・組織中のペルオキシダーゼを不活性化する(0.3%過酸化水素含有メタノールによる処理)。・一次抗体反応の前に標識二次抗体の動物種と同じ動物血清(10%ヤギまたはウサギ正常血清など)でブロッキングする。・BSAやカゼインなどのブロッキング試薬を使用する。・組織と同じ動物種の免疫グロブリンまたは血清で吸収済みの二次抗体を選択する。MK200)を試してみる。検出系によっては、データシートに記載されている濃度では高すぎる場合がある。・0.1%BSAやカゼインなどブロッキング剤を含んだPBSで一次抗体を希釈して至適条件を検討する。・顕微鏡で観察しながら、反応時間を定める。・常温(15~25°C)で行う。