Informationお気軽にお問合せください。アプリケーションは、特別なラボだけのものから一般的なものへとなりつつあります。アプリケーションを確立するプロセスは、ユーザーにとっては手ごわいと感じられることがあります。フローサイトメトリーのシグナル検出の革新によって、パネルデザインとデータ生成のプロセスは容易になります。detectors(APD)を用いたことで、CytoFLEXは容易なパネルデザインを可能にする2つの重要な利点を備えています。tubes(PMT)に比べて、より広いスペクトル範囲においてより高い感度を示します。次に、この高い光感度によって測定誤差が小さくなり、その結果、広がりが小さくなります(図1)。spreading(漏れ込みの補正によるネガティブピークの広がり)を最小限に抑えることにより、暗い集団と陰性の集団をより確実に識別できるため、暗いマーカーに対するチャンネル選択はそれほど重要ではなくなります。DURACloneなどのドライ抗体試薬パネルを使用することによっても、デザインを容易にすることができます。IMパネルを「バックボーン」として用いることで、多くのパラメータを事前に最適化し安定した状態に保ったまま、追加の染色を随時行うことが可能です。パラメータ実験系を作成する際のデザインやセットアップに要する労力を減らすことができます。Subsetパネルを用いて、簡単にパネルをデザインし、信頼性の高いデータを作成する方法を示します。IMバックボーンを複数の実験デザインやニーズに合わせて変更することで、実験中に生じた新たな質問に素早く答えることができます。ここでは、これらのテクノロジーを用いて18カラーパネルを迅速にデザインし、試験を行った例を説明します。ペクトル範囲におけるAPDとPMTの量子効率(QE)、すなわち光子から電子への変換効率を示したグラフ。このように光子から電子への変換効率が高くなることで、測定誤差が小さくなるため、感度および分解能が高くなります。nmを超える蛍光波長でQEが高くなるため、非常に暗いビーズでも分解能が良好となることが示されています。APDベースのシステム(右図)では、PMTベースのシステム(左図)に比べてQEが高いために、隣接する検出器のデータの広がりも小さくなります。DURACloneを使用した場合と使用しない場合の抗体パネルデザインワークフローの比較。DURACloneパネルは、パネルのバックボーンとして事前に最適化し安定した試薬が提供されていることで、より少ない労力で大きなパネルを構築することができます。DURACloneはそれだけ使用するか、より多くの色を試験および追加することができます。BufferをDURACloneチューブに添加しなければなりません。試薬が十分に混合されるよう、検体の添加後および追加の蛍光標識抗体を添加後、ただちにDURACloneチューブを攪拌(ボルテックス)してください。17マーカー、18カラーパネルデザイン。上記のパネルに、この試験で用いたマーカーと蛍光色素の組み合わせを示します。Subsetのバックボーンを赤枠で示します。使用しなかったチャンネルはグレーの網掛けで示します。コンペンセーションマトリックスおよび階層的ゲーティングこの実験では、計3名の健常ドナーから得た静脈穿刺24時間後の検体を試験しました。Subsetを用い、パネルを完成させるために8つのマーカーを追加しました。マーカーと蛍光色素の組み合わせは、マルチカラーデザインの標準原則に従い、望ましいマーカーに対する蛍光標識抗体の入手可能性も考慮して選択しました。詳細なT細胞解析を開始する前に、予備的なゲーティングを行います。IR励起の固定可能な生細胞識別色素を用いて死細胞を除外し、生細胞をゲーティングします。次に、SSC対CD45プロットとして生細胞をプロットし、これを白血球(WBC)の特定のために用います。デブリを除外するため、WBCの周囲にゲートを作成します。リンパ球ゲートは、SSCが低くCD45が高い蛍光プロファイルを持つ集団の周囲に作成します。リンパ球は、ダブレット(凝集細胞)をゲートアウトし、解析から単球(CD33陽性)を除外することで、さらに絞り込めます。最後に、実験中のシステムの流路系および安定性の内部検証として、Timeプロットを追加しています(図6a)。ここでは、T細胞サブセットで計24個の集団を評価しました。評価できる集団はこれらに限定されません。この解析を始めるにあたり、まずリンパ球リージョン内にCD3陽性細胞のリージョンを描画します。これにより、NK細胞(CD8)や単球(CD4)などのこれらのマーカーを発現している可能性があるほかの細胞種類から、CD4陽性T細胞とCD8陽性T細胞を区別することができます。CD4陽性T細胞サブセットを詳しく見てみると、CD4陽性CD25陽性T細胞の集団は制御性T細胞を構成しています。One(FMO)のコントロールを組み込んでいます。CD4陽性細胞のゲーティングでは、Tregの関数としてCCR4の発現を評価することも可能です。CCR4マーカーは皮膚細胞のホーミングにおいて重要な役割を担っており、CCR4陽性細胞のサブセットはエフェクター制御性T細胞の抑制をコントロールしているといわれています3。CD45RAとCCR7を組み合わせることで、ナイーブ(CD45RA陽性CCR7陽性)、セントラル(CD45RA陰性CCR7陽性)、メモリー・エフェクター(CD45RA陽性CCR7陰性)、エフェクターメモリー(CD45RA陰性CCR7陰性)細胞など、活性化中に起こるT細胞サブセットの様々な段階や経路を調べることができます。各表現型は、CD27とCD28の共刺激分子の様々な発現を調べることで、さらに評価することが可能です。Cell-1(PD-1)は、CD28スーパーファミリーに属し、制御性T細胞を活性化しますが、エフェクターT細胞の機能は妨げます。CD95は細胞を介したアポトーシスに関与します。CD95は主にメモリーT細胞に発現していますが、ナイーブ表現型の少数のT細胞にもCD95が発現しており、これらはいわゆるメモリータイプの幹細胞様T細胞であると考えられます(図6b)4。T細胞サブセットに関しても、CD4と同様の手法でCD45RA、CCR7、CD28およびCD27マーカーサブセットを調べています。CD8陽性CD57陽性サブセットは、細胞傷害性が高く、増殖能が低い最終分化T細胞を表しています。このT細胞サブセットにおいても、CD45RAの機能としてCD95の発現が再度評価されています(図6c)。このパネルでは、T細胞ほど十分に抗体染色されていませんが、CD3陰性集団にB細胞(CD19陽性、CD20陽性、HLA-DR陽性)がゲーティングされていることが観察できます。5,6この集団または他の細胞種類において詳細な情報を得たい場合は、バックボーンパネルのオープンチャンネルを用いて容易に変更することが可能です(図6d)。結論このアプリケーションノートでは、DURACloneのドライ抗体試薬アッセイをバックボーンとして用いることで、イムノフェノタイピングパネルのより詳細な解析を簡単に実施できることを示しました。バックボーンを用い、次にサイトメーターのオープンチャンネルを利用することにより、結果を迅速に得ることができ、また、パネルのいくつかのパラメータが事前に最適化されていることが分かっているという安心を得ることができます。この方法は、研究における特定の質問に答えるためにdrop-inの試薬を設定できるため、ラボの柔軟性も高くなります。IMチューブを使用することにより、試薬の分注に要する時間が削減でき、複数の試薬を複数のサンプルチューブに分注する際に起きる過誤の可能性も低くなります。パネルデザインが可能となります。BV786をV763チャンネルにセットするように、そのマーカーを高感度のチャンネルに特別にセットする必要はもはやありません。FMOは行われていますが、CD4陽性CD25陰性細胞とCD4陽性CD25陽性細胞との区別ははっきりと確認できたことから、このシステムが暗い集団と陰性の集団を識別できることは明らかです。プロトコールDURACloneコンペンセーションコントロール(DURACloneキットに含まれています)を染色します。各コンペンセーションコントロールチューブをラックにセットします。陽性および陰性VersaCompビーズ各1滴を各チューブに添加します。室温で20分間、遮光して放置します。gで6分間遠心分離します。ボルテックスを行います。一時使用試薬のコンペンセーションコントロールを作成します。陽性および陰性VersaCompビーズ各1滴を各チューブに添加します。室温で20分間、遮光して放置します。gで6分間遠心分離します。ボルテックスを行います。染色血液を調製します。μLを各DURACloneチューブに添加します。860のそれぞれの試験量を滴定し、各DURACloneチューブに添加します。mmチューブを未染色全血とします。CytoFLEXシステムスタートアッププログラムを実行します。検出器の構成を確認します。ユーザーマニュアル「CytoFLEXシリーズ取扱説明書」(文書番号B54849xx)に従って、精度管理手順を実施します。コンペンセーション実験を作成します。ロット変更時にコンペンセーションコントロールを更新できるようにするため、使用するDURACloneコントロールとdrop-in試薬のロット番号を入力します。サンプルタイプの列でビーズを選択し、シングルカラーコントロールを反映させます。VersaCompビーズは各チューブ内に陰性ピークが含まれているため、ユニバーサルネガティブ使用のチェックは外します。各コンペンセーションサンプルを記録します。シングレットビーズが含まれるようにスキャッターゲートを移動させます。対数線形スライダーを用いて陰性集団の域を狭め、陰性集団が含まれるようにゲートを移動させます。陽性集団が含まれるようにゲートを移動させます。コンペンセーションマトリックスを計算し、ライブラリーに保存します。CytExpertでExperimentを作成します。作成したコンペンセーションライブラリーをインポートし、現在のゲインに基づいてマトリックスを変換します。プロットを作成します。希望しない電話:希望する希望しないお客さまからご提供いただいた個人情報を尊重し、個人情報の保護に努めております。個人情報保護方針とサイト利用規約をご確認ください。いいえreCAPTCHAは自動化されたフォームスパムを防ぐのに役立ちます。CAPTCHAを完了するまで、送信ボタンは無効になります。reserved.それぞれの国によりすべての製品が入手できない場合があります。製品入手の可否及び規制内容は各国の規制対応に準じます。各製品は次の規制表示のいずれかに該当いたします。(体外診断用医薬品)該当製品は米国FDA規制に準じます。日本国内規制での体外診断用医薬品に該当しない場合があります。日本における体外診断用医薬品に関してはこちらをご確認ください。established.”のラベルが添付されます。Diagnostic該当製品及びヨーロッパ規制(98/79/EC)に順じます。(製品はヨーロッパ規制98/79/EC以外にCEマークが添付される場合が有ります。Only(研究使用限定)”のラベルが添付されています。Only(研究使用限定)”のラベルが添付されています。Status:医療用機器又は規制商品ではありません。診断又は治療行為には使用できません。