Outline:本研究では培養細胞を用いてタウリンの抗酸化効果に関して検証した。COS1細胞に対してタウリン含有培養液で培養した後にUV照射に由来する酸化ストレスに対本研究では培養細胞を用いてタウリンの抗酸化効果に関して検証した。COS1細胞に対してタウリン含有培養液で培養した後にUV照射に由来する酸化ストレスに対する応答について解析した。その結果、UV照射による活性酸素の発生量の低下がタウリン添加によって確認...本研究では培養細胞を用いてタウリンの抗酸化効果に関して検証した。COS1細胞に対してタウリン含有培養液で培養した後にUV照射に由来する酸化ストレスに対する応答について解析した。その結果、UV照射による活性酸素の発生量の低下がタウリン添加によって確認された。ミトコンドリアの膜電位の状態の解析を行った結果、UV照射を行っても、タウリン処理によってミトコンドリアへのダメージが軽減されることが示唆された。これらの結果から、タウリンは細胞に対する酸化ストレス傷害を減弱させる作用をもつ可能性が示唆された。Outline:インスリンシグナル系による老化制御機構に重要な役割をもつ転写因子複合体の機能解明、およびその活性化分子を明らかにするため、以下の研究を行った。1.Inインスリンシグナル系による老化制御機構に重要な役割をもつ転写因子複合体の機能解明、およびその活性化分子を明らかにするため、以下の研究を行った。vitroスクリーニング系の確立抗老化に関与する転写因子が結合し、転写を活性化させると示唆される...インスリンシグナル系による老化制御機構に重要な役割をもつ転写因子複合体の機能解明、およびその活性化分子を明らかにするため、以下の研究を行った。vitroスクリーニング系の確立抗老化に関与する転写因子が結合し、転写を活性化させると示唆されるDNA配列である、DFCR-RE(モチーフ2)を直列に5個結合させ、分泌型アルカリフォスファターゼ(SEAP)の上流に組み込み、さらに選択用のpuromycin耐性遺伝子を導入したコンストラクトを作製した。あわせてネガティブコントロール用として、別のDFCR-RE配列(モチーフ5)についても、同様に3系統の細胞株を樹立した。SEAPの発現量をもとに、それぞれ1系統の細胞株を選択し、以下の実験を行った。2.確立した細胞株をもちいたスクリーニング東京大学創薬オープンイノベーションセンターより化合物ライブラリーの提供を受け(36種類)、上記の細胞系をもちいたスクリーニングを行った。72時間後に培養上清を採取し、アッセイキットをもちいてSEAP活性を測定した。この結果をもとに化合物を選択し、さらに以下の解析を行った。3.スクリーニング系の最適化上記の実験で決定したポジティブコントロールとして期待される化合物をもちいて、培養液中に濃度、処理時間を変化させて添加し、培地中に分泌されたSEAPの活性を測定した。その結果、化合物番号5番について期待されるSEAP活性の変化は見られたものの、統計的な有意差は見られなかった。4.HNF-4/PGC-1の結合促進および転写活性化の解析上記の化合物番号5番をもちいた実験について、PGC-1の発現およびHNF-4/PGC-1複合体の形成変化について、それぞれウエスタンブロット、免疫沈降法をもちいて解析した。その結果、PGC-1の発現は化合物の添加に対して濃度依存的な上昇が見られたものの、複合体形成の明らかな増加は見られなかった。以上の結果から、化合物添加前のレポーター発現がより低いコンストラクトが必要であることが示唆された。現在、あらたなレポータープラスミドの作製を行っている。Outline:実験動物に対して与える餌の量を制限すること(カロリー制限)、およびインスリンシグナル系の減弱により、寿命の延長や老化関連疾患の発症が抑制されることが知実験動物に対して与える餌の量を制限すること(カロリー制限)、およびインスリンシグナル系の減弱により、寿命の延長や老化関連疾患の発症が抑制されることが知られている。prot...実験動物に対して与える餌の量を制限すること(カロリー制限)、およびインスリンシグナル系の減弱により、寿命の延長や老化関連疾患の発症が抑制されることが知られている。(WDR6)が、インスリンシグナル系の分子として摂食行動やエネルギー代謝などに関連している可能性を明らかにした。本研究では、全身性および脳特異的WDR6ノックアウトマウスの作製を行った。得られたマウスの摂食行動など、表現型解析に関する基礎的な研究を行った。これまでに、Cre-loxPシステムをもちいたWDR6ノックインマウスを作製しており、当該キメラマウスをCreを全身性に発現するCAG-Creマウスと交配させ、ヘテロノックアウトマウスを作製した。その後、ヘテロ同士の交配によりホモノックアウトマウスを作製した。得られたマウスの遺伝子型の分離比は概ね野生型:ヘテロ:ホモ、1:2:1であり、メンデル遺伝の法則に従っていた。ホモ同士の交配によっても仔マウスが得られたことから、WDR6ノックアウトマウスは胎生致死でなく、また生殖細胞系にも異常が見られないことが示唆された。脳特異的WDR6ノックアウトマウスは、タモキシフェンによって神経細胞においてのみCreの発現が誘導されるNestin-CreERTマウスとの交配により行った。現在、ハウスの繁殖と交配を継続して行っている。全身性WDR6ノックアウトマウスの野生型、ヘテロ、ホモの遺伝子判定は、尾部から抽出したゲノムDNAをもちいて行った。得られたマウスの肝臓より、RNAを抽出し、WDR6の遺伝子発現をRT-PCR法により解析した。その結果、RNAレベルにおいても目的とした標的遺伝子組換えが起こっていることが示唆された。B1(LKB1)などの代謝関連タンパク質とWDR6の相互作用を、免疫沈降法をもちいて解析し、WDR6ノックアウトによるタンパク質-タンパク質間の結合への影響を解析する。現在までのところ、若齢においては遺伝子型による摂食行動に対する明確な違いは認められていない。今後も、これらのマウスの飼育を老齢まで継続するとともに、糖・脂質代謝の変化、さらに酸化ストレスなどに対する耐性等を解析する予定である。これらの研究を通じて、WDR6ノックアウトマウスを新たな老化疾患研究モデル動物として確立することを目指す。CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。その抗老化作用に関連するシグナル伝達系はまだ不明な点が多いが、サーチュインと呼ばれる長寿遺伝子の関与が示唆されている。そこで本研究では、サーチュインを活性化させる植物由来成分であるレスベラトロールをマウスの餌に混ぜ、ドキソルビシンによって誘導される酸化ストレスによるDNA損傷に対する保護作用を解析した。発現上昇は、ドキソルビシン投与によって抑制され、レスベラトロールを投与されたマウスにおいても同様にそれらの遺伝子の発現上昇は見られなかった。レスベラトロールを投与したマウスはサーチュイン遺伝子の発現が上昇し、このことが通常食を投与したマウスと比較して酸化ストレス耐性が亢進したことと関連があると示唆された。カロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。カロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。その抗老化作用に関連するシグナル伝達系はまだ不明な点が多いが、酸化ストレスの抑制が重要であることが示唆されている。カロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。その抗老化作用に関連するシグナル伝達系はまだ不明な点が多いが、酸化ストレスの抑制が重要であることが示唆されている。そこで本研究では、培養細胞に紫外線(UV)を照射して酸化ストレスを誘導し、食品由来成分であるタウリン(Tau)がその酸化ストレスの蓄積を軽減するかを解析した。UV処理細胞では酸化ストレスが抑制されていることが示唆された。タンパク質レベルでは、チェックポイントタンパクであるp-Chk1がUV未処理の細胞に比べ、UV処理細胞において発現が亢進した。タウリン処理はこのChk1のリン酸化を低下させたことからも、タウリンによる酸化ストレス抑制作用が示唆された。これらの結果から、タウリンがCRの抗老化作用を一部模倣することが可能であると示唆された。誘導し健康寿命を延伸することが様々な生物で報告されている。誘導し健康寿命を延伸することが様々な生物で報告されている。そのためCRと同様の効果を持つCR模倣物の研究が広く行われている。誘導し健康寿命を延伸することが様々な生物で報告されている。そのためCRと同様の効果を持つCR模倣物の研究が広く行われている。本研究ではタウリンがCR模倣物として機能し、寿命の延伸にも関わるのではないかと考え解析を行った。培養細胞を用いた解析から、UV照射によるDNA損傷応答が、タウリンの添加によって減弱することが示唆された。この結果は、タウリン処理によって酸化ストレスの誘導が軽減されたことを示唆している。したがって、タウリンが新たなCR模倣物の候補となる可能性があり、今後の更なる検討が必要であると思われる。摂取カロリーを70%に抑えるカロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。摂取カロリーを70%に抑えるカロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。ヒトに対するCRを長期間実施することは難しく、CRと同様の効果を有するCR模倣物の研究が注目されている。摂取カロリーを70%に抑えるカロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。ヒトに対するCRを長期間実施することは難しく、CRと同様の効果を有するCR模倣物の研究が注目されている。本研究ではタウリンがCR模倣物として機能すると考え解析を行った。酸化ストレスを負荷したマウスにタウリン混餌食を与えた結果、抗酸化に関わる遺伝子の発現が上昇した。タンパク質発現の解析を行ったところ、酸化ストレスマーカーの発現がタウリン食によって低下していた。DNA損傷マーカーやアポトーシスマーカーの発現にも影響を与えていた。これの結果から、タウリンの摂取が抗酸化、さらには抗老化に有利に働く可能性が強く示唆された。本研究では、タウリンのカロリー制限模倣効果について解析を行った。本研究では、タウリンのカロリー制限模倣効果について解析を行った。バイオマーカを解析した。本研究では、タウリンのカロリー制限模倣効果について解析を行った。バイオマーカを解析した。実験2ではマウスにタウリン添加食を与え、3-ニトロプロピオン酸投与による酸化ストレス耐性を解析した。実験1において、血清および肝臓コレステロール濃度はタウリンの添加量に依存して低下した。タウリンの添加量依存的に低下した。実験2では、タウリン添加によって酸化ストレス誘導後の生存率を上昇させることが示された。これらの結果から、タウリンはカロリー制限模倣物となる可能性を持つと考えられた。カロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。カロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。カロリー制限(CR)は、実験動物の老化を遅らせ、寿命を延長させる最も確実な介入方法である。(NPY)の発現亢進が重要であり、NPYの活性化がCRを行った際の体内シグナル伝達を模倣、または増幅可能なことが示唆されている。そこで本研究では、NPY発現亢進作用が知られている六君子湯に着目し、マウスに六君子湯を混ぜた餌を投与し、酸化ストレスに対する耐性および生体応答を解析した。その結果、六君子湯がNPYの発現亢進を介し、肝臓ではCRの(1)抗酸化能を上昇させる効果、(2)酸化ストレスに応答し細胞周期を停止させる効果、(3)アポトーシスを誘導する効果、(4)ミトコンドリア機能を改善する効果を模倣または増幅可能なことが示唆された。