Japanese)本発明は、細胞又は細胞内分子のイメージングに用いることができる青色蛍光色を発する糖誘導体及び該誘導体を用いた細胞のイメージング方法を提供することを目的とする。本発明はまた、イメージングによりがん細胞を精度よく検出するための方法、及びその方法に用いるイメージング剤を提供することを目的とする。びに、該誘導体を用いた細胞のイメージング剤及びイメージング方法が提供される。本発明によりまた、前記蛍光分子団を分子内に有するL-グルコース誘導体を用いたがん細胞のイメージング剤及びイメージング方法が提供される。明らかにし、生命科学機構の解明や創薬スクリーニングに繋げようとする分子イメージングが活発に行われている。異常をきたした細胞、例えばがん細胞を可視化してがん細胞やがん部位を検出するための研究も活発に行われている。グルコース(ブドウ糖)を初めとする多くの六炭糖(ヘキソース)、例えば、グルコース、フルクトース、ガラクトース、マンノースは、生物の活動において重要な役割を果たしている。中でもグルコースは、哺乳類から大腸菌・酵母に至るまで細胞の生存維持に最も重要なエネルギー源として知られ、特に脳はグルコースを唯一のエネルギー源としている。グルコースにはD-グルコースとL-グルコースの鏡像異性体が存在するが、このうち生物がエネルギー源として利用できるのはD-グルコースのみであり、生きた細胞はD-グルコースをグルコーストランスポーターなどの細胞膜中の輸送タンパク質を介して選択的に取り込んで利用する仕組みを持つ。自然界にD体が多量に存在し、その光学異性体であるL体が全くあるいはほとんど存在しない六単糖(ヘキソース)としては、その他にD-ガラクトース、D-フルクトース、D-マンノースが挙げられる。豊富に含まれているほか、ヒトの体内でも一日2g程度が産生されている。牛乳の2-8%を占める二糖類ラクトースは、D-ガラクトースとD-グルコースがグリコシド結合したもので、小腸で吸収される際に両者がラクターゼにより分離されて、グルコーストランスポーターの一種であるSGLTを介して体内に吸収されることが知られている。D-ガラクトースが小腸上皮細胞から血管へ運ばれる際にはグルコーストランスポーターGLUT2を通過する。細胞内に取り込まれたガラクトースは、1位にリン酸化を受けた後、解糖系に入りエネルギーとして利用され、あるいは糖脂質や糖タンパクの生合成に利用される。L-ガラクトースは、霊長類が生合成できない抗酸化物質ビタミンC(L-アスコルビン酸)が、植物内においてD-グルコースから生合成される際の経路の一つSmirnoff-Wheeler経路の中間代謝産物としての記載があるが、一般に生物学に登場することがまれな希少糖である。D-ガラクトースを18Fで標識した2-deoxy-2[18F]fluoro-D-galactoseは、肝臓の代謝解析への適用例がある(非特許文献1)。2-deoxy-2[18F]fluoro-D-galactoseは、がんにおけるガラクトース代謝イメージングへの利用可能性が報告されたが一般化していない(非特許文献2)。D-フルクトースは果糖とも呼ばれ、ベリー類やメロン他の果実類、ある種の根菜に多量に含まれるほか、体内でも産生される。摂取したD-フルクトースは、小腸上皮にあるグルコーストランスポーターGLUT5を介して上皮細胞内に取り込まれた後、主にGLUT2を介して血液中に入る。そのうち肝臓細胞内に入ったフルクトースはフルクトキナーゼによるリン酸化を受け、脂肪酸合成やエネルギー産生に使用されるほか、D-グルコースへも転換される。発現することから、これらの領域でもそれぞれ重要な機能を有していると考えられ、例えば精子活動時のエネルギー源としても使用される。食品甘味料として広く流通しているコーンシロップには、コストが安く、特に低温で甘味が強いD-フルクトースの含量を高めたものが清涼飲料水などで多量に使用されており、D-フルクトースの過剰摂取による脳の神経活動への悪影響や、肥満、がんの誘因として危険視されている。L-フルクトースは食べるとある程度エネルギーとして利用可能との報告があるが、腸内細菌により変換されるためとの推定もある。放射性標識体として1-deoxy-1-[18F]fluoro-D-fructoseが合成され、腫瘍への中程度の取り込みが報告されたが、本分子は細胞内で代謝を受けないとみられ、利用されていない。最近では細胞内代謝を受ける6-deoxy-6-[18F]fluoro-D-fructoseが合成され、乳がんにおけるGLUT5を介した取り込みを標的とするPETトレーサー候補として報告されている(非特許文献3)。D-マンノースは、果実や果皮などに含まれる。マンノースを主成分とする多糖はマンナンと呼ばれ、植物、酵母、バクテリアがもつ。こんにゃくはマンノースとグルコースからなるグルコマンナンを主成分としている。D-マンノースはヒトでは経口摂取すると通常ほとんどが尿中に排泄されるとされるが、ヒトの生体内での取り込み様式については不明の点が多い。細胞内に入るとリン酸化された後、解糖系の中間体であるフルクトース-6-リン酸に変換される。D-マンノースが特異的に結合するマンノース受容体は、炎症時に増加する高マンノース糖タンパクの除去に役立つ。日和見感染症の一種でエイズ患者の死因第一位を占めるカリニ肺炎の原因菌P.cariniの膜表面には高マンノース糖鎖部分があり、肺胞のマクロファージに発現するマンノース受容体がこれを認識して、マクロファージの移動を促進する。D-マンノースのみならず、L-ガラクトースにも、強力なマクロファージ刺激作用があるほか、D-マンノース、L-ガラクトースの両者とも植物におけるビタミンC生合成の前駆体として利用される。[18F]-2-fluoro-2-deoxy-D-mannoseが、がんのトレーサーとして利用可能であることが報告されているが一般化していない(非特許文献4、非特許文献5)。このように、グルコースをはじめとする種々のヘキソースは、生物において重要な役割を果たしている。これらのヘキソースと細胞との関係を調べようとする研究には、いずれも以下に代表例としてD-グルコースを取り上げて述べるような共通の課題が存在する。従来、生物がD-グルコースをどのようにして細胞内に取り込んで利用するのかについての研究は、例えばラジオアイソトープで標識したD-グルコースやその誘導体(D-デオキシグルコースなど)を用いて細胞内のラジオアイソトープ量を測定することで行われてきた。この方法は定量性に優れるものの、感度が低いといった問題があることに加え、測定手法上、生きた細胞がD-グルコースを取り込む様子をリアルタイムで連続的に観察することができないという欠点を有していた。そこで、本発明者らのグループは、生きた細胞のD-グルコースの動的な取り込みプロセスの研究に使用することができる方法として、D-デオキシグルコースの2位に蛍光発色団としてN-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ基を結合せしめた、緑色の蛍光を発する2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-D-グルコース(2-NBDG)を用いる方法を提案し、その有用性を哺乳動物の各種の細胞を用いて実証した(非特許文献6)。この方法は、2-NBDGが生きた細胞内に選択的に取り込まれる性質を利用したものであり、取り込みによる蛍光強度の変化を追跡することで細胞のD-グルコースの取り込みについての動的活動を定量的に知ることができることから、生物がD-グルコースをどのようにして細胞内に取り込んで利用するのかを研究する上での画期的な方法として世界中の研究者に評価され、今や、この研究分野において欠かすことができない標準的なプロトコルとして位置付けられている(非特許文献7)。本発明者らのグループはさらに、D-グルコースの特異的取り込みを評価するために、D-デオキシグルコースの鏡像異性体であるL-デオキシグルコースの2位に蛍光発色団としてN-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ基を結合せしめた、緑色の蛍光を発する2-[N-(7-ニトロベンズ-2-オキサ-1,3-ジアゾール-4-イル)アミノ]-2-デオキシ-L-グルコース(2-NBDLG)を開発するとともに、赤色の蛍光色を発するグルコース誘導体として、2位にスルホローダミン101をスルホンアミド結合せしめたL-デオキシグルコース(2-TRLG)を開発した(特許文献1)。D-フルクトースの1位にNBDを結合した分子(1-NBDF)を乳がんに応用した報告がある(非特許文献8)。このようにNBDを分子内に有する、グルコース誘導体やフルクトース誘導体が、生きた細胞を個々の細胞レベルでイメージングできる蛍光標識糖誘導体として知られている。青色の蛍光を発するクマリン誘導体分子をD-グルコースに結合した蛍光グルコース誘導体も知られている(Esculin、Fraxin、特許文献2)。活発な増殖能を示す腫瘍細胞の特徴として、そのエネルギー源でありかつアミノ酸、核酸、脂質など合成の材料にもなるグルコースを通常の細胞以上に要求することが知られている。(FDG)を患者に投与し、腫瘍組織に取込まれて細胞内に蓄積したFDG中の18Fの崩壊により放射されるガンマ線をPET(陽電子断層法)装置で検出するという方法で、ガンを体外から非侵襲的に画像診断する技術が実用化している。この放射性標識D-グルコース誘導体を利用したPET検査は、個々の細胞を識別できるだけの空間分解能(PET検査では空間分解能の下限は実用上5mm程度)を有しないため、急速に成長する可能性のある微細なガンを検出できない点に課題がある。FDGは半減期が短い(110分)ことや設備が大がかりとなるといった問題がある。取り込まれるという原理的問題をどのように回避するかという大きな課題がある。全身に分布する脂肪組織や筋肉、また小腸上皮、肝臓などは、極めて強力にD-グルコースを取り込むので、腫瘍との識別上問題となる。他のヘキソースについても、上記したようにその放射性標識体を用いてがんの検出やイメージングへの応用が試みられてきた。D-グルコースと同様に、D体であるためにその利用が制限される他、個々の単一細胞における違いをリアルタイムに精度よく検出できないといった問題がある。蛍光標識D-グルコース誘導体の腫瘍イメージングへの応用は、放射線標識法の弱点である空間分解能を向上させ、併せて放射性標識の煩雑さや危険を回避し、簡便な設備で瞬時の検出を可能にすることを目的として、現在各国で精力的に進められている。蛍光標識D-グルコース誘導体である2-NBDGはその代表的分子の一つで、FDGと同じく腫瘍細胞によく取り込まれることが報告されており(非特許文献9、特許文献3など)、2-NBDGをガンの画像診断に応用しようとする試みがなされている(非特許文献10、非特許文献11)。2-NBDGを用いた場合に比べより組織の深いところからでも蛍光の検出を可能にするため、組織貫通性の高い赤色や近赤外光などの2-NBDGより長波長側の蛍光を発し、2-NBDGよりも明るい蛍光分子をD-グルコースに結合する試みも活発に行われている(非特許文献12、非特許文献13、非特許文献14など)。これら新規蛍光分子の全てはNBDよりはるかに分子量とサイズが大きいため、これを結合した蛍光グルコース誘導体はいずれもグルコーストランスポーター(GLUT)を通過できない。2-NBDGをはじめ、これまで報告された全ての蛍光グルコース誘導体はD-(+)-グルコースを母核とする蛍光誘導体であり、放射性標識FDGと同じく、正常細胞にも取り込まれるという原理的問題点を抱えている。がん細胞の代謝活動の結果を利用したアプローチによりがんを識別する考えが提出されて注目を集めている(非特許文献15)。活発な代謝活動を営むがん細胞は、代謝により細胞内にCO2やプロトン(H+)の形で多量の酸を生じる。したいわば廃棄物にあたる酸は、正常細胞においては血流など循環系の助けを借りて除去もしくは中和され、細胞内が酸性になることを防いでいる。正常細胞の代謝活動に対応して構築されている組織では、想定外の増殖活動を続けるがん細胞には対応しきれない。血管から距離の離れたがん組織中では酸の除去や中和が不十分となりやすく、がん細胞は各種の分子機構を発達させて、細胞内が酸性になることを防ごうとしている。このようながん細胞で特に発達している分子を標的とする戦略は、例えば低酸素環境にあるがん細胞(それは放射線や薬剤に対し抵抗性を示すがん細胞であることが知られている)に対し選択的にこれを識別する診断薬や抗がん剤を運ぶドラッグデリバリーシステムを開発する上で役立つ可能性がある。anhydrase)が注目されている(非特許文献15)。一般に身体の細胞の代謝活動により細胞内に必然的に生じる酸性廃棄物である過剰なCO2は、種々の生体機構により排出され、細胞内の酸性化を防いでいる。これらのプロセスを支える鍵となっているのは血流による酸の除去である。固形がんの内部にあって血管から数10ミクロン以上離れた距離にあるがん細胞や、消化管の内腔に面した位置にあって異常に増殖し、かつ血管から距離が離れている細胞の場合、酸素やグルコースの供給が不足すると同時に代謝産物としての酸の除去が不十分となりやすい。12)を形質膜に過剰に発現することで、細胞内からのCO2の除去および細胞内に発生する酸の中和を助けているもののあることが報告された(非特許文献15)。9が想定されている)に結合することにより、これらの酵素の炭酸脱水作用を阻害することを見出した(非特許文献16、特許文献2)。これらクマリン誘導体は、低酸素状態にあるがん細胞のpHバランスを壊すことでがん細胞を障害するため、新世代の抗がん剤候補の一つとして期待されている(非特許文献21)。炭酸脱水酵素はあらゆる細胞の生存にとって必須の酵素であり、哺乳動物では16種類にも及ぶアイソザイムが細胞膜面のみならず、細胞質内やミトコンドリアにも存在する。このため、上記した蛍光低分子化合物が正常細胞内にあるほかのタイプの炭酸脱水酵素群を阻害して副作用を及ぼさないようにすることが求められる。有効な戦略の一つは、クマリン誘導体などの蛍光低分子化合物が、がん細胞の細胞膜外側に反応部位のあるCA9などに選択的に作用し、細胞内に侵入しないようにすることである。このような目的で、化合物内に電荷を導入する、もしくは配糖体とすることにより分子に親水性を付与し、脂質二重膜で構成される細胞膜を通過しないような工夫が提案されている(非特許文献17)。Supuranらは、各種のクマリンもしくはその誘導体を、天然型の糖である、D-グルコースやD-マンノース、D-ガラクトース、L-ラムノースなどの一位に結合することにより、分子に水溶性を付与し、もって細胞膜不通過性を与える提案を行っている(特許文献2)。一位は加水分解を受けやすい上、天然型を使用すれば正常細胞への影響は避けられない。近年、腫瘍細胞で発現が増加する分子を利用する方法として、グルコース以外の分子に蛍光分子を結合した蛍光分子マーカーが活発に開発されている。例としては、RGD配列を利用するものやEGFを利用するものなどがある(非特許文献18)。した方法においても、取り込みの多い少ないはあっても基本的には正常細胞にも蛍光分子が取り込まれるという点で天然型糖(例えば、D-グルコース)の誘導体を用いる方法と類似する問題を抱える。特異抗体などを用いて特定の腫瘍細胞を標的とする分子マーカーは、他のタイプの腫瘍を判定できず汎用性に難点がある。それを用いた細胞イメージング方法及びイメージング剤に関する。うちのL-グルコース誘導体(特定のクマリン誘導体が結合したL-グルコース誘導体)を用いてがん細胞を検出及び/又はイメージングする方法及びそのためのイメージング剤に関する。蛍光分子団として3-カルボキシ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリンが3-アミド結合(-CO-NH-)を介して、もしくは3-カルボキシメチル-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリンが3-メチルアミド結合(-CH2-CO-NH-)を介して、D-グルコース、L-グルコース、D-フルクトース、L-フルクトース、D-ガラクトース、L-ガラクトース、D-マンノース、又はL-マンノースのいずれかである単糖に結合し、生きた標的細胞に取り込まれる蛍光標識糖誘導体を含む、標的細胞又は標的細胞内分子をイメージングするための組成物。グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位に、蛍光分子団として3-カルボキシ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン又は3-カルボキシメチル-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリンを-NH-結合を介して結合した分子である請求項1に記載の組成物。2-デオキシ-2-((6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-3-イル)カルボキサミド)-D-グルコース、2-デオキシ-2-(2-(6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3-イル)アセタミド)-D-グルコース、2-デオキシ-2-((6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-3-イル)カルボキサミド)-L-グルコース、及び2-デオキシ-2-(2-(6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3-イル)アセタミド)-L-グルコースからなる群より選ばれる分子である請求項1に記載の組成物。2-デオキシ-2-((6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-3-イル)カルボキサミド)-D-マンノース、2-デオキシ-2-((6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-3-イル)カルボキサミド)-L-マンノース、2-デオキシ-2-(2-(6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3-イル)アセタミド)-D-マンノース、及び2-デオキシ-2-(2-(6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3-イル)アセタミド)-L-マンノースからなる群より選ばれる分子である請求項1に記載の組成物。標的細胞又は標的細胞内分子をイメージングする方法であって、以下の工程、a.標的細胞に、請求項1~4のいずれか一つに記載の組成物を接触させる工程、及びb.該標的細胞内に存在する該糖誘導体を検出する工程、を含む細胞のイメージング方法。標的がん細胞をイメージングするためのイメージング剤であって、蛍光分子団として3-カルボキシ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリンが3-アミド結合(-CO-NH-)を介して、もしくは3-カルボキシメチル-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリンが3-メチルアミド結合(-CH2-CO-NH-)を介してL-グルコースに結合し、がん細胞に取り込まれる蛍光標識L-グルコース誘導体を含むがん細胞のイメージング剤。前記蛍光標識L-グルコース誘導体が、L-グルコースの1位、2位、3位、4位又は6位に、蛍光分子団として3-カルボキシ-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン又は3-カルボキシメチル-6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリンを-NH-結合を介して結合した蛍光標識L-グルコース誘導体である請求項15に記載のイメージング剤。前記蛍光標識L-グルコース誘導体が、2-デオキシ-2-((6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-3-イル)カルボキサミド)-L-グルコース、又は2-デオキシ-2-(2-(6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3-イル)アセタミド)-L-グルコースである請求項15に記載のイメージング剤。前記イメージング剤がさらに、2位にスルホローダミンをスルホンアミド結合せしめた2-アミノ-2-デオキシ-L-グルコースを含む請求項15~17のいずれか一つに記載のイメージング剤。【請求項19】2-デオキシ-2-((6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシクマリン-3-イル)カルボキサミド)-L-グルコース、又は2-デオキシ-2-(2-(6,8-ジフルオロ-7-ヒドロキシ-4-メチルクマリン-3-イル)アセタミド)-L-グルコースである蛍光標識L-グルコース誘導体。Japanese)ライセンスをご希望の方、特許の内容に興味を持たれた方は、下記「問合せ先」まで直接お問い合わせください。