nm)を照射して撮影された感知領域の画像。「Green」の値はRGB表色系における「G」の数値を表す。mg/mLを使用した)。μPADを用いて作成したトランスフェリンの検量線。「Green」の値はRGB表色系における「G」の数値を表す。0011本発明は、トランスフェリンファミリータンパク質検出の装置および方法に関する。具体的には、本発明は認識物質およびその他の検査物質が紙基材に配置あるいは固定化された、トランスフェリンファミリータンパク質検出の装置に関する。認識物質およびその他の検査物質は、インクジェット印刷で紙基材に配置されることが、発明の実施として好ましい。本発明に関わる認識物質は、ランタノイドイオン(本文では一般にLnイオンと略記する)である。好ましくは、ランタノイドイオンはLa(III)、Eu(III)、Tb(III)、Yb(III)を含む群から選ばれ、最も好ましいランタノイドイオンはTb(III)である。ここではLn(III)およびLn3+の表記は同一のものを示すと理解されるべきである。これらのイオンは個々に使用することが可能であり、二つ以上のイオンを組み合わせて使用することも可能である。ランタノイドイオンの紙基材への配置の際は、3価の塩が適当であり、好ましくはハロゲン塩LnX3であり、Xはフッ素、塩素、臭素、ヨウ素のいずれかのハロゲンを示す。インクジェット印刷によるランタノイドイオンの配置の際は、それに相当するハロゲン塩LnX3は、好ましくは添加物、例えばアセチレングリコールないしpHバッファー成分を含む、ないし添加物を含まない水溶液として使用される。mmol/Lであり、好ましくは濃度10-20%(v/v)のエチレングリコールを添加物として含む。mmol/LのTbCl3のpH緩衝液である。しては、NaHCO3が最も好ましい。ランタノイドイオンとトランスフェリンファミリータンパク質の錯体、例えばTb(III)とラクトフェリンの錯体、の形成を促進する機能を持つ物質として働く。これらのアルカリ土類金属炭酸水素は個々に使用することが可能であり、また二つ以上のイオンを組み合わせて使用することも可能である。アルカリ土類金属炭酸水素の固定化の際には、ランタノイドイオンとともに固定化することが可能であり、また検出過程において前記アルカリ土類金属炭酸水素が少なくとも一つの前記ランタノイドイオンと接触するように、少なくとも一つの前記ランタノイドイオンと異なる領域に固定化することも可能である。したがって、例えば、アルカリ土類金属炭酸水素はサンプリング領域ないし以下に示すマイクロ流路の少なくとも一方に固定化することが可能である。0012本発明は、トランスフェリンファミリータンパク質の検出(定量化を含む)を目標とする。トランスフェリンファミリータンパク質は、鉄に結合することが知られている分子から成り、血清トランスフェリン(ないし単にトランスフェリンと称される)、オボトランスフェリン、ラクトフェリン(ラクトフェリンとも称される)、メラノトランスフェリン(MTF)が含まれる。多くのトランスフェリンファミリーメンバーは、およそ340のアミノ酸から成るローブを二つ(NとC)持つ。本発明において特に着目されるのは、トランスフェリンとラクトフェリンであり、ラクトフェリンは本発明において最も重要な目標物質である。本発明の紙装置は、具体的には涙液のトランスフェリンファミリータンパク質の検出に役立ち、さらに具体的には涙液のラクトフェリンの検出に役立つ。devices、μPADsと略される)である。一般にマイクロ流体構造のパターンは、紙基材を厚さ方向に貫いて形成される疎水性バリアによって得られる。これらのバリアは、マイクロ流体構造のパターンの輪郭を形成する。疎水性バリアは、水性系液体に対して不浸透性を示す。紙基材において規定された親水性領域は、サンプリング領域、感知領域、マイクロ流路などとして機能する。21](特許文献1)である。1)は、少なくとも一つのサンプリング領域と少なくとも一つの感知領域を含み、それらは互いにマイクロ流路によって連結される。本発明における他の実施においては、サンプリング領域と感知領域は同一でも良い。後者の形式の紙装置においては、マイクロ流路は不要である。この場合、試料を適用する領域(サンプリング領域)と信号を生成する領域(感知領域)は同一である。μPADの設計および寸法としては、図1に示すように試料適用と検出のための二つの正方形領域が、真っ直ぐなマイクロ流路で連結されたものが好ましい。μL)をサンプリング領域に適用することにより、物理的に観測可能な信号が感知領域に生成される。サンプリング領域と感知領域が互いにマイクロ流路によって連結されたμPADにおいては、サンプリング領域に適用された試料は、サンプリング領域から感知領域へ流れる。試料は紙の微孔構造に起因する毛細管力によって流れる。物理的に観測可能な信号には、色変化(紙装置表面の吸光度や反射の変化)や、蛍光発光強度の変化が含まれる。)に含まれるトランスフェリンファミリータンパク質(例えば、ラクトフェリン、トランスフェリンなど)の、蛍光発光強度を用いた紙装置による検出に関するものであり、紙装置には認識物質やその他の検査物質がインクジェット印刷により配置されている。係るデバイスの一般的な作製方法を図2に示す。好ましい実施においては、本発明は蛍光発光強度を検出に用い、インクジェット印刷により作製された紙装置による、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンの検出に関する。好ましい実施においては、本発明は蛍光発光強度を検出に用い、インクジェット印刷により作製されたマイクロ流体ペーパー分析デバイス(μPAD)による、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンの検出に関する。配置の双方に使用される。紙装置において物理的に観測可能な信号として好ましいのは、蛍光発光強度である。この蛍光発光は、認識物質(例えば、Tb3+などのランタノイドイオン)と生体液に存在するトランスフェリンファミリータンパク質によって形成された錯体から生ずる。好ましい実施においては、蛍光発光は紙装置に認識物質として配置されたTb(III)と涙液に存在するトランスフェリンファミリータンパク質であるラクトフェリンによって形成された錯体から生ずる。0016本発明における装置は紙を用いて作られる。本発明における紙基材として好ましいのは、セルロース繊維から作られる濾紙である。タンパク質(ラクトフェリンやトランスフェリンなどの、トランスフェリンファミリーメンバーを含む)の中には、ランタノイドイオン(ランタン、テルビウム、ユウロピウム、イッテルビウムなど)の存在下において蛍光を発するものがあることが報告されている。ラクトフェリン—テルビウム錯体はpHに依存した蛍光を放つこと、また生理的pH(7.4)においては安定した緑色蛍光を放つことが知られている[22]。μPADの感知領域にインクジェットプリントされたテルビウム塩(例えば、TbCl3)の溶液は、μPADのサンプリング領域に適用された試料に含まれるラクトフェリンの濃度に依存した強度の蛍光を放つ。μPADを外部光源により励起し、μPADの放つ蛍光の強度を、例えばデジタル色彩明度(例としてはR、G、B値)などの形式で観測することで、試料に含まれるラクトフェリンの濃度を定量することができる。本方法により、ラクトフェリンを比色分析によって(簡便)、抗体を使用することなく(安価)、20分以内に(迅速)分析することができる。達成された検出限界は、ラクトフェリンを定量するための従来の分析法ほど低濃度ではないが、涙液、特にヒト涙液に含まれるヒトラクトフェリンの異常濃度を検出するには充分低い濃度である。塩化テルビウム六水和物(TbCl3・6H2O)およびヒトラクトフェリンはシグマアルドリッチ(セントルイス、ミズーリ州)より購入した。10-デカンジオールジアクリレートは東京化成工業(東京、日本)より購入した。N-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)は同仁化学研究所(熊本、日本)より購入した。水酸化ナトリウムおよびポリビニルアルコールは関東化学(東京、日本)より購入した。ヒトラクトフェリンELISAキットはメルク(サンディエゴ、米国)より購入した。ヒト血清トランスフェリンおよびその他全ての試薬は和光純薬工業(大阪、日本)より購入した。MΩのミリQ水を使い調製した。堀場製作所)を用いて行った。PX-105インクジェットプリンター(エプソン、諏訪、日本)を用いて行った。2831(ダイマティクス富士フイルム、サンタクララ、米国)を用いて行った。nmのロングパスフィルター(シグマ光機、東京、日本)を装着したデジタルカメラDMC-FZ50(パナソニック、大阪、日本)を用いて行った。0019溶液の蛍光スペクトルの観測。ラクトフェリン—テルビウム錯体の形成を促進する炭酸水素ナトリウム(NaHCO3)の代わりに、他の炭酸水素塩、例えば炭酸水素カリウム(KHCO3)を使用することもできる。nmのロングパスフィルター(シグマ光機、東京、日本)を併用した。nmで固定し、シグナルは励起光から90°回転した方向より測定した。0020紙装置の作製。21]とほぼ同様に印刷した。インクを充填したEPSONインクジェットプリンターに給紙した。インクを重合するために紫外線を15分間照射した。紙の裏面には、表面のパターニングされた部分を完全に覆うように紫外線硬化疎水性インクを印刷し、冷却および10分間の紫外線照射を行った。次に、マイクロ流体構造がパターニングされた紙に、ラクトフェリン検出のための物質(認識物質およびその他の検査物質)を印刷した。μPADおよびその作製の模式図を図3に示す。mM)を、感知領域に8回印刷した。mM)に5分間浸漬し、37°Cにて20分間乾燥させた。mM)を、サンプリング領域に12回印刷した。テルビウムおよびNaHCO3の最適な印刷回数は実験的に検討され、上述の回数が最適であると判断した(テルビウムは4-12回、NaHCO3は10-15回の範囲でそれぞれ検討を行った)。0021溶液におけるラクトフェリンの蛍光検出。本発明では、試料中ラクトフェリン濃度はラクトフェリン—テルビウム錯体の放つ緑色蛍光を用いて定量した。nm)を放つことが報告されている[22]。一定量のラクトフェリンおよびテルビウムを含む溶液の蛍光発光強度は、pH6から7にかけて鋭い増加を示し、およそpH7.2において最大に達する。したがって、一定のpHにおいてラクトフェリン—テルビウム錯体の発する蛍光発光強度を観測することにより試料中ラクトフェリンを定量することができる。μLの試料をサンプリング領域に適用した。μL、pH7.4が最適であった。nmのロングパスフィルターを装着したデジタルカメラを用いて、発せられる緑色蛍光を撮影した。フィルターは、紙基材に反射されたUVハンドランプの励起光を遮断するために用いた。J(国立衛生研究所)により定量した。蛍光発光信号を撮影するための実験装置は図4に示した。0023ヒト涙液の分析。LoBindチューブ(エッペンドルフ)内で4°Cにて保存し、3日以内に使用した。開発したμPADsによるラクトフェリン濃度分析のため、希釈されていない涙液をサンプリング領域にマイクロピペットで適用した。比較のため、同一の涙液試料に含まれるラクトフェリン濃度をELISAキットによっても定量した。LoBindチューブ内で、ELISAキット付属のサンプル希釈用緩衝液を使用して105倍に希釈した。mg/mLであることに因る。μLの試料をサンプリング領域に適用した。nmのロングパスフィルターを装着したデジタルカメラを用いて、放たれる緑色蛍光を撮影した。フィルターは、紙基材に反射されたUVハンドランプの励起光を遮断するために用いた。J(国立衛生研究所)により定量した。蛍光発光信号を撮影するための実験装置は図4に示した。0025■結果と検討ラクトフェリン濃度に対する蛍光発光強度の依存性ラクトフェリン—テルビウム錯体の放つ蛍光発光強度のpH依存性は報告されているが[22]、ラクトフェリン濃度に対する依存性はこれまでに検討されていない。μMのTbCl3溶液の放つ蛍光を調べた。mM)に溶解することでpHを7.4に固定し、ヒト涙液の生理的pHに合わせた。ラクトフェリン—テルビウム錯体の蛍光発光スペクトル(図5)から、強度は試料のラクトフェリン濃度に依存することが明らかになった。nmで極大となるため、観測される蛍光発光は緑色を示す。mg/mLのヒトラクトフェリン試料をサンプリング領域に適用した。図6aに検量線を示す。ラクトフェリン濃度と、デジタルカメラで撮影した感知領域における緑色強度の間には良い相関が見られた(図6b)。蛍光発光強度の増加は、目視によっても簡単に確認することができた。注意すべき点は、μPADsは使い捨ての分析装置であることである。このため、検量線の全てのデータ点は別々のμPADを用いて測定された結果である。3つの測定結果における小さなエラーバー(標準偏差1s)は、インクジェット印刷により作製された装置が再現性に優れることを示す。0027サンプリング領域のHCO3-アニオンは、感知領域で見られるラクトフェリン—テルビウム錯体の放つ蛍光発光強度の増強に重要であることがわかった(データは示されていない)。この結論は、テルビウムがラクトフェリンに結合する際、カルボン酸塩アニオンが重要な役割を果たすという報告[23]と一致する。mg/mL)[24]を下回った。したがって、開発したμPADを用いれば、ヒト涙液ラクトフェリン濃度の異常を検出することが可能である。0028μPADsを実試料に応用する前に、想定されうるヒト涙液の主成分による妨害について調べた(表1)。μPADsの選択性を評価するため、各涙液成分が表1に示した濃度で、単一で存在する場合と、ラクトフェリンに混合された場合の蛍光応答を調べた。それぞれの結果を図7a、7bに示す。縦軸は感知領域の緑色強度からブランク(ラクトフェリンを含まないHEPES緩衝液)の信号を差し引いた結果を表す。図7aから、ラクトフェリン以外の涙液主成分は有意な蛍光応答を示さないことがわかった。他の成分が共存しても、感知領域に存在するTb3+に対するラクトフェリンの結合が阻害されないことも示された(図7b)。0029最後に、実試料の分析と開発した方法の正確性の評価を行った。開発したμPADsを用いてヒト涙液試料に含まれるラクトフェリン濃度を定量し、ELISA法による結果と比較した。μPADsによる分析では、希釈されていない涙液をサンプリング領域に適用し、ELISA法による分析では、涙液をELISAキット付属のサンプル希釈用緩衝液で105倍に希釈した。表2に示す結果から、μPADsで全てのサンプルを6%以内の誤差率で正確に分析できたことが示された。μPADsによる分析結果の中で、試料5に見られる比較的大きな標準偏差は、ラクトフェリン濃度がμPADsの応答濃度領域の上限付近であることに起因する。mg/mLとなり、標準偏差が大きく減少することが確認された。0030マイクロ流体構造がパターニングされた同一の紙装置を、ヒトトランスフェリンの分析に適用した。紙基材を使用することで、ヒト涙液に含まれるラクトフェリンを定量するための、抗体を必要とせず、安価で、使用が簡便、迅速な検出装置を初めて開発することに成功した。信号を得るまでに数時間におよぶ多くのピペッティングや洗浄、インキュベーションなどの操作を要するELISA法と異なり、μPADsによる分析で必要となる操作はマイクロピペッターによる試料の適用のみである。試料を適用してから、目視でも確認可能な蛍光信号を撮影するまでにかかる時間は15分以内である。簡便な操作手順や低い材料コストから、開発されたμPADsは、知識や技術のない人材でも涙液ラクトフェリンを定量することができる有用な装置として期待される。35-43ページトップへこの技術を出願した法人この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedInこの技術を発明した人物この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedInページトップへ関連する挑戦したい社会課題この情報を共有FacebookTwitterGoogle+LinkedIn環境にやさしいエネルギーを実現する環境にやさしいエネルギーの実現は、経済成長と環境や健康面への配慮を両立させる社会につながります。発電やエネルギー創出時の環境への影響は、大気汚染などの健康被害にもつながり、また人命にかかわる気...最終更新日:2018/06/13放射性廃棄物のない社会を実現する放射性廃棄物のない社会を実現することで、安心・安全な地球環境を実現しながらリスクの少ない電力創出が可能になると考えられています。イノベーションを導く多くの企業が膨大な労力と費用をかけて新たな市場や事業を生み出そうとしている中「イノベーション」にかかわるデータのニーズはかつてないほどの高まりを見せいます。