疼痛測定を行った直後に、循環LPAレベルの測定のためにエチレンジアミン四酢酸(EDTA)血漿を集めた。4)および疼痛を投与後2、4、6および24時間に測定した。歴史的に、我々は、この低用量MIAモデルにおいて、9日目までに、MIAによって生じた急性炎症反応が消散し、痛みがプラトーに達したより慢性的な段階に至ることを知っていた。したがって、疼痛反応は、9日目および36日目のビヒクル動物についても同様であろう。kg)、または2つの薬物の組み合わせ(同一のもの)のいずれかを経口投与した。NSAID耐性MIAモデルNSAID耐性MIAモデルでは、0日目に1mg(高用量)のMIAをラットの右膝に、生理食塩水を左膝に注射した。56日後、それらにビヒクル(HEC)を経口投与した。NSAIDが反応しなくなるためには、高用量MIAの少なくとも35日後に動物を放す必要がありました。これを確実にするために、我々は56日目に痛みを測定した。OAの半月板モデル内側副側副靭帯および内側半月板の切断によりラットの右後肢膝関節に半月板裂傷手術を行った21。左膝関節は無傷のままであった。手術後13日目に、ラットを体重およびBRATを用いて無作為に5つの群に分けた。偽手術ラットは、13日目までに偽脚と対照脚との間に体重負荷に差がないことを観察したので、対照として含めなかった(未発表データ)。kgのNSAIDジクロフェナクを経口投与した。MIAモデルについて記載したように、疼痛を投与2時間後に測定した。ラットに疼痛測定後の夕方に再び投与し、次いでさらに3日間1日2回投与し、手術後17日目にさらに1回投与した後に疼痛測定を行った。骨痛のラット骨切り術モデル老齢の雌性ラットを卵巣摘出し、そして骨減少症になるようにした。次に、ラットの右後大腿骨に片側骨切り術を施し、骨を固定具とねじで固定した。手術後4日目に、ベースライン疼痛を無力試験により測定した。骨切り術の39日後、体重を用いてラットを無作為に2つの6つのグループに分けた。kgの化合物−1を経口投与し、疼痛を測定した。このモデルでは、疼痛は骨切り術後4日目に測定されたベースラインの疼痛測定値と比較した減少率として計算されることに注意してください。統計分析データは一元配置分散分析(ANOVA)によって評価した。Inc.、ノースカロライナ州)を用いたDunnett検定によって比較した。P値が0.05未満の場合、差異は有意であると見なされました。小分子阻害剤を同定するために、本発明者らは、基質リゾホスファチジルコリン(LPC、16:0)のLPAおよびコリンへのオートタキシン開裂に依存するコリン放出アッセイを用いて化合物ライブラリーをスクリーニングした。生成したコリンの量は、方法の節に記載されているように測定した。このアッセイを用いて、我々は、化合物-1と命名されたオートタキシンの強力な阻害剤で識別される22、23。化合物−1のオートタキシン阻害活性を図1(a)に示す。それは組換えヒトおよびラットオートタキシンのIC50による強力な阻害を示す。それは関連酵素ENPP1およびENPP7(エクトヌクレオチドピロホスファターゼ/ホスホジエステラーゼファミリーメンバー1および7)に対して選択性を示し、100μMでこれら2つの酵素を本質的に阻害しなかった(データは示さず)。図1高解像度画像をダウンロードする(142KB)フルサイズの画像をダウンロード図1。我々はオートタキシン阻害剤は、血漿中の内因性オートタキシンの活性を阻害し得るかどうかを試験しました。Biologicalsから購入した。血漿を様々な濃度の阻害剤と共に37°Cで3時間インキュベートした。3時間のインキュベーション中に、血漿中に存在するレシチンコレステロールアシルトランスフェラーゼはホスファチジルコリンを切断する。LPCを生成する(オートタキシン基質LPCのより高い血漿レベルをもたらす)。内因性LPCの増加は血漿中に存在するオートタキシンによって切断され、その結果LPAが増加する。オートタキシン阻害剤(化合物−1)の添加は、血漿中のLPA産生の用量依存的阻害をもたらした。化合物−1の阻害活性の代表例を図1(b)に示す。50:2.2および3.2nM)。血漿中の化合物のナノモル活性(アッセイ緩​​衝液中のその活性と同様)は、オートタキシンを阻害する化合物の能力が血漿タンパク質によって有意に影響されないことを示唆する。ラット血漿中の化合物の阻害活性は、ラットにおける化合物のインビボ試験を進めるための自信を与えた。MIAモデルにおける化合物1による疼痛反応の用量依存的阻害ラットの膝関節へのMIAの注射は痛みを引き起こします。注射された膝には急性の炎症反応があり、それが関節組織の慢性変性に発展し、そしてこれはヒトOAの痛みをモデル化するために使用される。関節損傷に起因する疼痛は、無力容量テスターを用いて後肢の体重差荷重を介して測定することができる。効力は、体重分布を部分的に正規化する化合物の能力によって日常的に測定される。MIAモデルにおける化合物−1の経口投与は、ビヒクル群と比較して疼痛反応の用量依存的な阻害をもたらした[図2(a)]。kg用量で観察され、試験した最高用量で化合物投与後2時間で疼痛応答の42%の阻害があった。血漿LPAの阻害は関節で観察された疼痛阻害を反映しているが、局所組織LPAの阻害は観察された局所鎮痛効果に役割を果たすと思われる14。図2高解像度画像をダウンロードする(190KB)フルサイズの画像をダウンロード図2。MIA)における化合物−1の用量依存的効果(a)。血漿中で測定されたLPAレベルに対する化合物-1の用量依存的効果(b)。/群)として報告されている。各処置群をビヒクルと比較する仮説の検定をダネット検定を用いて行い、そしてP値をグラフの下部に示す。)である投与2時間後に行われた。化合物の単回投与後に疼痛効力が持続する期間を評価するために、我々は投与後の複数の時点で疼痛反応を評価した。ml)そして疼痛有効性データに従うように見えた。LPAレベルは投与後2および6時間でも抑制されたが、24時間ではビヒクル対照レベルに戻った(図3)。その時までに、化合物は実質的に透明になった。図3高解像度画像をダウンロード(162KB)フルサイズの画像をダウンロード図3。/群)として報告されている。P値をグラフの下部に示す。MIAモデルにおいて化合物1とNSAIDジクロフェナクを組み合わせて投与した場合の疼痛に対する有効性の増加ジクロフェナクなどの一般的なNSAIDは、典型的には関節痛を治療するために使用される。オートタキシン阻害剤(LPA阻害)およびNSAIDジクロフェナク(プロスタグランジン阻害)の明らかに異なる作用機序のために、本発明者らは、2つの分子の組み合わせが単独で試験した分子と比較してさらなる鎮痛効果をもたらすかどうか試験した。kgのジクロフェナクを使用した。化合物−1およびジクロフェナクの両方(単独でまたは組み合わせて)は、ビヒクルと比較して有意に痛みを軽減した。両方の薬物との併用治療は、単独で投与されたいずれの分子と比較しても有意なさらなる利益を提供した(図4)。図4高解像度画像をダウンロードする(132KB)フルサイズの画像をダウンロード図4。投与後2時間で疼痛を測定した。/群)として報告されている。各処置群をビヒクルと比較する仮説の検定をダネット検定を用いて行い、そしてP値をグラフの下部に示す。NSAID無反応MIAモデルにおける化合物1の有効性OAが進行すると、一部の患者は少ない応答またはNSAIDに用いた治療に対する非応答いくつかのケースでなることが報告されている28、29。これの根底にあるメカニズムは不明であるが、疾患が進行するにつれて疼痛経路(例えば炎症性から神経障害性へ)の変化の結果である可能性がある。これは、通常(0.3mg)よりも高用量のMIA(1.0mg)を注射し、化合物投与前にMIA注射後35日を超えて症状を発症させることによって、MIAモデルにおいて前臨床的にモデル化されている。これらの条件下では、通常有意な疼痛効力を生じるであろうNSAIDの用量は無効になる。MIAモデルに関する同様の知見が報告されている30。NSAID非応答型のMIAモデルにおける化合物−1での処置は、ビヒクルと比較して疼痛を有意に減少させ(図5)、そして予想通り、NSAIDは効果がなかった。化合物-1とジクロフェナクの併用投与量もビヒクルと比較して疼痛を有意に減少させた(図5)が、化合物-1単独と比較して有意差はなく、この有効性は化合物-1によるものであることを示唆した。ジクロフェナクと相乗作用しないでください。図5高解像度画像をダウンロードする(123KB)フルサイズの画像をダウンロード図5。投与後2時間で疼痛を測定した。/群)として報告されている。各処置群をビヒクルと比較する仮説の検定をダネット検定を用いて行い、そしてP値をグラフの下部に示す。化学的に誘発された関節損傷のMIAモデルにおいて化合物-1の鎮痛活性を実証したので、我々は、その化合物が外科的に誘発されたOAのモデルにおいて有効であるかどうかを試験した。ラット半月板裂傷モデルは、関節のOA様変化を誘発するための膝関節の外科的不安定化を含み、そして構造改変剤の有効性を試験するために一般的に使用されるモデルである。おける変化の評価によって測定することができ、このモデルに関連する疼痛成分がある25、31。化合物−1を10に投与した。kgを1日2回(13日目から開始)。MT手術後17日目ではビヒクルと比較して疼痛反応が有意に減少したが、13日目ではなかった。対照的に、NSAIDジクロフェナクはMT手術後13日目および17日目の両方で有効であった(図6)。図6高解像度画像をダウンロードする(170KB)フルサイズの画像をダウンロード図6。OAの半月板裂傷モデルにおける化合物1による用量反応。投薬の1日目および5日目に、投与2時間後に疼痛を測定した。各処置群をビヒクルと比較する仮説の検定を反復測定ANOVAを用いて行い、そしてP値をグラフの下部に示す。骨痛のラット骨切り術モデルにおける化合物1の有効性2つのモデルのOA疼痛にオートタキシン阻害の効果が見られることから、オートタキシンの組織分布はかなり広いため、オートタキシンの阻害が筋骨格疼痛の他のモデル(骨折痛など)に何らかの役割を果たすかどうかを調べることにした32。我々は、骨折痛のラット骨切り術モデルを使用した。この方法では、方法に記載されているように、骨減少症である高齢卵巣摘出雌性ラットを片側大腿骨骨切り術にかけた。動物をビヒクルまたは化合物-1で急性処置した。OA疼痛モデルにおいて見られるように、化合物-1による処置は、後肢体重負荷の差によって測定されるように、ビヒクルと比較して疼痛を有意に減少させた(図7)。図7高解像度画像をダウンロードする(96KB)フルサイズの画像をダウンロード図7。投与後2時間で疼痛を測定した。/群)として報告されている。22の非常に強力かつ経口的に生物学的に利用可能な阻害剤を同定するために、ハイスループットスクリーニングアッセイおよび血漿アッセイを使用した。これらの阻害剤のうちの1つ(化合物-1)を使用して、オートタキシン阻害が、OAおよび骨折痛を含む筋骨格痛の動物モデルにおいて鎮痛効果をもたらすことができることを本研究において実証した。鎮痛効力を実証するために使用されている疼痛の一般的に使用されるモデルである26、27。本発明者らは、オートタキシン阻害が、疼痛反応の代用尺度としての役割を果たす後肢体重負荷差の用量依存的阻害をもたらすことを実証した。試験した最高用量で疼痛反応の42%の阻害があった。%-50%の減少をもたらします。