公知のJHDM阻害剤であるN-オキサリルグリシン(NOG)を比較例1とした。μMより大きいであった。公知のJHDM阻害剤である2,4-ピリジンジカルボン酸(PCA)を比較例2とした。μMより大きいであった。特許文献1の実施例21で得た化合物(NCDM-28a)を比較例3とした。特許文献1の実施例6で得た化合物(NCDM-32a)を比較例4とした。μMより大きいであった。1~12及び比較例1~2の化合物について、KDM7a、KDM7b、JMJD2A、JMJD2C及びJARID1Aの阻害活性試験を行った。【0184】(1)KDM7aKDM7aは、全長のC末端にFLAGタグを付加した組換えタンパク質をコードするバキュロウイルスを作製し、それを感染させた昆虫細胞を用いて発現させた。感染昆虫細胞をホモジェナイザーで溶解し、その可溶性画分を抗FLAG抗体アフィニティークロマトグラフィーに供することにより、精製KDM7a酵素を取得した。2,4-ペンタンジオン、0.1M酢酸、3.89M酢酸アンモニウム)を用いて変換させたジアセチルジヒドロルチジンの定量により測定した。KDM7aからなる50μlの溶液を37°Cで1時間インキュベート後、酵素反応を測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50%の活性を阻害する濃度(IC50)で示した。比較例4については、濃度100μMの際の阻害活性が60%であった。【0186】(2)KDM7bKDM7b酵素の活性領域を含む1-610aa部分のN末端にグルタチオンS-トランスフェラーゼを付加した組換えタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを構築し、昆虫細胞に感染させた。感染させた昆虫細胞を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をグルタチオンセファロース4Bに結合させて洗浄後、溶出することにより、精製KDM7b酵素を取得した。【0187】KDM7bの酵素活性は、KDM7bの脱メチル化反応の基質として用いた合成メチル化ペプチドのメチル基の脱離をMALDI-TOF質量分析法で解析することにより測定した。KDM7bからなる8μlの溶液を37°Cで1時間反応させた。トリフルオロ酢酸)75μlを加え、30秒間ソニケーション後、1μlをMALDIサンプルプレートにスポットし、風乾した。Biosystems社)にセットし、合成メチル化ペプチド基質の脱メチル化反応産物を測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50%の活性を阻害する濃度(IC50)で示した。【0188】(3)JMJD2AJMJD2A酵素は、活性領域を含む1-350aa部分のN末端に6個の連続するヒスチジン残基を含むタグペプチドを付加した組換えタンパク質をコードするプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて発現させた。組換え大腸菌を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をHisTrapクロマトグラフィーに供することにより、精製JMJD2A酵素を取得した。【0189】JMJD2Aの酵素活性は、JMJD2Aの脱メチル化反応の際に生成するホルムアルデヒドをホルムアルデヒド脱水素酵素により酸化させることで生じる3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド(APADH)で定量することにより測定した。JMJD2Aからなる30μlの溶液を室温で30分間、経時的に酵素反応を測定した。465nm)により測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50%の活性を阻害する濃度(IC50)で示した。【0190】(4)JMJD2CJMJD2C酵素は、活性領域を含む1-350aa部分のN末端に6個の連続するヒスチジン残基を含むタグペプチドを付加した組換えタンパク質をコードするプラスミドで形質転換した大腸菌を用いて発現させた。組換え大腸菌を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をHisTrapクロマトグラフィーに供することにより、精製JMJD2C酵素を取得した。【0191】JMJD2Cの酵素活性は、JMJD2Cの脱メチル化反応の際に生成するホルムアルデヒドをホルムアルデヒド脱水素酵素により酸化させることで生じる3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド(APADH)で定量することにより測定した。JMJD2Cからなる30μlの溶液を室温で30分間、経時的に酵素反応を測定した。465nm)により測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50%の活性を阻害する濃度(IC50)で示した。【0192】(5)JARID1AJARID1A酵素の活性領域を含む1-797aa部分のN末端に6個の連続するヒスチジン残基を含むタグペプチドを付加した組換えタンパク質をコードする遺伝子を組み込んだバキュロウイルスを構築し、昆虫細胞に感染させた。感染させた昆虫細胞を超音波処理で溶解し、その可溶性画分をHisTrapクロマトグラフィーに供することにより、精製JARID1A酵素を取得した。【0193】JARID1Aの酵素活性は、JARID1Aの脱メチル化反応の際に生成するホルムアルデヒドをホルムアルデヒド脱水素酵素により酸化させることで生じる3-アセチルピリジン-アデニンジヌクレオチド(APADH)で定量することにより測定した。JARID1Aからなる30μlの溶液を室温で30分間、経時的に酵素反応を測定した。465nm)により測定した。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の酵素活性を100%として残存活性を測定し、その50%の活性を阻害する濃度(IC50)で示した。あるHeLa細胞、及びヒト食道癌由来細胞株であるKYSE150細胞の増殖に対する化合物の阻害活性を測定した。細胞増殖は、3-[4,5-ジメチルチアゾール-2-イル]-2,5-ジフェニルテトラゾリウムブロマイド(MTT)アッセイ法により測定した。96ウエルマイクロタイタープレートにHeLa細胞及びKYSE150細胞を1ウエルあたり100μlの10%ウシ胎児血清含有RPMI1640培地に5000細胞ずつ播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した後、化合物を添加した。48時間培養後、5mg/mlのMTT液を1ウエルあたり10μl入れ、CO2インキュベーターでさらに3時間培養した。塩酸-イソプロパノール)を1ウエルあたり100μl入れて激しくボルテックス後、FusionαFP(PerkinElmer社)で560nmの吸光度を測定し、細胞の生存量を求めた。化合物による阻害活性は、ジメチルスルホキシド添加時の比色値を100%として残存活性を測定し、その50%の活性を阻害する濃度(IC50)で示した。105cells/mLの濃度で播種し、CO2インキュベーターで24時間培養した後、ジメチルオキサリルグリシン(DMOG;比較例1の化合物に対応)又は実施例8の化合物(NCDM-59a)を添加し、CO2インキュベーターで48時間処理した。mMとし、NCDM-59aについては1μM、10μM又は30μMとした。PBSで細胞を洗浄後、再度上澄みを吸引除去した。SDSバッファーを加え細胞を溶解しさらにすり潰したものを99°Cで加熱変性処理した。Laboratories)を用いて溶解物の蛋白質量を測定し、SDS-サンプルバッファーにより希釈し同一蛋白質量を含む電気泳動サンプルを調製した。Laboratories)に転写した。スキムミルク)中で、4°Cで一晩インキュベーションした。スキムミルク)中で振盪しながら室温で1時間半インキュベーションした。【0200】TBSバッファー、TBS-Tバッファーで洗浄したのち、化学発光法により観察した。DMOGについては、1mMまで濃度を高くしてもH3K27me2レベルの亢進は見られなかったが、本発明の化合物であるNCDM-59aについては、30μM程度の濃度でH3K27me2レベルの亢進が見られた。