分類基準の制定により、ファイトプラズマの分子レベルでの研究が世界中で展開されることとなりました。ファイトプラズマの性状解明の手がかりをつかむために次の目標となったのはゲノム解析でした。世界各国でゲノムプロジェクトが進行するなか、2004年、当研究室において、世界で初めてファイトプラズマの全ゲノム解読に成功しました(図2)。この成果は、日本において植物病原細菌の全ゲノムを決定した事例としても初めてのことでした。TCA回路、酸化的リン酸化に関与する遺伝子を欠き、さらにペントースリン酸回路やPTS、ATP合成酵素に関する遺伝子も欠いていて、自律増殖する生物において最少遺伝子を持つとされるマイコプラズマより代謝関連遺伝子が少ないことが明らかになりました。これはファイトプラズマがマイコプラズマと異なり、細胞内寄生で栄養豊富な植物篩部に生息するため、退行的進化により遺伝子の多くを失ったためと考えられました(図3)。逆に、ファイトプラズマゲノムには、マイコプラズマには無い膜輸送系遺伝子が多数コードされていました(図3)。本成果により、ファイトプラズマ研究のステージは一気にポストゲノム研究へと押し上げられることとなりました。媒介昆虫を決定する分子メカニズムファイトプラズマは、系統ごとに特定のヨコバイにより媒介され、他のヨコバイにより媒介されることはありません。人の病原体であるマラリアを含め、多くの昆虫媒介性病原体は特定の昆虫によって媒介されますが、その特異性を決めているメカニズムはこれまで不明でした。そこで、ファイトプラズマの媒介昆虫特異性のメカニズムを解明する目的で、まずファイトプラズマの昆虫体内における局在を組織・細胞レベルで解析しました。行ったところ、ファイトプラズマと昆虫のアクチンとの局在が一致していました(図4)。そこで、Ampを結合させたアフィニティーカラムを作製し、これを用いてAmpと相互作用する昆虫宿主タンパク質を同定したところ、Ampは媒介昆虫の細胞骨格であるマイクロフィラメントを構成するアクチンやミオシンと複合体を形成することが明らかになりました(図5)。Amp–マイクロフィラメント複合体形成について異なる昆虫を用いて解析を行ったところ、ファイトプラズマ媒介能のある昆虫では複合体の形成が観察されましたが、ファイトプラズマを媒介しない昆虫では複合体の形成が認められませんでした(図6)。2001)、異なる切り口からも昆虫媒介のメカニズムの解析を進めました。この結果から、Ampに加えてORF3も、昆虫媒介性において重要な役割を持つ膜タンパク質であると考えられました。私達はさらに、宿主への接着に関わると考えられる膜タンパク質の解析を行いました。多くの病原細菌は宿主細胞への接着・侵入の際に,菌体表面の接着因子が重要な役割を果たします。接着因子は多くの病原細菌で見つかっていますが、ファイトプラズマにおいては見つかっていませんでした。motif(MAM)に着目し、MAMの配列情報を手がかりにファイトプラズマの接着因子ホモログを探索しました。その結果、MAM領域を持つ膜タンパク質P38を見つけました。本研究により、これまでマイコプラズマなど近縁の微生物においても不明であったMAMの機能が初めて明らかになりました。本研究を契機として、宿主への接着メカニズムの詳細解明が期待されます。植物にてんぐ巣症状を誘導する病原性低分子ペプチド「TENGU」てんぐ巣や葉化などのユニークな病徴は、ファイトプラズマ研究において最も興味深いテーマの一つです。ファイトプラズマが菌体の外へと分泌するタンパク質は、宿主細胞内に直接放出され、宿主細胞の代謝系に直接的に働きかけることができるため、病徴を誘導する病原性因子の最有力候補と考えられました。そこで、ファイトプラズマゲノムにコードされる分泌タンパク質遺伝子に焦点をあて、その病徴誘導活性のスクリーニングをおこないました。その結果、分泌タンパク質のうちの一つを発現させた植物において、草丈の伸長が抑えられる「萎縮症状」と、枝分かれが異常に増加する「叢生症状」が認められ、これら症状はファイトプラズマ感染植物と酷似していました(図8)。萎縮・叢生症状を呈する植物は、日本では古来より「てんぐ巣病」と呼ばれていたことから、萎縮および叢生症状を誘導するこの分泌タンパク質をてんぐ巣病の誘導因子「TENGU」と命名しました。TENGUはわずか38アミノ酸からなるタンパク質で、植物に形態変化を誘導する植物病原細菌由来のペプチド性因子は、世界で初めての発見でした。ファイトプラズマは篩部局在性ですが、ファイトプラズマ感染植物組織におけるTENGUの動態を調べたところ、TENGUは植物の茎頂分裂組織(成長点)や側芽の分枝領域の細胞にまで移行していることが分かりました。TENGUを発現する形質転換植物において特異的に発現が変動する植物遺伝子群を、マイクロアレイ解析によって特定した結果、植物ホルモンの一つであるオーキシンに関連した遺伝子群の発現レベルが大きく低下していました。TENGUによるてんぐ巣症状誘導メカニズムさらに私達はTENGUの病徴誘導領域を絞り込み、全長38アミノ酸のうちN末端側のわずか11アミノ酸がてんぐ巣症状を引き起こす活性を持つことを明らかにしました(図10)。両条件下で、TENGUが切断されることが分かりました。ペプチドシーケンス及びTOF-MSを用いた解析から切断部位の特定をした結果、N末端側は病徴誘導領域である11アミノ酸を含む長い断片として生成されることが明らかになりました。TENGUの切断はセリンプロテアーゼ阻害剤であるPMSFにより阻害されたため、植物が持つセリンプロテアーゼによりTENGUが切断されていると考えられました。加えて、TENGUのファイトプラズマ間における保存性を解析したところ、主要グループの1つであるAYグループにおいてTENGUの配列や機能、被切断特性が広く保存されていることが明らかになりました。Physiology)。モデル一方、ファイトプラズマに感染した植物は、しばしば種子を作れず子孫を残せない「不稔症状」を伴った病徴を引き起こします。不稔症状は、果実や種子の生産に致命的な被害を与える重大な病気の一つですが、その原因物質やメカニズムについてはこれまで不明でした。当研究室では、不稔症状を引き起こす病原性因子が「TENGU」であり、一つの病原性因子が「天狗巣」と「不稔」という2つの異なる症状を引き起こす、非常に興味深い現象を突き止めました。植物にTENGUを発現させると、花粉が奇形となり、雄性不稔症状が起こることを発見しました(図12)。TENGUを発現させた植物の花芽では、花の稔性に関わる複数の植物ホルモン(ジャスモン酸およびオーキシン)の蓄積量が低下することが明らかになりました。発現量が、TENGU発現植物およびファイトプラズマ感染植物いずれにおいても抑制されることを明らかにしました。従って、ファイトプラズマに感染した植物では、TENGUの作用により植物のARF6およびARF8の発現が抑制され、植物ホルモン量が低下し、不稔症状を引き起こすと考えられました。TENGU発現植物における花粉の成熟不全と不稔ファイトプラズマが花を葉に変えるメカニズム花が葉になる「葉化(phyllody:phyllo-(葉)+-ody(になる変化))」や、花から若芽が出現する「つき抜け」などの花器官における病徴も、ファイトプラズマが引き起こす非常にユニークな病徴です。)の形成を制御するA、B、C、D、E遺伝子に着目し、ファイトプラズマの感染による影響を解析しました。A~Eにより表されるこれらの遺伝子はいずれもMADSドメイン転写因子をコードしており、それらがヘテロ四量体を形成する際の組合せにより、各花器官への分化が決定されます(カルテットモデル)。葉化症状が見られた花器官では、そのヘテロ四量体の形成に必要な遺伝子の一部の発現量が有意に減少していることが判明しました(図13)。興味深いことに、発現量が減少した遺伝子の種類に一貫性はなく、例えば葉化したがくでは、がくの形成に必要とされるA、E遺伝子のうち、A遺伝子の発現が抑制されていた一方、同じく葉化の見られた花弁では、花弁の形成に必要とされるA、B、E遺伝子のうち、A遺伝子ではなくB遺伝子の発現が抑制されていました。本研究は分子レベルで葉化症状の原因を説明づけた世界で初めての成果となりました。今回得られた成果は、植物の花器官形成メカニズムの解明にもつながる普遍性があり、園芸品種の育成に応用することで病原体フリーの葉化品種の開発も期待されています。family(葉化誘導遺伝子ファミリー)の略)」と命名しました。ファイロジェンの働きを調べたところ、まずファイロジェンはカルテットモデルを構成するMADSドメイン転写因子群のうち少なくともA、Eの転写因子に結合する性質を持っていることが分かりました。そこで、実際にA、E転写因子をファイロジェンとともに植物細胞に導入したところ、それら転写因子が分解されることが明らかになりました。タンパク質分解装置(プロテアソーム)を阻害するようにあらかじめ処理すると転写因子の分解が阻害されたため、ファイロジェンが植物のプロテアソームを利用してMADSドメイン転写因子群を分解していることが確かめられました。A、E転写因子はB転写因子の発現を誘導することが知られていますが、ファイロジェンを発現させた植物では逆にB転写因子の発現が抑制されていました。A、E転写因子が細胞内で分解されたため、B転写因子の誘導が阻害されたと推定されます(図14)。これらの研究は分子レベルで葉化症状の原因を説明づけた世界で初めての成果となりました。今回得られた成果は、植物の花器官形成メカニズムの解明にもつながる普遍性があり、園芸品種の育成に応用することで病原体フリーの葉化品種の開発も期待されています。ファイロジェンの作用メカニズム動物・植物間のホストスイッチングに伴う環境適応ファイトプラズマは昆虫-植物の宿主間を水平移動する「ホストスイッチング」により感染を拡大します(図15)。昆虫と植物という全く異なる生物界の宿主に寄生する能力には興味が持たれてきましたが、その仕組みはこれまで謎に包まれていました。ホストスイッチングにはファイトプラズマの遺伝子発現の切り替えが伴うと予想されたため、それら遺伝子を網羅的に調べるために、ゲノムデータ(図2)をもとに世界初となるファイトプラズマのDNAマイクロアレイを作製しました。ファイトプラズマはそれぞれの宿主に合わせて、物質輸送を行うトランスポーターや浸透圧を調節するチャネル、糖を分解する酵素、宿主細胞内で働く分泌タンパク質などを巧みに使い分けている点に興味が持たれました。そこで、実際に植物感染時に働く浸透圧調節チャネルの機能を、阻害剤を用いて抑制したところ、ファイトプラズマの増殖を部分的に抑えることに成功しました。この結果は、ホストスイッチングの阻害・抑制が、特効薬が無く防除や予防が困難なファイトプラズマ病の新規防除法につながる可能性を示す成果です。ついて研究を進めました。多くの細菌は、周囲の環境変化に応じてσ(シグマ)因子と呼ばれる転写因子を使い分けることで遺伝子発現を制御しています。One)、ホストスイッチングに関与する可能性が考えられました。RNA転写系を構築し、ファイトプラズマのRpoDにより発現制御される遺伝子を解析しました。解析により明らかにしました。RpoDは一般に、恒常的に発現してハウスキーピング遺伝子の発現を司るσ因子として知られていましたが、本研究により、ファイトプラズマのRpoDは他の細菌よりも複雑な機能を担うことが示唆されました。あると考えられ、ファイトプラズマのホストスイッチング機構の解明に繋がる重要な成果であると考えられます。ファイトプラズマ研究のこれからファイトプラズマ研究に分子のメスが入ってから20年、全ゲノム解読から10年が経過しました。この間、ファイトプラズマ研究は目覚ましい勢いで進展し、当研究室の研究チームは常に世界をリードし続けてきました。この10年のポストゲノム研究により、当初は想像もできなかったようなファイトプラズマの実体が私たちによって次々と解明されてきました。明らかになった部分はまだほんの一部であり、依然としてその性状の多くは謎に包まれています。ファイトプラズマの極限にまで切り詰められてもなお生命として存在する代謝系の動植物宿主との物質のやり取りを通じた動的解明はまだ終わっていません。ファイトプラズマが植物に引き起こすユニークな病徴の生物学的意義や植物・ファイトプラズマの共進化の意義、植物宿主域の決定メカニズムの詳細も未だ完全には解明されていません。宿主である植物・昆虫のファイトプラズマ感染に対する防御応答や共生のメカニズム解明へと私たちの研究の展開にはボーダーはありません。ゴールはもう間近に迫っています。ファイトプラズマ研究はこの20年の間に驚異的に進化しましたが、これまでの知見を基盤に、新たなパラダイムを構築することが、今後の研究展開の重要な鍵となります。さらなる進化に向けて、今後の研究の飛躍が期待されます。