2019/12/25TwitterFacebookGoogle+はてブImageJは無料の画像処理ソフトです。マックでもウインドウズでもリナックスのOSでも使えて、研究で必要な画像処理が比較的簡単にできるので、バイオ研究者の間で非常によく使われています。Jを使うのが一番手軽で便利な方法だと思います。Jよりもさらに高機能なFijiを自分は使っています。ImageJ)、プラグインが最初からたくさんくっついてくるだけです。Jは様々なデータ処理・データ解析のためにプラグインを入れることができますが、Fijiには最初からこれらのプラグインがてんこ盛りで入っていますので、いちいち後からインストールする手間がなくて良いです。顕微鏡メーカーやカメラメーカー独特の画像フォーマットでも、大抵の画像ファイルがFijiで開けてしまいます(Bio-Formatsを利用するなどして)。ダウンロードできます。ダウンロードできます。Jのインストール方法インストール方法は、ダウンロード後の指示に従って行ってください。Jの使い方アイデア次第でいろいろな画像処理がImageJでできますが、自分がよくやる画像処理をいくつか紹介します。元画像としてカラヤンの画像をウィキペディアから拝借。Threshold...を選びます。2つのスライダーを調節して、望む画像になるような閾値を探して決めましょう。今の場合、76-255としました。Applyボタンをクリックして適用します。ImageJを使って細胞の数を数える方法サンプルとしてこの血球の画像をお借りします。この画像を使って、ImageJでカラー画像を白黒にし、2値化して、粒子解析の機能を利用して、細胞の数を数えてみます。Open...として、ダウンロードしておいた目的の画像ファイルを開きます。8-bitと順に選びます。これで白黒画像に変更されました。Threshold...を選びます。2つのスライダーを調節して、全ての細胞が分離できそうな閾値を探して決めましょう。今の場合、183-255としました。Applyボタンをクリックして適用します。機能を使って、数を数えましょう。することにより選択できます。パネルの中のAreaにチェックが入った状態にします。他は今はとりあえず不要です。ここで、写真の中の赤血球のだいたいの面積を知っておきましょう。メニュー上にあるROIの形(四角形や丸や不定形など)から丸(Oval)を選び、赤血球の一つがちょうど同じ大きさになるように合わせます。Measureと選ぶと、Resultsという名のウインドウ上に(みあたらなければ、メニューからWindow,Resultsと選ぶと、最前面に表示されます)Areaが表示されます。今の場合420という数値になりました。カーソルを細胞の上にあてると画素の値が出ますが、今やってみると、黒く表示されている赤血球の画素の値が0で、白いbackグランウンドの値が255でした。Invertを選び白黒を反転させます。Particles...を選びます。粒子としてカウントするサイズをここで選ぶことができます。ここで粒子の面積のサイズが取りそうな範囲を適切に設定してやれば、画面上のノイズや目的外のものを除外できる可能性があります。Circularityは全範囲にしておきます。明らかに丸っこいものしかないというのであれば、ここで強い条件(1に近い範囲)を設定してやれば、不定形のごみを区別して除くこともできます。holesにチェックを入れておきます。holesというのは、赤血球の丸い形の真ん中が2値画像にしたときに抜けていても、その穴は埋めた状態として(つまり穴に見える部分の画素も細胞に属する画素として)考えてくれるということです。あと、Show:Masksを選んでおきます。粒子解析を実行した結果、マスク画像として以下が得られました。ここには、粒子としてカウントされたものが表示されています。たしかに「穴」も埋められていることがわかります。Size(粒子の面積の平均)が419.211となりました。赤血球の数がおよそ573個あって、それらの面積の平均は419画素だったというわけです。ちなみに、もとのカラー写真をみると白血球みたいなものも一つありましたが、この画像処理ではそれは無視されて赤血球と区別がつかなくなっているため、カウントされています。8-bitと選び、まず白黒画像にします。Threshold...で2値化します。スライダーをうごかして、できるだけ細胞がはっきり見えるように調整しました。Invertで白黒を反転させます。Holesで細胞の真ん中部分の「穴」を埋めます。完全ではありませんが。これくらいなら、手作業で不完全に残った「穴」の開いた細胞を埋めてもいいかもしれません。より、無理やり分離させてみます。Watershed完全とはいいがたいですが、大半に関してくっついていた細胞が分離できています。Analysisを適用すれば、細胞数が数えられるでしょう。*2つの粒子がくっついている場合にウォーターシェッドというアルゴリズムを用いて分離する機能もImageJにはあるようです。Watershedの機能も用いて細胞を分離して、細胞数をカウントする方法を示したYOUTUBE動画があったので紹介しておきます。Jを用いて蛍光標識された多数の物体の面積を求める方法たまたま検索でヒットした論文の図をお借りして、調べたい構造の面積をImageJを使って求めてみます。Fig.1Dに蛍光画像があるのでそれを出発材料にします。8-bitと選びます。蛍光標識された細胞内の構造物の大きさ(画像上の面積)の絶対的な数値を求めるのは困難でしょう。閾値の設定しだいでいくらでも面積が変わってきてしまいます(標識された部分と標識されていない部分の輝度に十分の差があればそこで区切れますが)。この3枚の写真が同じ撮影条件だったとして、一つの閾値を3枚に適用することにして、一番もっともらしいと主観で判断した閾値にしてみます。してスライダーで適当な値を選びました。これでおのおのの「粒子」の面積を計算してみます。写真にラベルがあって邪魔なのでその部分は除いて計算します。そのためには解析したい範囲だけ四角いROIを設定します。Measurements...でまず計算したいパラメータとしてAreaにチェックを入れて他は今は不要なので外しておきます。holesにはチェックをいれておきます。これでOKをクリックすれば、計算が行われます。ROIを次の写真に移動させて同様に計算していきましょう。Size:92.526となりました。As...で保存しておきます。Size:165.491となりました。同様に、結果を保存します。Size:144.337となりました。これも結果を保存します。この論文で具体的に蛍光写真からどうやって面積を計算したのかは読んでいないのでわかりませんが、まあだいたいの傾向は論文のグラフと合っているのでよしとしましょう。実験群と対照群に関して、何かの遺伝子発現の変化を、GFPリポーターを発現する細胞の蛍光写真で見比べて定量しようという実験がありがちだと思います。このような定量に関しては、蛍光写真撮影時に蛍光強度が飽和しないようなカメラの露光条件だったか(サンプルの蛍光強度と画像上の画素数が本当に比例するのか?ある明るさ以上は飽和してしまっていないか)、実験群と対照群の撮影条件は同一だったのか等のCRITICALなポイントが前提として存在します。いったことがいい加減だと、ImageJで定量したつもりになっても、正しいデータ処理をしたことにはなりません。結果的に間違った結論を出す恐れがありますので注意が必要です。スナップショット付きの説明なのでわかりやすい。自分はスケールの写真を、サンプルを撮影したのと同じ条件(倍率)で撮影しておき、あとから画像の中の目盛りを長さを測るツールではかって算出しています。その長さの長方形を画像に張り付けています(ROIをつくってカットするとバックグラウンドが白なら白く抜けるのでそれがスケールバーになる)。ピクセルと長さ(ミクロンなど)の関係をもとにスケールバーをつける機能がImageJに用意されています。Scale...を選びます。micronとします。pixels/micronと表示されますので、OKをクリックします。選びOKをクリックします。すると画面右下に20ミクロンのスケールバーが表示されます。micronsとしていた単位は、写真に埋められたスケールバーにはギリシャ文字でμmと表示されました。プレゼンテーションのスライド用なら数字と単位があったほうが便利でしょうから、これは便利な機能だと思います。Overlayがチェックされていなければスケールバーの長さを変更するとリアルタイムで反映されます。これでよしとなったら、Overlayにチェックを入れればよいでしょう。数字や単位を表示しないオプションは見当たりませんでした。Jでマクロを使うことの勧め研究においては大量の画像に対して同じ処理を適用するという作業が頻発することがあります。そのとき、ひとつひとつの画像に関して全て手作業で行うのはとても骨が折れますが、マクロを書いて一気に処理してしまうと楽ちんです。マクロを書くと言っても、ImageJにはマクロレコーダーという便利な機能がありますので、ゼロから自分で書く必要など全くなくて、マクロレコーダーをオンにした状態で自分がやりたい処理を一通りやってみて、マクロレコーダーが吐き出してくれるマクロをちょっと修正すれば良いのです。Record...と選べば、マクロレコーダーが起動します。プログラミングに苦手意識があって、マクロを使ったことがない人は若干敷居が高いと感じるかもしれませんが、一度使ってみればその便利さに驚き、手作業でやることがバカバカしくなること請け合いです。views座長の英語:「次の発表者は~さんです。