μl×2)のBufferも入っている。調製した液は均一になるように静かによく混合する。反応混合液は使用時に用時調製し、使用まで氷で保存する。(長時間放置した場合、混合液中の酵素が失活する恐れがあるので使用前に用時調製し、保存しない。)注意:抗体液はそのまま使用する。みスライドガラス(シランコート)・固定液(4%パラホルムアルデヒド、10%中性ホルマリン緩衝液等)・0.3%H2O2含メタノール(内因性パーオキシダーゼブロッキング)・遠心機(サイトスピン)操作手順(培養細胞の場合)細胞を採取後PBSで洗浄し、シランコートスライドグラス上で風乾させて、新しく調製した4%パラホルムアルデヒド/PBS(pH7.4)で室温15~30分固定する。室温15~30分する。ブロッキング後PBSで洗浄する。フローサイトメトリーでの検出に使用したい場合は、ここまでの操作をコニカルチューブまたはマイクロチューブ中で行う。細胞は70%エタノール中で冷凍保存すると1~2ヵ月使用可能である。フローサイトメトリーでの検出および蛍光顕微鏡での観察のみの場合は、この操作を省く。μlで氷上2~5分反応後PBSで洗浄する。[乾燥を防ぐためカバースリップを利用するとよい]させた後、PBSで洗浄して反応を停止させる。注意:チューブ中で反応をする場合は細胞が沈殿するので15分に1回程度軽く撹拌する。観察、フローサイトメトリーでの検出を行う。光学顕微鏡による観察を行う場合は以下の操作を行う。Conjugateを37°C30分反応させPBSで洗浄する。DABで室温10~15分発色させた後蒸留水で反応停止する。注意:チューブ中で反応をする場合は抗体が均一に細胞へ反応するよう時々軽く撹拌する。3%メチルグリーン染色後、マウントして光学顕微鏡により観察する。(凍結組織切片の場合)新鮮な組織を直ちにOTCコンパウンド中で凍結し、クリオスタットで薄切後シランコートスライドガラスに切片を張り付ける。(pH7.4)またはアセトンで室温15~30分固定する。PBSで20~30分洗浄する。室温15~30分する。μlで氷上2~5分反応後PBSで洗浄する。60~90分反応[乾燥を防ぐためカバースリップを利用するとよい]させた後、PBSで5分3回洗浄して反応を停止する。以上の操作で蛍光顕微鏡での観察が可能である。光学顕微鏡による観察を行う場合は以下の操作を行う。Conjugateを37°C30分反応[抗体を均一に組織上へのせる。乾燥を防ぐためにカバースリップを用いるとよい]させPBSで5分3回洗浄する。DABで室温10~15分発色させた後蒸留水で反応停止する。脱パラフィン操作に関してを参照)後蒸留水で洗浄する。μg/ml,15分)*4の後、PBSで洗浄する。9034)を使用する場合は1/2,000~1/1,000倍希釈して使用する。した(発色する時のみ必要)後、PBSで洗浄する。スライド上にのせ湿潤箱中で37°C60~90分反応[乾燥を防ぐためカバースリップを利用するとよい]させた後、PBSで5分3回洗浄して反応を停止する。以上の操作で蛍光顕微鏡での観察が可能である。光学顕微鏡による観察を行う場合は以下の操作を行う。Conjugateを37°C30分反応[抗体を均一に組織上へのせる.また、乾燥を防ぐためにカバースリップを用いるとよい]させPBSで5分3回洗浄する。DABで室温10~15分発色させた後、蒸留水で反応停止する。水洗後、蒸留水に浸す。実験に関する注意スライドガラスは剥離防止のためシランコーティングしてあるものを使用する方がよい。湿潤箱は予め37°Cでインキュベートしておく。カバースリップまたはパラフィルムを反応時に使用することにより、大きな組織切片でも毛細管現象で反応液が均一に広がるためムラができない。インキュベートによる蒸発を防ぐことができる。PBSで洗浄した後、反応液をのせる場合余分な水分をろ紙またはペーパータオルで除去しておく。PBSでの洗浄は、(細胞の場合)直接細胞にPBSをかけると剥がれてしまうので十分気をつけて濯ぐ。(組織切片の場合)5分3回を目安に行う。