これらの構築物は、直接DNA形質転換または病原体媒介性トランスフェクションによって植物細胞に導入することができる。(1992)を参照のこと)。昆虫系を使用して目的のポリペプチドを発現させてもよい。larvaeにおいて外来遺伝子を発現させる。該ポリペプチドをコードする配列を、ウイルスの非必須領域、例えばポリヘドリン遺伝子内にクローニングし、ポリヘドリンプロモーターの制御下に配置してよい。該ポリペプチドをコードする配列が首尾良く挿入されるとポリヘドリン遺伝子が不活性になり、コートタンパク質を欠く組換えウイルスが生産される。哺乳動物の宿主細胞では、いくつかのウイルスベースの発現系が一般に利用可能である。アデノウイルスが発現ベクターとして使用される場合、目的のポリペプチドをコードする配列を、後期プロモーターおよび3成分(tripartite)リーダー配列からなるアデノウイルス転写/翻訳複合体内にライゲーションしてよい。転写エンハンサー、例えばラウス肉腫ウイルス(RSV)エンハンサーを使用して、哺乳動物の宿主細胞における発現を増加させてよい。1998で概説されている。2004に見出すことができる。特定の開始シグナルを使用して、目的のポリペプチドをコードする配列の、より効率的な翻訳を達成してもよい。そのようなシグナルには、ATG開始コドンおよび隣接配列が含まれる。ポリペプチドをコードする配列、その開始コドン、および上流配列が適切な発現ベクター中に挿入される場合、追加の転写または翻訳調節シグナルが必要とされないかもしれない。コード配列、またはその一部分しか挿入されない場合、ATG開始コドンを含めた外因性翻訳調節シグナルが提供されるべきであろう。インサート全体の翻訳を保証するために、該開始コドンは正しいリーディングフレームであるべきであろう。外因性翻訳エレメントおよび開始コドンは、種々の起源の、天然物および合成物の両者であってよい。使用される具体的な細胞系に適切なエンハンサーを含ませることによって発現効率を高めてよい。【0132】さらに、宿主細胞株を、所望の様式で、挿入配列の発現をモジュレートするか、あるいは発現タンパク質をプロセシングするその能力に関して選択してよい。そのようなポリペプチドの改変には、非限定的に、アセチル化、カルボキシル化、グリコシル化、リン酸化、脂質化(lipidation)、およびアシル化が含まれる。「プレプロ(prepro)」形式のタンパク質を切断する翻訳後プロセシングを使用して、正しい挿入、折りたたみおよび/または機能を促進してもよい。そのような翻訳後の作業に特有の細胞機構および特徴的機構を有する、異なる宿主細胞、例えばCHO、HeLa、MDCK、HEK293、およびWI38を選択して、外来タンパク質の正しい改変およびプロセシングを保証してよい。組換えタンパク質の長期の、高収量の生産のためには、概して、安定発現が好ましい。ウイルスの複製起点および/または内因性発現エレメントおよび、同一または別のベクター上の選択マーカー遺伝子を含有してよい発現ベクターを使用して、目的のポリヌクレオチドを安定に発現する細胞株を形質転換してよい。該ベクターの導入後、細胞を強化培地中で1〜2日間成長させてよく、その後、それらを選択培地に切り換える。選択マーカーの目的は選択のための耐性を付与することであり、その存在により、導入配列を首尾良く発現する細胞の培養および回収が可能になる。細胞タイプに適切な組織培養技術を使用して、安定に形質転換された細胞の耐性クローンを増殖させてよい。任意の数の選択系を使用して形質転換細胞株を回収してよい。(1990))遺伝子が含まれる。それらは、それぞれ、tk.sup.−またはaprt.sup.−細胞において使用することができる。追加の選択可能遺伝子が報告されている。(1988))である。最近、可視マーカーの使用が人気を獲得している。【0135】マーカー遺伝子発現の存在/不存在は目的の遺伝子も存在することを示唆するが、その存在および発現を確認する必要があるかもしれない。ポリペプチドをコードする配列がマーカー遺伝子配列内に挿入されれば、マーカー遺伝子機能の不存在によって配列を含有する組換え細胞を特定することができる。単一のプロモーターの制御下でポリペプチドをコードする配列と直列にマーカー遺伝子を配置することができる。【0136】あるいは、当業者に公知の種々の手順によって、所望のポリヌクレオチド配列を含有および発現する宿主細胞を特定してよい。これらの手順としては、非限定的に、DNA−DNAまたはDNA−RNAハイブリダイゼーションおよびタンパク質バイオアッセイまたは免疫アッセイ技術(核酸またはタンパク質を検出および/または定量するためのメンブレン、溶液、またはチップベースのテクノロジーが含まれる)が挙げられる。【0137】ポリヌクレオチドによってコードされる生成物の発現を検出および測定するための種々のプロトコルであって、該生成物に特異的なポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体を使用するプロトコルは当技術分野において公知である。(FACS)が含まれる。いくつかの適用では、所定のポリペプチド上の2種の不干渉エピトープと反応性のモノクローナル抗体を利用する2部位のモノクローナルベースの免疫アッセイが好ましいかもしれないが、競合的結合アッセイを使用してもよい。(1983)に記載されている。多種多様な標識およびコンジュゲーション技術が当業者に公知であり、種々の核酸およびアミノ酸アッセイにおいて使用してよい。ポリヌクレオチドに関連する配列を検出するための標識ハイブリダイゼーションまたはPCRプローブの作成手段には、オリゴラベリング(oligolabeling)、ニックトランスレーション、末端標識化またはPCR増幅(標識ヌクレオチドを使用する)が含まれる。配列、またはその任意の部分を、mRNAプローブを生産するためのベクターにクローニングしてよい。vitroでRNAプローブを合成するために使用してよい。種々の市販のキットを使用してこれらの手順を実行してよい。発色物質ならびに基質、補助因子、インヒビター、磁気粒子、等が含まれる。目的のポリヌクレオチド配列で形質転換された宿主細胞を、細胞培養から該タンパク質を発現および回収するために適した条件下で培養してよい。組換え細胞によって生産されたタンパク質を分泌させるか、あるいは細胞内に含有させてよい。それは使用される配列および/またはベクターに依存する。当業者に理解されるように、本発明のポリヌクレオチドを含有する発現ベクターは、原核細胞膜または真核細胞膜を通過するコード対象のポリペプチドの分泌を導くシグナル配列を含有するように設計してよい。他の組換え構築物を使用して、目的のポリペプチドをコードする配列を、可溶性タンパク質の精製を容易にするポリペプチドドメインをコードするヌクレオチド配列と連結してもよい。Wash.)で利用されるドメインが含まれる。Calif.)に特異的な配列を精製ドメインおよびコード対象のポリペプチドの間に含ませることによって精製を容易にしてよい。そのような発現ベクターの1つは、目的のポリペプチドを含有する融合タンパク質および、チオレドキシンまたはエンテロキナーゼ切断部位に先行する6ヒスチジン残基をコードする核酸の発現を提供する。(1992)に記載のようにIMIAC(固定金属イオンアフィニティークロマトグラフィー)上での精製を容易にし、一方、エンテロキナーゼ切断部位は該融合タンパク質に由来する所望のポリペプチドを精製するための手段を提供する。(1993)に提供されている。(1963))によって本発明のポリペプチド、およびその断片を生産してよい。マニュアル技術を使用するか、あるいは自動化によってタンパク質合成を実施してよい。Elmer)を使用して達成してよい。種々の断片を別々に化学合成し、化学的方法を使用して組み合わせて、全長分子を生産してよい。vivoで細胞に導入する。これは多様な周知のアプローチのいずれかを使用して達成してよく、説明のためにそのアプローチのいつくかを以下に概説する。vivoで送達するための好ましい方法の1つにはアデノウイルス発現ベクターの使用が含まれる。「アデノウイルス発現ベクター」とは、(a)構築物のパッケージングをサポートし、かつ(b)センスまたはアンチセンス方向で構築物にクローニングされているポリヌクレオチドを発現するために十分なアデノウイルス配列を含有する構築物を含むものとする。アンチセンス構築物の関連では、発現には、その遺伝子産物が合成されることは必要とされない。該発現ベクターは遺伝子改変型のアデノウイルスを含む。レトロウイルスとは対照的に、宿主細胞のアデノウイルス感染では染色体への組込みが生じない。その理由は、アデノウイルスDNAがエピソーム様式で複製できるからであり、潜在的な遺伝毒性を有さない。アデノウイルスは構造的に安定であり、大規模な増幅後にゲノムの再編成は検出されていない。アデノウイルスは、実質的にすべての上皮細胞に、それらの細胞周期段階にかかわらずに感染することができる。現在までのところ、アデノウイルス感染は、軽度の疾患、例えばヒトの急性呼吸器疾患にしか関連しないようである。【0144】アデノウイルスは、その中程度のゲノムサイズ、操作の容易さ、高い力価、広い標的細胞の範囲および高い感染力のために遺伝子導入ベクターとしての使用に特に適している。該ウイルスゲノムの両端は100〜200塩基対の逆位反復(ITR)を含有する。それはウイルスDNAの複製およびパッケージングに必要なシスエレメントである。該ゲノムの初期(E)および後期(L)領域は、ウイルスDNA複製の開始によって分割される異なる転写単位を含有する。E1領域(E1AおよびE1B)は、ウイルスゲノムおよび少数の細胞遺伝子の転写の調節を担うタンパク質をコードする。E2領域(E2AおよびE2B)の発現によって、ウイルスDNA複製のためのタンパク質の合成が生じる。大多数のウイルスキャプシドタンパク質を含む後期遺伝子の生成物は、主要後期プロモーター(MLP)によって放出される単一の初期転写産物の重大なプロセシング後にしか発現されない。該MLP(16.8m.u.に位置する)は感染の後期に特に効率的であり、このプロモーターから放出されるすべてのmRNAは5’の3成分リーダー(TPL)配列を有し、その配列はそれらを翻訳に好ましいmRNAにする。現行の系では、シャトルベクターおよびプロウイルスベクター間の相同組換えの結果、組換えアデノウイルスを作成する。2つのプロウイルスベクター間で起こりうる組換えのために、このプロセスから野生型アデノウイルスが生じる可能性がある。したがって、個々のプラークから単一クローンのウイルスを単離し、そのゲノム構造を検査することが重要である。