したがって、培養の集団倍化数は、継代数よりも多いということが理解されるだろう。継代間の時間が含まれるが、これらに限定されない。protein(α−フェトプロテインタンパク質)」とは、肝臓発生のはじまりに産生される抗原をいう。AFPは、胚外細胞で発現するかもしれない。「β細胞系統」とは、転写因子PDX−1と、以下の転写因子のうちの少なくとも1つとについて遺伝子発現が陽性の細胞をいう。その転写因子とは、NGN−3、Nkx2.2、Nkx6.1、NeuroD、Isl−1、HNF−3β、MAFA、Pax4、およびPax6である。β細胞系統に特異的なマーカーを発現する細胞には、β細胞が含まれる。本願で用いられる「Brachyury」とは、T−ボックス遺伝子ファミリーの一員である。それは、原条および中胚葉細胞についてのマーカーである。本願で用いられる「最終内胚葉系に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞をいう。protein、FGF4、CD48、eomesodermin(EOMES)、DKK4、FGF17、GATA−6、CXCR4、C−Kit、CD99、またはOTX2である。最終内胚葉細胞が含まれる。本願で用いられる「CD99」とは、アクセッション番号NM_002414の遺伝子によりコードされるタンパク質である。本願で用いられる「膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、PDX−1、HNF−1β、PTF−1α、HNF−6、またはHB9である。膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞には、膵臓内胚葉細胞が含まれる。本願で用いられる「膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞をいう。そのマーカーとは、NGN−3、NeuroD、Islet-1、PDX−1、NKX6.1、Pax−4、Ngn−3、またはPTF−1αである。ホルモン発現細胞、および、膵臓ホルモン分泌細胞、ならびにβ細胞系統の細胞が含まれる。1(SDF−1)receptor(ストロマ細胞由来因子1受容体)をいい、「LESTR」または「fusin(フーシン)」としても知られている。原腸形成したマウス胚において、CXCR4は、最終内胚葉および中胚葉で発現するが、胚外内胚葉では発現しない。endoderm)」とは、原腸形成中に胚盤葉上層から生じた細胞の特徴を有し、胃腸管およびその派生物を形成するような細胞をいう。最終内胚葉は、以下のマーカーを発現する。そのマーカーは、CXCR4、HNF−3β、GATA−4、SOX−17、Cerberus、OTX2、goosecoid、c−Kit、CD99、およびMixl1である。本願で用いられる「胚外内胚葉」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞集団をいう。そのマーカーは、SOX−7、AFP、およびSPARCである。「GATA−4」および「GATA−6」は、GATA転写因子ファミリーの一員である。この転写因子ファミリーは、TGF−βシグナル伝達により誘導され、初期内胚葉マーカーの維持に貢献する。腎臓を含む数多くの胎児組織および成人組織で発現するグルコース輸送体分子をいう。本願で用いられる「goosecoid」または「GSC」とは、原口の原口背唇で発現するホメオドメイン転写因子をいう。本願で用いられる「Islet-1」または「Isl−1」は、転写因子のLIM/ホメオドメインファミリーの一員であり、発生中の膵臓で発現する。本願で用いられる「MafA」は、膵臓で発現する転写因子であり、インスリンの生合成や分泌に関わる遺伝子の発現を制御する。本願で用いられる「マーカー」は、目的の細胞において差異のある発現をする核酸、またはポリペプチド分子である。本内容において、差異のある発現とは、陽性マーカーについては、増加したレベルを意味し、陰性マーカーについては、低下したレベルを意味する。マーカー核酸またはポリペプチドの検出可能なレベルは、目的の細胞において、他の細胞と比較して十分に高いものであるか、低いものであり、その結果、本分野で既知の、任意の様々な方法を用いて、目的の細胞を同定し、他の細胞と区別することができる。本願で用いられる「中内胚葉細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞をいう。そのマーカーは、CD48、eomesodermin(EOMES)、SOX−17、DKK4、HNF−3β、GSC、FGF17、GATA−6である。本願で用いられる「Nodal」は、タンパク質のTGFβスーパーファミリーの一員である。対するOct−4の関係は、未分化の分化万能性幹細胞に密接に限定された発現により示される。体細胞系統への分化の際、Oct−4の発現は急速に消失する。「膵臓ホルモン発現細胞」とは、以下のホルモンの少なくとも1つを発現することができる細胞をいう。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。本願で用いられる「膵臓ホルモン分泌細胞」は、以下のホルモンのうちの少なくとも1つを分泌することができる細胞をいう。そのホルモンは、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、および膵臓ポリペプチドである。本願で用いられる「PDX−1」とは、膵臓発生と関連するホメオドメイン転写因子をいう。本願で用いられる「前原条細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞をいう。そのマーカーは、NodalまたはFGF8である。本願で用いられる「原条細胞」とは、以下のマーカーのうちの少なくとも1つを発現する細胞をいう。protein、またはFGF4である。factor-1(PTF1)(膵臓転写因子1)の配列特異的DNA結合サブユニットである、48kDの基本的なヘリックス−ループ−ヘリックスタンパク質をいう。cystein(酸性でシステインリッチな分泌性タンパク質)」としても知られている。Antigen-1(ステージ特異的胚性抗原1)]は、マウスのテラトカルシノーマ幹細胞(EC)、マウスおよびヒトの胚性胚細胞(EG)、およびマウスの胚性幹細胞(ES)の表面に存在する糖脂質表面抗原である。Antigen-3(ステージ特異的胚性抗原3)]は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞(EC)、ヒトの胚性胚細胞(EG)、およびヒトの胚性幹細胞(ES)の表面に存在する糖脂質表面抗原である。Antigen-4(ステージ特異的胚性抗原4)]は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞(EC)、ヒトの胚性胚細胞(EG)、およびヒトの胚性幹細胞(ES)の表面に存在する糖脂質表面抗原である。「TRA1−60」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞(EC)、ヒトの胚性胚細胞(EG)、およびヒトの胚性幹細胞(ES)の表面に発現される硫酸ケラチン関連抗原である。「TRA1−81」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞(EC)、ヒトの胚性胚細胞(EG)、およびヒトの胚性幹細胞(ES)の表面に発現されるケラチン硫酸関連抗原である。「TRA2−49」は、ヒトのテラトカルシノーマ幹細胞(EC)、およびヒトの胚性幹細胞(ES)の表面で発現するアルカリホスファターゼアイソザイムである。本発明は、酵素を用いて、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。本発明は、その後の分化万能性の消失、および染色体異常の獲得が全くないような、単細胞として放出された分化万能性幹細胞の維持、継代、および分化のための方法を提供する。分化させるための方法を提供し、その方法は、(a)分化万能性幹細胞をクラスターとして培養する工程と、(b)分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、(c)単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、(d)単細胞の分化万能性幹細胞を分化させる工程と、を含む。クラスターは、酵素処理により単細胞として放出されてもよい。酵素処理は、TrypLE(商標)Express、あるいはTrypLE(商標)Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン/EDTAによるものであってもよい。酵素処理は、約2分〜約5分間であってもよい。酵素処理は、約5分間である。酵素は、約0.5g/L〜約2.5g/Lの濃度で用いられてもよい。クラスターは、TrypLE(商標)EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。別の実施態様では、胚性幹細胞はヒト由来である。【0098】1つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。基質はMATRIGEL(商標)であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。【0099】1つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも1つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。【0100】1つの実施態様では、組織培養基質は、MATRIGEL(商標)である。MATRIGEL(商標)は、約1:30〜約1:10希釈で用いられてもよい。1つの実施態様では、MATRIGEL(商標)は、1:10希釈で用いられる。単細胞の分化万能性幹細胞は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。維持するための方法を提供し、その方法は、(a)分化万能性幹細胞のクラスターを入手する工程と、(b)分化万能性幹細胞を単細胞として放出する工程と、(c)単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔く工程と、を含む。クラスターは、酵素処理により、単細胞として放出されてもよい。酵素処理は、TrypLE(商標)Express、あるいはTrypLE(商標)Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン/EDTAによるものであってもよい。酵素処理は、約2分〜約5分間であってもよい。酵素処理は、約5分間である。酵素は、約0.5g/L〜2.5g/Lの濃度で用いられてもよい。クラスターは、TrypLE(商標)EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。別の実施態様では、胚性幹細胞はヒト由来である。【0108】1つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。MATRIGEL(商標)であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。【0109】1つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも1つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。MATRIGEL(商標)である。MATRIGEL(商標)は、約1:30〜約1:10希釈で用いられてもよい。1つの実施態様では、MATRIGEL(商標)は、1:30希釈で用いられる。単細胞の分化万能性幹細胞は、最終内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内胚葉系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。単細胞の分化万能性幹細胞は、膵臓内分泌系統に特徴的なマーカーを発現する細胞へと分化してもよい。継代するための方法を提供し、その方法は、(a)分化万能性幹細胞のクラスターを入手することと、(b)分化万能性幹細胞を単細胞として放出することと、(c)単細胞の分化万能性幹細胞を組織培養基質上に蒔くことと、(d)単細胞の分化万能性幹細胞を増殖させることと、(e)単細胞の分化万能性幹細胞を放出することと、(f)単細胞の分化万能性幹細胞を新しい組織培養基質上に蒔くことと、を含む。クラスターは、酵素処理により、単細胞として放出されてもよい。Select、あるいはトリプシン、あるいはトリプシン/EDTAによるものであってもよい。酵素処理は、約2分〜約5分間であってもよい。酵素処理は、約5分間である。酵素は、約0.5g/L〜2.5g/L酵素の濃度で用いられてもよい。クラスターは、TrypLE(商標)EXPRESSを用いて、単細胞として放出される。【0116】1つの実施態様では、単細胞の分化万能性細胞は、細胞を再び新しい組織培養基質上への酵素的な継代を行う前に、約70〜80%の密度まで育てられる。単細胞の分化万能性幹細胞を1回継代してもよいし、本発明の方法を用いて、1回よりも多く継代してもよい。別の実施態様では、胚性幹細胞は、ヒト由来である。【0118】1つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、組織培養基質上に蒔かれる。MATRIGEL(商標)であってもよいし、あるいは、基質はフィブロネクチンであってもよいし、あるいは、基質はラミニンであってもよいし、あるいは、基質はヒト血清であってもよいし、あるいは、基質はコラーゲンであってもよい。【0119】1つの実施態様では、放出された単細胞の分化万能性細胞は、三次元支持体上に蒔かれる。支持体は、少なくとも1つの薬剤であって、放出された単細胞の分化万能性細胞の生存および機能を促進するような薬剤とともに組み込まれてもよい。本発明の目的のための使用に適した支持体材料には、泡、スポンジ、ゲル、ヒドロゲル、織物、および不織状構造物の形態の、合成材料および天然材料が含まれる。MATRIGEL(商標)である。MATRIGEL(商標)は、約1:30〜約1:10希釈で用いられてもよい。1つの実施態様では、MATRIGEL(商標)は、1:30希釈で用いられる。vitroでの分化により、結果的に、(もし存在するならば)SSEA−4、Tra−1−60、およびTra−1−81の発現が消失し、SSEA−1の発現が高まる。Redを基質として染色することにより検出することができる。未分化の分化万能性幹細胞は一般的に、Oct−4およびTERTを発現し、これはRT−PCRにより検出される。増殖された分化万能性幹細胞の望ましい別の表現型は、3つの胚葉すべて(内胚葉、中胚葉、および外胚葉)の細胞へと分化する能力である。(SCID)マウスに細胞を注入し、4%パラホルムアルデヒドを用いて生じたテラトーマを固定し、その後、3つの胚葉に由来する細胞型のエビデンスについて、それらを組織学的に試験することによって、確認することができる。分化万能性は、胚様体を作り出し、3つの胚葉に関係するマーカーの存在について、その胚様体を評価することにより、決定されてもよい。標準的なGバンド法を用いて、核型決定してもよいし、対応する霊長類種の公知の核型と比較してもよい。「正常な核型」を有する細胞を入手することが望ましく、「正常な核型」とは、細胞が正倍数性であり、すべてのヒト染色体が存在し、著しく変化していないということを意味する。その組織は、前胚性組織(例えば、胚盤胞)、胚性組織、または、妊娠中の任意の時(一般的に、妊娠約10〜12週目の前だが、必ずしもこれに限らない)に採取された胎児組織を含む。非限定的な例は、たとえば、ヒト胚性幹細胞株H1、H7、およびH9(WiCell)といったヒト胚性幹細胞またはヒト胚性胚細胞の確立された株である。このような細胞の初期の確立または安定化の間に本開示の組成物を使用することも考慮すべきである。採取された細胞も適切である。GA)のような変異ヒト胚性幹細胞株も適切である。1995)で説明されたように準備する。様々なやり方で分化万能性幹細胞を支持する支持細胞層上で培養される。増殖を助けるような培養システム上で培養される。支持細胞を含まず分化しない培養における分化万能性幹細胞の成長は、それまでに別の細胞型で培養することにより馴化された培地を用いることで、助けられる。支持細胞を含まず分化しない培養における分化万能性幹細胞の成長は、化学的に規定された培地を用いることで助けられる。2003)は、ヒト胚性幹細胞培養を支持する能力について、11個の成人、胎児、および新生児の異なる支持細胞層を評価した。培養されたヒト胚性幹細胞株は、ヒト胚性幹細胞の形態を保有し、分化万能性のままである。成長を助ける培地を生み出すような細胞株を開示している。20020072117号はまた、初代支持細胞層としての細胞株の使用を開示している。2005)が、ヒト胚性幹細胞由来の支持細胞層上で、ヒト分化万能性幹細胞を長期間成長させるための方法を開示している。2005)が、ヒト胚性幹細胞の自発分化に由来した支持細胞システムを開示している。2004)が、ヒト胎盤から得られた支持細胞の原料を開示している。2003)は、ヒト包皮由来の支持細胞層を開示している。支持細胞層を開示している。(pPS)の成長を助ける培地、およびこのような培地を産生するために有用な細胞株を開示している。米国特許第6642048号は、「本発明には、胚性組織から得られたか、胚性幹細胞から分化した間葉系の線維芽様細胞株が含まれる。本開示では、このような細胞株を生み出し、培地を加工し、馴化培地を用いて幹細胞を成長させるための方法を説明し、例示する。別の例では、国際公開第2005014799号が、哺乳類細胞の維持、増殖、および分化のための馴化培地を開示している。Hepatocyte)と命名された、分化し不死化された形質転換肝細胞の細胞分泌活性により馴化される。2004)が、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するように遺伝子組換えしたヒト胚性幹細胞派生物から得られた馴化培地を開示している。維持するための化学的に規定された培養培地を開示している。factor)を補った、血清を含まない培地を用いる。2005)が、支持細胞も血清も含まない培養システムを開示しており、そのシステムでは、未馴化の血清置換培地(SR)であって、胚性幹細胞の自己再生を引き起こすことができる異なる成長因子が補われた血清置換培地中で、胚性幹細胞が維持される。2006)が、線維芽細胞または馴化培地の不存在下で、bFGFを補った培地を用いて、ヒト胚性幹細胞を長期間培養するための方法を開示している。原料から補われ、培地が支持細胞または馴化培地なしに、未分化状態の幹細胞の増殖を助ける、幹細胞を培養することを含む。20050233446号が、未分化の霊長類始原幹細胞を含む幹細胞を培養するのに有用な限定培地を開示している。溶液において、培地は、培養されるべき幹細胞と比較して実質的に等張である。所与の培養において、特定の培地は、基礎培地と、始原幹細胞の実質的に未分化な成長を助けるのに必要な各量のbFGF、インスリン、およびアスコルビン酸とを含む。別の例では、米国特許第6800480号が「1つの実施態様では、実質的に未分化状態の霊長類由来の始原幹細胞を育てるための細胞培養培地であって、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的である低浸透圧低内毒素の基礎培地を含む細胞培養培地が、提供される。基礎培地は、霊長類由来の始原幹細胞の成長を助けるのに効果的な栄養血清と、支持細胞および支持細胞由来の細胞外マトリックス成分から成る群から選択される基質と組み合わされる。培地は、非必須アミノ酸と、抗酸化剤と、ヌクレオシドおよびピルビン酸塩から成る群から選択される第1の成長因子とをさらに含む。培養する方法を提供する。原料から補われた線維芽成長因子の存在する培養において、幹細胞が培養される。添加により不必要になる。【0145】さらなる例では、国際公開第2005065354号が、本質的に支持細胞も血清も含まない規定の等張培養培地であって、(a)基礎培地と、(b)実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のbFGFと、(c)実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のインスリンと、(d)実質的に未分化の哺乳類幹細胞の成長を助けるのに十分な量のアスコルビン酸と、を含む培地を開示している。(FGF)ファミリーの一員、またはニコチンアミド(NIC)に、所望の結果を達成するのに十分な時間、幹細胞を曝すことを含む。適切な培養基質上に蒔かれてもよい。1つの実施態様では、適切な基質は、たとえば、基底膜に由来するか、接着分子受容体−リガンド結合の一部を形成してもよいような細胞外マトリックス成分である。Dickenson)である。MATRIGEL(商標)は、Engelbreth-Holm-Swarm腫瘍細胞由来の可溶性調製物であり、室温でゲル化して、再構成された基底膜を形成する。他の細胞外マトリックス成分、および成分混合物が、代替物として適している。増殖されるべき細胞型に応じて、これには、ラミニン、フィブロネクチン、エンタクチン、ヘパラン硫酸、および同様のものが単独で、あるいは様々な組み合わせで含まれてよい。適切な分布で、また、望ましい特徴の細胞生存、増殖、および保持を促進する培地の存在下で、基質上に蒔いてもよい。これらの特徴すべてが、播種分布に注意深く配慮することにより利益を得るし、本分野の当業者により容易に決定されることができる。適切な培養培地は、以下の成分から作られてもよい。