vesicles)(多重膜小胞(MLV)とも称される)を形成するリン脂質から形成される。MLVは一般的には25nm〜4μmの直径を有する。MLVを超音波処理すると、200〜500Åの範囲の直径で、コア中に水性溶液を含有する小さい単層の小胞(SUV)が形成される。【0204】リポソームは細胞膜と類似点を有し、ペプチド組成物の担体として本発明に関連した使用が意図される。それらは、水溶性および脂溶性の両物質を、すなわち、それぞれ水性間隙中および二重層自体の中にトラップできるために、広く適している。薬物保持リポソームを、リポソーム製剤を選択的に改変することによって活性物質の部位特異的送達に使用することさえ可能である。1988)の教示内容に加えて、以下の情報をリポソーム製剤の作成に利用してよい。リン脂質は、水に分散させると、水に対する脂質のモル比に応じてリポソーム以外の種々の構造を形成しうる。低い割合で、リポソームは好ましい構造になる。リポソームの物理的特性は、pH、イオン強度および2価カチオンの存在に依存する。リポソームは、イオン性および極性物質に対して低い透過性を示しうるが、高い温度では、それらの透過性を顕著に変化させる相転移を受ける。該相転移には、ゲル状態として知られる密接に充填された秩序構造から、液体状態として知られる緩く充填された低秩序構造への変化が関与する。これは特徴的な相転移温度で生じ、その結果、イオン、糖および薬物に対する透過性が増加する。温度に加えて、タンパク質への曝露によりリポソームの透過性が変化しうる。特定の可溶性タンパク質、例えばシトクロムcは、二重層に結合し、それを変形させ、それを貫通することによって、透過性の変化を生じさせる。コレステロールは、おそらくリン脂質をより密接にパッキングすることによってこのタンパク質の貫通を阻害する。抗生物質およびインヒビター送達のための最も有用なリポソーム構成はコレステロールを含有することが想定される。溶質をトラップする能力は、異なるタイプのリポソーム間で様々である。溶質のトラップ時にMLVは中程度に効率的であるが、SUVは非常に非効率的である。SUVはサイズ分布の均質性および再現性の利点を提供し、大きい単層の小胞(LUV)によってサイズおよびトラップ効率の間の妥協点が提供される。これらはエーテル蒸発によって調製され、溶質トラップ時にMLVより3〜4倍効率的である。【0208】リポソーム特性に加えて、化合物のトラップに関する重要な決定要因は該化合物自体の物理化学的特性である。極性化合物は水性間隙中にトラップされ、無極性化合物は小胞の脂質二重層に結合する。極性化合物は、浸透によって、あるいは二重層が崩壊した時に、放出されるが、無極性化合物は、温度またはリポタンパク質への曝露によってそれが崩壊しない限り、二重層に付属したままである。両タイプは相転移温度で最大流出率を示す。membranes)へのリポソーム脂質の移入またはその逆に基づく機構。どの機構が作動するかを決定することは困難であることがよくあり、2以上の機構が同時に作動するかもしれない。静脈内に注射されたリポソームの末路および傾向は、それらの物性、例えばサイズ、流動性、および表面電荷に依存する。それらは、その組成、および血液中での分〜数時間の範囲の半減期に依存して、数時間または数日間、組織中に残存するかもしれない。大きいリポソーム、例えばMLVおよびLUVは、細網内皮系の食細胞によって急速に摂取されるが、循環系の生理学はほとんどの部位でそのような大きい分子種が外に出ることを抑制する。それらは、毛細血管内皮中の大きな開口部または細孔が存在する場所、例えば肝臓または脾臓のシヌソイドでしか外に出ることができない。SUVはより広い組織分布を示すが、依然として肝臓および脾臓に高度に隔離される。vivo挙動により、リポソームの潜在的ターゲティングは、大きいサイズのリポソームがアクセスできる器官および組織のみに制限される。リンパ器官が含まれる。【0211】ターゲティングは、概して、本発明に関する制約ではない。万一、特異的ターゲティングが所望であれば、それを達成するための方法が利用可能である。)を認識部位として使用してもよい。それは、それらがリポソームを特定の細胞タイプに向ける潜在能力を有する場合である。ほとんどの場合、リポソーム調製物の静脈内注射を使用することが想定されるが、他の投与経路も考えられる。【0212】あるいは、本発明は、本発明の組成物の製薬上許容されるナノカプセル製剤を提供する。vivoで分解可能なポリマーを使用してそのような超微粒子(約0.1μmのサイズ)を設計すべきであろう。本発明での使用には、これらの必要条件を満たす生分解性ポリアルキル−シアノアクリラートナノ粒子が想定される。1995および米国特許第5,145,684号(該文献は参照によりその全体が本明細書中に具体的に組み入れられる))。【0213】ワクチン本発明の特定の好ましい実施形態では、ワクチンを提供する。該ワクチンは、一般的に、1以上の上記のような医薬組成物を、免疫賦活剤と組み合わせて含む。免疫賦活剤は、外因性抗原に対する免疫応答(抗体および/または細胞媒介性)を高めるか、あるいは増強する任意の物質であってよい。米国特許第4,235,877号を参照のこと)が含まれる。(1995)に記載されている。本発明の範囲内の医薬組成物およびワクチンは、他の化合物を含有してもよく、該化合物は生物活性または不活性であってよい。1以上の、他の腫瘍抗原の免疫原性部分を、該組成物またはワクチン内で、融合ポリペプチドに組み入れるか、あるいは分離した化合物として存在させてよい。situで生成されるようにしてよい。ウイルス発現系が含まれる。(1998)、およびその引用文献に記載の技術がある。適切な核酸発現系は、患者での発現に必要なDNA配列(例えば好適なプロモーターおよび終結シグナル)を含有する。15635459を参照のこと)。好ましい実施形態では、ウイルス発現系(例えばワクシニアまたは他のポックスウイルス、レトロウイルス、またはアデノウイルス)を使用して該DNAを導入してよく、それには、非病原性(欠損)複製可能ウイルスの使用が関与してよい。そのような発現系にDNAを組み入れるための技術は当業者に周知である。(1993)に概説されている。裸のDNAの取り込みは、該DNAを生分解性ビーズ上にコーティングすることによって高めてよく、該ビーズは細胞内に効率的に輸送される。ワクチンはポリヌクレオチドおよびポリペプチドの両成分を含んでよいことが明らかである。そのようなワクチンは向上した免疫応答を提供するかもしれない。【0215】ワクチンは、本明細書中で提供されるポリヌクレオチドおよびポリペプチドの製薬上許容される塩を含有してよいことが明らかである。そのような塩は、製薬上許容される無毒の塩基、例えば有機塩基(例えば第1級、第2級および第3級アミンおよび塩基性アミノ酸の塩)および無機塩基(例えばナトリウム、カリウム、リチウム、アンモニウム、カルシウムおよびマグネシウム塩)から調製してよい。本発明のワクチン組成物中では当業者に公知の任意の適切な担体を使用してよいが、担体のタイプは投与様式に応じて様々である。筋肉内投与のために製剤化してよい。アルコール、脂肪、ワックスまたはバッファーを含む。経口投与では、上記担体のいずれかまたは固形担体、例えばマンニトール、ラクトース、デンプン、ステアリン酸マグネシウム、サッカリンナトリウム、滑石、セルロース、グルコース、ショ糖、および炭酸マグネシウムを使用してよい。本発明の医薬組成物用の担体として、生分解性ミクロスフェア(例えばポリラクタートポリグリコラート)を使用してもよい。好適な生分解性ミクロスフェアは、例えば米国特許第4,897,268号;同第5,075,109号;同第5,928,647号;同第5,811,128号;同第5,820,883号;同第5,853,763号;同第5,814,344号および同第5,942,252号で開示されている。米国特許第5,928,647号に記載の微粒子−タンパク質複合体を含む担体を使用してもよく、該複合体は宿主においてクラスI限定の細胞障害性Tリンパ球応答を誘発可能である。/または保存剤を含んでもよい。本発明の組成物は凍結乾燥物(lyophilizate)として製剤化してよい。周知のテクノロジーを使用してリポソーム内に化合物を封入してもよい。本発明のワクチン中で任意の種々の免疫賦活剤を使用してよい。アジュバントを含ませてよい。pertussisまたはマイコバクテリア属の種またはマイコバクテリウム由来タンパク質を含有する。vaccae(「pVac」)を使用することができる。Aとして市販されている。サイトカイン、例えばGM−CSFまたはインターロイキン−2、−7、または−12をアジュバントとして使用してもよい。本明細書中で提供されるワクチンでは、該アジュバント組成物は、好ましくは、主にTh1タイプの免疫応答を誘発するように設計される。高レベルのTh1タイプサイトカイン(例えばIFN−γ、TNFα、IL−2およびIL−12)は、投与された抗原に対する細胞性免疫応答の誘発に好都合である傾向がある。対照的に、高レベルのTh2タイプサイトカイン(例えばIL−4、IL−5、IL−6およびIL−10)は体液性免疫応答の誘発に好都合である傾向がある。本明細書中で提供されるワクチンの適用後、患者は、Th1−およびTh2−タイプ応答を含む免疫応答を支持する。応答が主にTh1タイプである好ましい実施形態では、Th1タイプサイトカインのレベルがTh2タイプサイトカインのレベルより高い程度にまで増加する。これらのサイトカインのレベルは、標準的アッセイを使用して容易に評価してよい。2001を参照のこと。GB2122204B;GB2220211;およびUS4,912,094を参照のこと)。好ましい形式の3D−MPLは、直径0.2mm未満の小さい粒子サイズを有するエマルジョンの形式であり、その製造方法はWO94/21292に開示されている。モノホスホリル脂質Aおよび界面活性剤を含む水性製剤はWO98/43670に記載されている。例示的な好ましいアジュバントには、AS01B(リポソーム製剤中のMPLおよびQS21)、リポソーム製剤中の3D−MPLおよびQS21、AS02A(MPLおよびQS21および水中油型エマルジョン)、3D−MPLおよびQS21および水中油型エマルジョン、およびAS15(GlaxoSmithKlineから入手可能)が含まれる。WAから入手可能である(米国特許第4,436,727号;同第4,877,611号;同第4,866,034号および同第4,912,094号を参照のこと)。【0221】CpG含有オリゴヌクレオチド(該オリゴヌクレオチドではCpGジヌクレオチドがメチル化されていない)もまた、主にTh1応答を誘発する。CpGとは、DNA中に存在するシトシン−グアノシンジヌクレオチドモチーフの略語である。そのようなオリゴヌクレオチドは周知であり、例えばWO96/02555、WO99/33488および米国特許第6,008,200号および同第5,856,462号に記載されている。(1996)に記載されている。161(9):4463-6)。MA)であり、それは単独で、あるいは他のアジュバントと組み合わせて使用してよい。強化された系には、モノホスホリル脂質Aおよびサポニン誘導体の組み合わせ、例えばWO94/00153に記載のQS21および3D−MPLの組み合わせ、またはWO96/33739に記載のQS21がコレステロールでクエンチされる低反応原性組成物が含まれる。他の好ましい製剤には、水中油型エマルジョンおよびトコフェロールが含まれる。水中油型エマルジョン中にQS21、3D−MPLおよびトコフェロールを含む特に強力なアジュバント製剤がWO95/17210に記載されている。279B1に記載)が含まれる。MT)および他のアミノアルキルグルコサミニド4−ホスファート(AGP)、例えば係属中の米国特許出願第08/853,826号および同第09/074,720号(その開示内容は参照によりその全体が本明細書中に組み入れられる)に記載のものが含まれる。【0224】アジュバントの別の例には、合成MPLおよび志賀毒素Bサブユニットベースのアジュバントが含まれる(WO2005/112991を参照のこと)。本明細書中で提供される任意のワクチンは、抗原、免疫応答エンハンサーおよび好適な担体または賦形剤の組み合わせに結実する周知の方法を使用して調製してよい。本明細書中に記載の組成物は、徐放性製剤(すなわち、投与後に化合物の持続放出を生じさせる製剤、例えばカプセル、スポンジまたはゲル(例えば多糖から構成される))の部分として投与してよい。(1996)を参照のこと)、例えば経口、経直腸または皮下移植によって、あるいは所望の標的部位での移植によって投与してよい。membrane)によって包囲されているリザーバ内に含有されていてよい。【0226】そのような製剤内で使用するための担体は生体適合性であり、生分解性であってもよく;好ましくは該製剤は比較的一定レベルの活性成分放出を提供する。そのような担体には、ポリ(ラクチドコグリコリド)、ポリアクリラート、ラテックス、デンプン、セルロース、デキストラン等の微粒子が含まれる。biovectors)が含まれる(例えば米国特許第5,151,254号およびPCT出願WO94/20078、WO94/23701およびWO96/06638を参照のこと)。徐放性製剤内に含有される活性化合物の量は、移植部位、放出の速度および予測される持続時間および治療または予防対象の症状の性質に依存する。送達ビヒクルには、抗原提示細胞(APC)、例えば樹状細胞、マクロファージ、B細胞、単球および、遺伝子操作によって有効なAPCにしてよい他の細胞が含まれる。そのような細胞は、その必要はないが、遺伝子改変して、抗原を提示する能力を高め、T細胞応答の活性化および/または維持を改善し、それ自体で抗腫瘍効果を有するようにし、ならびに/あるいは、受け手と免疫適合性(すなわち適合型HLAハプロタイプ)にしてよい。異種細胞であってよい。本発明の特定の好ましい実施形態では、樹状細胞またはその前駆体を抗原提示細胞として使用する。(1999)を参照のこと)。vitroで可視の顕著な細胞質の突起(樹状突起)を有する)、高い効率で抗原を取り込み、プロセシングし、提示するその能力、およびナイーブT細胞応答を活性化するその能力に基づいて特定してよい。リガンドを発現するように遺伝子操作してよく、そのような改変樹状細胞は本発明によって想定される。(1998)を参照のこと)。任意の他の好適な組織もしくは液体から取得してよい。vivoで樹状細胞を分化させてよい。GM−CSF、IL−3、TNFα、CD40リガンド、LPS、flt3リガンドおよび/または、樹状細胞の分化、成熟および増殖を誘発する他の化合物(群)の組み合わせを培養培地に加えることによって、末梢血、臍帯血または骨髄から収集されたCD34陽性細胞を樹状細胞に分化させてよい。樹状細胞は、好都合には、「未成熟」および「成熟」細胞として分類され、それにより、2種の十分に特徴付けられている表現型を識別する単純な様式が提供される。この命名法は、すべての起こりうる、分化の中間段階を排除すると解釈されるべきではない。未成熟樹状細胞は、抗原の取り込みおよびプロセシングの高い能力を有するAPCとして特徴付けられ、それはFcγ受容体およびマンノース受容体の高い発現と相関している。MHC、接着分子(例えばCD54およびCD11)および共刺激分子(例えばCD40、CD80、CD86および4−1BB)の高い発現によって特徴付けられる。一般に、タンパク質(またはその一部分もしくは他の変異体)をコードするポリヌクレオチドでAPCをトランスフェクトして、該ポリペプチド、またはその免疫原性部分が細胞表面上に発現されるようにしてよい。vivoで行ってよく、そして、本明細書中で記載されるように、該トランスフェクト済み細胞を含む組成物またはワクチンを治療目的で使用してよい。(1997)に記載の遺伝子銃アプローチを使用して実施してよい。樹状細胞の抗原積載は、樹状細胞または前駆細胞を、ポリペプチド、DNA(裸のDNAまたはプラスミドベクター内のDNA)もしくはRNA;または抗原を発現する組換え細菌またはウイルス(例えばワクシニア、鶏痘、アデノウイルスまたはレンチウイルスベクター)とインキュベートすることによって達成してよい。積載前に、該ポリペプチドを免疫学的パートナーに共有結合によってコンジュゲートして、T細胞支援(例えば担体分子)を提供してよい。非コンジュゲート型の免疫学的パートナーを、別途、あるいは該ポリペプチドの存在下で樹状細胞にパルスしてよい。えば密封アンプルまたはバイアル中で提供してよい。好ましくは、使用時まで該製剤の無菌性を保つために該容器を密封する。一般に、製剤は、油性または水性ビヒクル中の懸濁液、溶液またはエマルジョンとして保存してよい。ワクチンまたは医薬組成物は凍結乾燥条件で保存してよい。その場合、使用直前に滅菌液状担体を加えることのみが必要とされる。本明細書中で引用されるすべての刊行物および特許出願は、個々の各刊行物または特許出願が参照により組み入れられることが具体的かつ個別に示されているかのように、参照により本明細書中に組み入れられる。前記発明について、理解を明確にするために、説明および例を用いていくらか詳細に説明してきたが、特許請求の範囲の思想または範囲から逸脱することなく、それに対して特定の変更および改変を施してよいことが、本発明の教授内容を踏まえて当業者には直ちに自明である。なく単に説明目的で以下に実施例を挙げる。当業者は、本質的に同様の結果を生じさせるよう変更または改変することができる種々の重要でないパラメータを容易に認識するであろう。Mtb72f(Hisタグなし)(配列番号6)の調製Mtb72f発現ベクターの構築Mtb72fは、2種の結核菌タンパク質Mtb32およびMtb39から形成される融合タンパク質である。Mtb39と、Mtb32のN末端およびC末端部分を、Mtb32のC末端−Mtb39−Mtb32のN末端のように融合させることによって、Mtb72fを構築する。具体的には、Mtb32の約14kDaのC末端断片(残基192−323;132アミノ酸)をコードするオープンリーディングフレーム(ORF)にMtb39の全長ORFを直列に連続して連結し、続いてMtb32の約20kDaのN末端部分(残基1−195)をC末端に連結することによって、Mtb72fタンパク質を作成した。結核菌株H37Rvに由来するゲノムDNAからのポリメラーゼ連鎖反応(PCR)のために、ユニークな制限部位(EcoRIおよびEcoRV)を含有し、C末端の停止コドンを欠いている(Mtb32−CおよびMtb39の場合)配列特異的オリゴヌクレオチドを使用することによって、それを達成した。該プロセスの詳細は以下の通りである。【0237】まず、以下のオリゴヌクレオチドを用いるPCRを使用して、H37RvからMtb32のC末端部分(Mtb32C)をコードするDNAをクローニングした:5’(5’−CAA−TTA−CAT−ATG−CAT−CAC−CAT−CAC−CAT−CAC−ACG−GCC−GCG−TCC−GAT−AAC−TTC−3’)および3’(5’−CTA−ATC−GAA−TCC−GGC−CGG−GGG−TCC−CTC−GGC−CAA−3’)。5’オリゴヌクレオチドは、ATG開始コドンを包含するNdeI制限部位(下線部)を含有した。3’オリゴヌクレオチドはEcoRI制限部位(下線部)を含有した。これらのオリゴヌクレオチドを使用して、Mtb32の396ヌクレオチド部分であるMtb32Cを増幅し、得られた産物を発現ベクターのNdeIおよびEcoRI部位にサブクローニングした。EcoRIおよびEcoRVで消化して、Mtb32Cプラスミドを直線状にした。【0238】Mtb39に関しては、PCR増幅およびクローニングに以下のオリゴヌクレオチドを使用した:5’−(5’−CTA−ATC−GAA−TTC−ATG−GTG−GAT−TTC−GGG−GCG−TTA−3’)および3’(5’−CTA−ATC−GAT−ATC−GCC−GGC−TGC−CGG−AGA−ATG−CGG−3’)。5’オリゴヌクレオチドはEcoRI制限部位(下線部)を含有し、一方、3’オリゴヌクレオチドはEcoRV制限部位(下線部)を含有した。Mtb39の全長コード配列を増幅し、消化し、第1ステップであらかじめ消化されたプラスミドを使用してMtb32cの下流にインフレームでサブクローニングした。【0239】Mtb32のN末端断片の5’および3’オリゴヌクレオチドを以下のように設計した:5’−(5’−CTA−ATC−GAT−ATC−GCC−CCG−CCG−GCC−TTG−TCG−CAG−GAC−3’)および3’(5’−CTA−ATC−GAT−ATC−cta−GGA−CGC−GGC−CGT−GTT−CAT−AC−3’)。両セットのオリゴヌクレオチドはEcoRV制限部位(下線部)を含有し、一方、3’オリゴヌクレオチドは停止コドン(小文字)をさらに含んだ。このタンパク質の予測されるN末端ドメインをコードするMtb32の585bp部分を増幅するように該オリゴヌクレオチドを設計した。得られたPCR産物をMtb32c−Mtb39融合プラスミドにサブクローニングした。適正な挿入方向および突然変異の不存在をDNAシークエンシングによって確認した。Bankを作成するために使用される最終構築物では、6×His親和性タグをPCRによって除去し、Mtb72fのオープンリーディングフレーム(ORF)を、pET由来の発現ベクターであるpPDMにサブクローニングした。該ORFは約72kDaのポリタンパク質(Mtb72f)をコードし、直列順序:Mtb32C−Mtb39−Mtb32Nで構成されたドメインを有する。pLysS株に形質転換し、試験、細胞バンク作成、および製造に使用した。Hydroxyapatite(CHT)クロマトグラフィー、ダイアフィルトレーション(diafilitration)、および滅菌ろ過による精製バルク原体の取得。発酵は10Lの作業容量で実施する。37°Cで一晩培養された作業用種細胞の300mLの振とうフラスコ培養を発酵槽に接種する。medium)を使用する。培地の組成は以下の表に示される通りである。すべての培地成分を121°Cで20分間加熱するか、あるいは滅菌ろ過によって滅菌する。発酵中、発酵槽を37°Cの温度で維持する。5標準リットル/分(SLPM)の割合で空気を混入する。酸(H2SO4)または塩基(NaOH)の自動添加によって培地のpHを7.0で維持する。200rpmの最小撹拌を維持しつつ撹拌を自動調節することによって、溶存酸素を30%に制御するように発酵槽をプログラムする。Corp.)の自動添加によって発酵槽内の発泡抑制を達成する。細胞密度が約3.5の光学濃度(600nm)に達したら、イソプロピル−β−D−チオガラクトピラノシド(IPTG)を1.0mMの濃度まで発酵槽に加える。IPTGは、Mtb72fタンパク質をコードする組換え遺伝子の発現を誘導する。bottles)中で遠心分離することによって細胞を収集する。Microfluidizer(登録商標)を使用して細胞を破壊する。細胞は、11,000±1,000psiの圧力で5回、Microfluidizerを通過させる。500mLボトル中で8000×gで懸濁液を遠心分離する。これらの条件下で、Mtb72fタンパク質を含有する封入体(IB)はペレットになり、ほとんどの細胞片は上清中に残る。pH8.0)に再懸濁した後、8,000gで遠心分離する。上清画分を廃棄し、追加の精製に必要とされるまで−70°C〜−80°CでIBペレットを保存する。Bis−trisプロパン、pH7.0(バッファーA)に再懸濁する。再懸濁されたIBを、マグネチックスターラーバーで300rpmで2時間室温で撹拌する。Supor)を通してろ過した後、クロマトグラフィーによって分画する。1L充填床)を含有するカラムにIB抽出物をアプライする。バッファーAで60cm/時間の線流速でカラムを展開し、主に低質量の混入物を含有するフロースルーを参照用に回収する。Bis−trisプロパン、pH7.0を使用してMtb72fのバルクを1ステップで溶出し、吸光度に基づいて単一のバルクピークとして回収する。【0246】QFF樹脂は、精製時に使用される条件下で正に帯電する第4級アミン官能基を有する高度に架橋されたアガロース樹脂である。荷電マトリックスは、種々のアニオンの結合を可能にし、そして該アニオンは、塩勾配を使用して選択的に溶出させることができる。このアニオン交換クロマトグラフィーを使用して、該タンパク質から、樹脂に密接に結合している核酸および内毒素を分離する。該タンパク質は弱く結合し、これらの混入物より前に溶出される。このステップでは、無電荷の混入物および大部分のタンパク質不純物が除去される。63mL充填床)にアプライする。Bis−trisプロパン、pH7.0)で平衡化されている。大部分のMtb72fを含有し、混入物を含まないフロースルー材料(FT1)を回収する。カラムをバッファーCで洗浄し、残ったすべてのUV吸収材料を回収する。最後に、バッファーD(8M尿素、200mMリン酸ナトリウム、pH7.4)中でカラムを溶出させる。【0248】MacroPrep(登録商標)CHTは、球状の、マクロ細孔状のヒドロキシアパタイト[Ca5(PO4)3OH]2である。CHTクロマトグラフィーは、適正な結合条件および溶出条件を見出せば、非常に選択的な精製方法でありうる。結合様式には、荷電カルシウムおよびリン酸イオンとのイオン交換タイプの結合ならびに分子のキレート化が含まれる。DNAはこの樹脂に結合し、個別タンパク質に関する高い選択性を達成することができる。Mtb72fの精製に使用される条件は洗練ステップとして機能し、検出可能な宿主細胞混入物の実質的に完全な除去を可能にする。pH、流速、および室温をモニターし、記録する。初期CHTフロースルー材料(FT1)をさらなる下流の処理に使用する。pH7.5で置き換える。MinimTMシステムを使用して実施する。40)を使用してろ過滅菌する。PETG(ポリエチレンテレフタラートコポリマー)培地ボトル中に分配した後、−70°Cで凍結および保存する。この材料がMtb72f精製済みバルク原体である。Mtb72f(6Hisタグ)(配列番号2)の調製Hisタグを除去するためのpPDMへのサブクローニングのステップを省略することを除き、実施例1の方法にしたがってよい。M72(2Hisタグ)(配列番号4)の調製M72発現ベクターの構築M72抗原の構築用の出発材料は組換えプラスミド6His−Mtb72fmutであった。配列番号1の710位のSerに対するコドンをAlaに対するコドンで置き変えることが含まれた。System」(Invitrogen)を用いて、6His−Mtb72fmut構築物(Corixaプラスミド)上に存在する4個のN末端ヒスチジンの欠失を達成し、予測される2His−Mtb72Fmut構築物を得た。配列確認後、該プラスミドから(酵素による制限処理によって)2His−Mtb72fmutコード配列を切り出し、ゲル精製し、pET29a発現ベクターにライゲーションして、最終的な組換えプラスミドpET29a/2His−Mtb72fmutを得た。配列確認後、その組換えプラスミドに正式名称pRIT15497を付与し、HMS174(DE3)宿主細胞の形質転換に使用した。pRIT15497は、M72と称される725アミノ酸のタンパク質をコードする。【0254】M72タンパク質の生産M72の生産に関しては、発酵培地中にクロラムフェニコールが存在しないことを除き、Mtb72fに関する記載(実施例1を参照のこと)と同一の生産プロセスを使用してよい。不活性/潜伏期の結核菌感染のマウスモデル潜伏性結核菌感染のマウスモデルを確立するために、SWR系統を使用した。282:207-8を参照のこと)。Webster(SWR/J)マウス系統を使用するプロトコルを以下に挙げる。コレステロール(25μg)(WO96/33739)およびモノホスホリル脂質A(MPL)(5μg)を膜中に含有するジオレオイルホスファチジルコリン(100μg)の小型単層小胞(SUV)にQS21(5μg)を加えることによって、2倍強度AS01Bを調製する(米国特許公開第2003/0143240号を参照のこと)。pH6.8)中の4μgのタンパク質を50μlの2倍強度AS01Bと混合することによって、注射用アリコート(50μl)を調製する。各マウスに2回の50μl注射(すなわち8μgのタンパク質)を施した。モデルを確立するための代表的時間軸は図1に模式的に示される通りである。【0257】1日目:50〜100コロニー形成単位(CFU)の結核菌生物体をエアロゾルによって感染させる30〜90日目:飲料水1リットルあたり50mgリファンピン/85mgイソニアジドで一部のマウスを処置する61日目:ワクチン候補5を施されたすべてのマウスをrMtb72f+AS01Bで免疫化しなければならない82日目:ワクチン候補を施されたすべてのマウスをrMtb72f+AS01Bで免疫化しなければならない103日目:ワクチン候補を施されたすべてのマウスをrMtb72f+AS01Bで免疫化しなければならない113日目:IgGアッセイのために採血する諸時点:CFUの数え上げおよび免疫原性のために脾臓および肺を採取する。【0258】バリエーション1→60日間の化学療法での処置。30日目に開始→3、4、5か月間の休止→各時点で2マウスのCFUおよび4〜7マウスを生存研究のために残す。【0259】バリエーション2→90日間の化学療法での処置。30日目に開始→4、5か月間の休止→各時点で2マウスのCFUおよび7マウスを生存研究のために残す。【0260】バリエーション3→4、5、6か月間の休止→各時点で2マウスのCFUおよび4マウスを生存研究のために残す。【0261】バリエーション4→60日間の化学療法での処置。30日目に開始→60日目に開始される筋肉内(i.m.)r72F+AS01Bでの3回の免疫化→3、4、5か月間の休止→各時点で2マウスのCFUおよび4〜7マウスを生存研究のために残す。【0262】バリエーション5→90日間の化学療法での処置。30日目に開始→60日目に開始されるr72F+AS01B(i.m.)での3回の免疫化→4、5か月間の休止→各時点で2マウスのCFUおよび4〜7マウスを生存研究のために残す。【0263】ELISAプレートをコーティングするためにrMtb72fを使用する感染後の抗体応答の分析では、化学療法およびMtb72f+AS01B免疫化の組み合わせを施された群が、無処置または化学療法処置のみを施されたマウス(0.5未満のOD)より高い抗体応答(2.0までのOD)を有することが示された(図2)。Mtb72fで免疫化されたマウスは、60日間の化学療法を施されたか90日間の化学療法を施されたかにかかわらず、かなりのMtb72f特異的抗体応答(1.5〜2.5の範囲のOD)に達した(図3)。【0264】マウスに結核菌を感染させた後、種々の間隔でマウスから脾臓細胞を収集した。vitroで組換え抗原で再刺激し、IFN−γ分泌を測定した。これらの細胞によって産生されるIFN−γレベルは、Mtb39を除き、60日目の群1(無処置)および群2(化学療法のみ)では一様に無視できた。conA、PPDおよびBCG溶解物での陽性対照刺激では、細胞が他の刺激分子に応答してIFN−γを合成および分泌可能であることが実証された(図4)。IFN−γレベルは、Mtb72f+AS01Bを施された群で高かったが、Mtb72f+AS01Bで免疫化されなかった群では、化学療法が施されたかどうかにかかわらず、それらは低いか、あるいは無視できた(図5)。結核感染および以後の処置経過中に、特異的T細胞が応答する。IFN−γに対する細胞内サイトカイン染色を使用して、Mtb72Fに対する特異的CD4+細胞応答のパーセンテージを測定した(図6)。T細胞応答は変化しないようであった(図7)。応答の傾向は、化学療法中の期間の長さに伴って増加するように見えた(図7)。発明者らの実験の結果は、SWRマウスが結核菌の感染に対して感受性であることを実証する。無処置のままにすると、Mtb感染後115日目までにSWRマウスは死にいたる(図8および図9)。60日間の併用化学療法を施されたマウスの平均生存期間は170日間であった(図8および図9)。60日間の併用化学療法およびMtb72f/AS01Bでの3回の免疫化を施されたマウスの平均生存期間は215日であった(図8および図9)。化学療法を施されたマウスの群に関する生存率は、化学療法およびMtb72f/AS01Bワクチンを施された群と有意に異なる(95%信頼区間(p=0.0067))。前記哺乳動物が結核菌の活発な感染を有している、請求項1に記載の方法。前記哺乳動物が結核菌の潜伏感染を有している、請求項1に記載の方法。前記哺乳動物が結核菌の多剤耐性株に感染している、請求項1に記載の方法。前記哺乳動物が以前にカルメット・ゲラン桿菌(BCG)を用いて免疫化されている、請求項1に記載の方法。tuberculosis)に由来するものである、請求項1に記載の方法。【請求項7】Mtb72fが配列番号2の残基8−729を含むポリペプチドである、請求項1に記載の方法。【請求項8】Mtb72fが配列番号2の残基1および8−729からなり、開始Met残基の後にHisタグが挿入されていてもよい、請求項7に記載の方法。【請求項9】Mtb72fが配列番号2に示されるポリペプチドである、請求項7に記載の方法。【請求項10】Mtb72fが配列番号6に示されるポリペプチドである、請求項7に記載の方法。【請求項11】Mtb72fが配列番号4の残基4−725を含むポリペプチドである、請求項1に記載の方法。【請求項12】Mtb72fが配列番号4の残基1および4−725からなり、開始Met残基の後にHisタグが挿入されていてもよい、請求項11に記載の方法。【請求項13】Mtb72fが配列番号4に示されるポリペプチドである、請求項11に記載の方法。前記哺乳動物がヒトである、請求項1に記載の方法。前記アジュバントが、リポソーム製剤中の3D−MPLおよびQS21ならびに水中油型エマルジョン中の3D−MPLおよびQS21からなる群より選択される、請求項1に記載の方法。結核菌感染の治療に有効な1以上の化学治療剤の投与をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記1以上の化学治療剤がイソニアジドおよびリファンピンより選択される、請求項16に記載の方法。前記哺乳動物が、まず一定期間にわたって1以上の化学療法剤を投与され、次に請求項1に記載の医薬組成物を投与される、請求項16に記載の方法。前記哺乳動物が、まず請求項1に記載の医薬組成物を投与され、次に一定期間にわたって1以上の化学療法剤を投与される、請求項16に記載の方法。【請求項20】1以上の化学療法剤の投与と、請求項1に記載の医薬組成物の投与とを同時に開始する、請求項16に記載の方法。続いて1回以上、請求項1に記載の医薬組成物を投与するステップをさらに含む、請求項1に記載の方法。初回免疫と、続いて結核菌群のマイコバクテリウム属の種に由来するMtb72f融合タンパク質またはその免疫原性断片をコードする核酸を投与することによる追加免疫とを含む方法をさらに含む、請求項1に記載の方法。前記核酸が配列番号1である、請求項23に記載の方法。前記核酸が配列番号1のヌクレオチド63−2222を含む、請求項23に記載の方法。前記核酸が配列番号3である、請求項23に記載の方法。前記核酸が配列番号3のヌクレオチド10−2175を含む、請求項23に記載の方法。前記核酸をアデノウイルスベクター中で送達する、請求項23に記載の方法。前記核酸を、突然変異体マイコバクテリウム属またはバシラス属宿主細胞ベクター中で送達する、請求項23に記載の方法。初回免疫と、続いて結核菌群のマイコバクテリウム属の種に由来するMtb72f融合タンパク質またはその免疫原性断片を投与することによる追加免疫とを含む方法をさらに含む、請求項23に記載の方法。tuberculosis)感染に対する化学療法の期間を短縮するための方法であって、既に結核菌に感染している哺乳動物に、結核菌感染に対して有効な1以上の化学療法剤と、結核菌群のマイコバクテリウム属の種に由来するMtb72f融合タンパク質またはその免疫原性断片およびアジュバントを含んでなる免疫学的に有効な量の医薬組成物を投与するステップを含み、該Mtb72f融合タンパク質が結核菌に対する免疫応答を誘導し、それにより結核菌感染に対する化学療法の期間を短縮することが可能になるものである、上記方法。ekouhou.net。