)の培養上清にはproNT/NMNが検出されないことを見い出した。したがって、ヒトから採取した生体試料中のproNT/NMNの発現量を、proNT/NMNに対する抗体や、proNT/NMNの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブを用いて測定することにより、小細胞肺癌の診断が可能となる。癌治療における診断・判定として血中腫瘍マーカーの計測が挙げられる。腫瘍マーカーは腫瘍または腫瘍と反応した正常細胞が作る物質の中で、血中や尿中などに放出され腫瘍の体外診断を可能としているものである。規な組成物、方法および使用(例えば、特許文献1参照)や、肝炎ウイルスの感染に起因し慢性肝炎または肝硬変を発症した患者に対し、肝炎ウイルスに感染した患者のミトコンドリアDNAの塩基配列を評価することによって肝臓癌の発癌リスクを評価する方法(例えば、特許文献2参照)や、その遺伝子産物がCLL細胞および前立腺癌細胞の新生物性または腫瘍形成性増殖を抑制するmiR15およびmiR16のコピー数、変異状態または遺伝子発現を検出することによる慢性リンパ性白血病または前立腺癌の診断方法(例えば、特許文献3参照)や、無症候性期または初期段階の患者における発癌過程の存在を検出するのに適当な迅速な癌の診断方法や、癌患者の血清中に存在する炭酸脱水酵素IIの活性化化合物、すなわち腫瘍マーカー、該癌の診断方法によって、無症候性期または初期段階の患者の癌を検出することを特徴とする癌の処置方法;ならびに該癌の診断方法を行うためのキット(例えば、特許文献4参照)等が知られている。3タイプに分類され、それぞれのタイプによって発生する部位がある程度決まっており、小細胞癌と扁平上皮癌は肺門部に、腺癌と大細胞癌は肺野部にできやすい肺癌といわれている。用いて高感度で測定することにより、肺癌の早期診断、さらには治療効果の判定、経過観察を行う方法(例えば、特許文献6参照)等が知られている。難治性の癌のマーカーの開発が求められている。向上が期待されていた。本発明の課題は、早期診断が可能な小細胞肺癌に対する特異的な新規腫瘍マーカーを提供することにある。)の培養上清にはproNT/NMNが検出されないことを見い出し、本発明を完成するに至った。【0008】すなわち本発明は、(1)配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキットや、(2)配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのmRNAの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキットに関する。【0009】また本発明は、(3)配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキットや、(4)配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのmRNAの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキットに関する。【0010】さらに本発明は、(5)配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキットや、(6)配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのmRNAの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキットに関する。リスク評価、抗癌剤の小細胞肺癌に対する有効性の判定、小細胞肺癌の抑制剤・治療剤のスクリーニングを行うことができる。【図1】SBC3培養細胞株の培養上清のMSスペクトル測定結果を示す図である。【図2】SBC3培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製した際の溶出曲線を示す図である。【図3】SBC3培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いた分離・精製において、18−19分前後に溶出した画分のMSスペクトル測定結果を示す図である。【図4】トリプシン消化したタンパク質断片のMSスペクトル測定結果を示す図である。【図5】トリプシン消化したタンパク質断片のうち、MSスペクトルがm/zが1047のフラグメントに対するMS/MSスペクトル測定結果を示す図である。【図6】本発明のproNT/NMNのアミノ酸配列を示す図である。【図7】proNT/NMNのアミノ酸配列において、SBC3培養上清をトリプシン処理したペプチド断片についてNANOLC−ESI−LIT−TOF質量分析計で検出された配列(グレーの色付部分)を示す図である。【図8】proNT/NMNのアミノ酸配列において、トリプシン・V8プロテアーゼ混合液で処理を行ったペプチド断片についてNANOLC−ESI−LIT−TOF質量分析計で検出された配列(グレーの色付部分)を示す図である。TOF/TOF質量分析計及びNANOLC−ESI−LIT−TOF質量分析計で検出された配列(下線部分)を示す図である。【図10】proNT/NMNの分子内構造を示す図である。NMNに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った結果を示す図である。Lane1はSBC−3を無血清培養した培養上清、Lane2はSBC−3を血清培養した培養上清、Lane3はSBC−3の細胞破砕液を泳動した。NMN抗体を用いてウエスタンブロットしたものである。供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。proNT/NMNの発現を検出した場合、対象者は小細胞肺癌患者と判定されることになる。供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。proNT/NMNの発現を検出した場合、対象者は小細胞肺癌が再発していると判定されることになる。生体試料中の、proNT/NMNの発現量を測定する方法であれば特に制限されるものではなく、また本発明の小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性判定用キットとしては、proNT/NMNに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたキットや、proNT/NMNのmRNAの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたキットであれば特に制限されるものではなく、抗癌剤の有効性を判定することにより、各患者個人に適した治療、いわゆるテーラーメイド治療が可能となる。供試して、所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法を挙げることができる。抗癌剤の服用の結果、proNT/NMNの発現量が減少した場合、当該抗癌剤は小細胞肺癌の治療に有効であると判定されることになる。動植物の抽出物、ペプチドなどの被検物質の存在下に培養し、細胞溶解物中のproNT/NMNの発現量を測定し、被検物質の非存在下における場合と比較・評価する方法であれば特に制限されず、上記ペプチドの発現量を測定する方法としては、ヒト肺癌培養細胞株(SBC3、SBC5)の細胞溶解物を二次元電気泳動に供試して所定箇所に現れるスポットの大きさを測定する方法の他、proNT/NMNに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を用いるELISA法等の免疫反応を利用する方法や、proNT/NMNのmRNAの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を用いるドットブロット法、ノーザンブロット法、RNアーゼプロテクションアッセイ法、RT−PCR法等の発現している遺伝子を転写レベルで検出する方法を挙げることができる。小細胞肺癌の治療に有効な小細胞肺癌の抑制剤・治療剤である可能性が大きい。ヒト化抗体、キメラ抗体、2つのエピトープを同時に認識することができる二機能性抗体等を例示することができる。Inc.,1985)など任意の方法を用いることができる。1985)を用いることができる。二機能性抗体は、2つの関連した抗体を産生する2つのモノクローナル細胞系同士のハイブリッド、または2つの抗体の断片の化学結合によって産生することができる。【0019】また、上記抗体のFab断片やF(ab’)2断片等も、上記抗体と同様に用いることができる。Fab断片は抗体をパパイン等で処理することにより、またF(ab’)2断片はペプシン等で処理することにより調製することができる。【0020】これら抗体に、例えば、FITC(フルオレセインイソシアネート)又はテトラメチルローダミンイソシアネート等の蛍光物質や、125I、32P、14C、35S又は3H等のラジオアイソトープや、アルカリホスファターゼ、ペルオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ又はフィコエリトリン等の酵素で標識したものや、グリーン蛍光タンパク質(GFP)等の蛍光発光タンパク質などを融合させた融合タンパク質を用いることによって、上記配列番号1に示されるアミノ酸からなるペプチドを免疫学的測定方法により測定することができる。オクタロニー法等の方法を挙げることができる。上記proNT/NMNのmRNAの存在を検出するためのプライマーセットとしては、これらペプチドのmRNA又はcDNA(配列番号3)のうち、上流及び下流の配列の一部とハイブリダイズしうる相補的なプライマーセットであれば、プライマー配列の長さ及びmRNA又はcDNAのどの部位と相補的であるかなどは特に制限されず、例えば、これらのプライマーは、5’側又は3’側、又はその両方に、上記ペプチドのmRNA又はcDNA配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プライマーとして用いることができる。非特異的な増幅を防ぐためや、適当な制限酵素認識部位を導入するために、これらのmRNA又はcDNAと相補的でないミスマッチ配列を持つプライマーを使用することができる。上記proNT/NMNのmRNAの存在を検出するためのプローブとしては、これらペプチドをコードするDNA(cDNA)又はRNA(cRNA)とハイブリダイズしうるアンチセンス鎖の全部又は一部であり、プローブとして成立する程度の長さ(少なくとも20ベース以上)を有するものが好ましく、例えば、これらのプローブは、5’側又は3’側、又はその両方に、上記ペプチドのmRNA又はcDNA配列と一部に相補的ではない配列を含んでも、これらとハイブリダイズできる限り、プローブとして用いることができ、また、検出しやすいように、任意の配列を付加したものを用いることができる他、検出しやすいように5’末端を標識したものを用いることもでき、そのような標識としては、たとえば、ビオチン、蛍光、又は32Pなどを例示することができる。以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。【0024】(培養細胞株)実施例では9種類の培養細胞株を用いた。いずれの培養細胞株もヒト肺癌由来のものであり、小細胞癌としてSBC−3、SBC−5、腺癌としてNCI−H650、NCI−H1650、大細胞癌としてNCI−H661、NCI−H1581、NCI−H460、扁平上皮癌としてNCI−H2170、NCI−H1869を用いた。SBC−3の培養上清を分析し、他の培養上清と比較することで腫瘍マーカーの候補を検索した。(ATCC社)又は財団法人ヒューマン振興財団から入手することができる。【0025】(培養上清の調整)培養上清は以下のように回収した。各々の細胞を1×106となるよう10cmシャーレに播種し、一晩インキュベートして細胞をシャーレに接着させた。serum:FBS)を含むRPMI1640(Sigma社製)を用いた。saline:PBS)で2回洗浄した後、FBSを含まないRPMI1640培地に交換した。系内にFBSが存在すると測定誤差が大きくなるため、実施例では無血清培地を使用した。RPMI1640培地で1時間インキュベートした後、培地を捨て、PBSでさらに2回洗浄し、RPMI1640培地を7ml加えた。48時間インキュベートした後この培地を回収し、実験に用いた。【0026】(培養上清のMSスペクトル測定)SBC3培養細胞株の培養上清のMSスペクトルを測定した。培養上清1mlに対し、ZipTip(Millipore社製)を用いて脱塩・濃縮を行い、MSスペクトルを測定した。TOF/TOF質量分析計を用いて測定した。対照として細胞と接触していない培地を上述と同様の処理を行い、MSスペクトルを測定した。図のように培養上清では分子量1000−10000付近に培地には存在しない分子が多く観測された。これらの分子はSBC3細胞が生成し、放出したものであると考えられる。分子量から類推すると直接MS/MSスペクトルを測定し、タンパク質の配列を決定するためには分子量が大きすぎることが分かった。【0027】(培養上清中のタンパク質のカラムクロマトグラフィーによる分離とMSスペクトル測定)SBC3培養上清中のタンパク質を、カラムクロマトグラフィーを用いて分離・精製した。RP−18GP250−4.6(5μm:関東化学社製)を用いた。溶出曲線を図2に示す。図のように保持時間が18−19分前後に培地には無いピークが検出された。これらの全画分を回収し、MSスペクトルを測定した。一例として18−19分前後に溶出した画分のMSスペクトルを図3に示す。図のように分子量17300前後の分子が観測された。【0028】(タンパク質のトリプシン消化とMS/MSスペクトル測定)カラムクロマトグラフィーで得られた18−19分前後の画分中のタンパク質をトリプシン消化し、MS/MS測定を行うことによって、タンパク質の配列を決定した。トリプシン消化は以下のように行った。RapiGest(Waters社製)を15μl加えタンパク質を溶解した。炭酸水素アンモニウム)を15μl加え37°Cで1時間インキュベートした。塩酸3μlを加えて反応を停止した後、ZipTipを用いて脱塩を行い、MSスペクトルを測定した。MSスペクトルの結果を図4に示す。分子量17300前後のピークは観測されなかったことから、トリプシン消化が行われ、タンパク質が断片化していることが分かる。【0029】さらに上記タンパク質断片のペプチドに対し、MS/MSスペクトルの測定を行った。一例としてm/zが1047のフラグメントに対するMS/MSスペクトルを図5に示す。図のように1047の親ピークが無くなりアミノ酸単位に開裂したスペクトルが得られた。このスペクトルをデータベースと照らし合わせることによって、ペプチド配列を決定した。その結果、このペプチドの配列はQLYENKPRであることが分かった。同定されたy系列およびb系列の分子量を図5に示す。【0030】さらに、図4で検出されたm/zが789.5、902.6、945.6、2513.1に対して同様にペプチド配列を決定した。【0032】これらのペプチドはアミノ酸13個からなる直鎖ペプチドであるニューロテンシンの前駆体(proNT/NMN)の一部であることが分かった。図6にproNT/NMNの配列を示す。太字で示したものが検出されたペプチドである。トリプシン消化前のタンパク質の分子量は図3より17300前後と推定されていた。proNT/NMNの分子量は17225であり、高分子のマススペクトルの誤差を許容するとほぼ一致していることが分かる。以上のことよりSBC3培養上清にはproNT/NMNが放出されていることが明らかとなった。ニューロテンシン(NT)は「LYENKPRRPYIL」(配列番号2)の構造を持つ。これまでの研究によりNTはペプチドホルモンとして機能することが分かっている。ヒト肺癌由来の腫瘍細胞がNTの前駆体であるproNT/NMNを放出しているという報告が無く、本研究によってはじめて明らかとなった。一般的にペプチドホルモンは血中で不安定である場合が多く、腫瘍マーカーとしては不適切である場合が多かったが、proNT/NMNはペプチドホルモンの前駆体であるため血中安定性が高く腫瘍マーカー候補として適切である可能性が高い。【0033】(種々の肺癌由来培養細胞の比較)他の小細胞癌としてSBC5の培養上清を上述の方法を用いて分析したところ、SBC3と同様にproNT/NMNの放出が確認できた。3種類の大細胞癌、2種類の腺癌、2種類の扁平上皮癌ではproNT/NMNの放出は検出できなかった。以上のことよりproNT/NMNは小細胞肺癌特異的なマーカーとして期待できると言える。正常者の肺由来の細胞からproNT/NMNの放出は報告されていない。【0034】(培養上清中のタンパク質のカラムクロマトグラフィーによる分離とnanoLC−ESI−LIT−TOF質量分析)また、SBC3培養上清を用いてカラムクロマトグラフィーを行い、得られたタンパク質画分をトリプシンのみ、あるいはトリプシンとV8プロテアーゼの2種類の酵素で消化した。NanoFrontier((株)日立ハイテクノロジーズ社製)での測定を行った。トリプシン消化は以下のように行った。【0035】カラムクロマトグラフィーで得られた18−19分前後の画分を減圧下で遠心濃縮し、トリプシン溶液30μl(トリプシンが0.5μg含まれた50mM炭酸水素アンモニウム溶液)を加え、37°Cで18時間インキュベートし、その反応液5μlを分析した。トリプシンとV8プロテアーゼの2種類の酵素での処理には、トリプシン溶液30μlのかえて、トリプシン・V8プロテアーゼ混合液30μl(トリプシンが1μg、V8プロテアーゼが1μg含まれた50mM炭酸水素アンモニウム溶液)を用いた。【0036】トリプシンのみで処理を行ったペプチド断片の分析結果を表2及び図7に示す。その結果、proNT/NMNの一部であるペプチド断片が検出された。同様にトリプシン・V8プロテアーゼ混合液で処理を行ったペプチド断片の分析結果を表3及び図8に示す。図9のスキーム中に下線で示したものが二種類の質量分析計を用いて検出されたペプチドである(配列番号1)。proNT/NMNのN末端およびC末端を含むほとんどの配列を検出することができた。NMN)の配列を有する(図10)。NMNに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った(図11)。【0040】その結果、SBC−3を血清培養した培養上清及びSBC−3の細胞破砕液について、proNT/NMN(分子量17225)前後に陽性バンドが検出された(赤矢印)。NMNの分子量はこれと大きく異なることから、検出できたバンドはproNT/NMNであると言える。細胞内でも検出できたことから細胞がproNT/NMNを生産し上清に放出したと言える。抗体を使ってproNT/NMNが検出できたため、今後ELISAなど汎用の臨床検査を用いてもproNT/NMNが検出できる可能性を示している。配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキット。配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのmRNAの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌を判定するためのキット。配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキット。配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのmRNAの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌再発のリスクを評価するためのキット。配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドに特異的に結合する抗体、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキット。配列番号1に示されたアミノ酸配列からなるペプチドのmRNAの存在を検出するためのプライマーセット若しくはプローブ、又はそれらの標識物を備えたことを特徴とする小細胞肺癌に対する抗癌剤の有効性を判定するためのキット。ekouhou.net。