Japanese)【請求項1】RECQL4遺伝子のエキソン13に変異をホモで有し、RECQL4遺伝子のエキソン14~22が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン14~22に対応するアミノ酸配列をコードしており、RECQL4がヘリカーゼ活性を喪失しており、かつ、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す、マウス。【請求項2】RECQL4遺伝子のエキソン13全体が欠失している、請求項1に記載のマウス。【請求項3】RECQL4遺伝子のエキソン13が配列番号3に記載の配列を有する、請求項2に記載のマウス。作製されたマウスのRECQL4遺伝子のエキソン13全体が欠失している、請求項4に記載の方法。【請求項6】RECQL4遺伝子のエキソン13が配列番号3に記載の配列を有する、請求項5に記載の方法。【請求項7】RECQL4遺伝子のエキソン13への変異導入をジーンターゲッティングによって行う、請求項4~6のいずれか1項に記載の方法。本発明は、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す非ヒト哺乳動物、特にマウス及びその作製方法に関する。具体的には、RECQL4遺伝子のエキソン13に変異を有し、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示すマウス及びその作製方法に関する。221-234)、後に、ロスモンド・トムソン症候群として病名が統一された。【0003】これらの症状はまたRTSが早期老化症候群であることを示唆する。helicase)ファミリーに属している。この同じファミリーに属しているRECQL4遺伝子については、多くのRTS患者で突然変異が見つかっている。変異は、RECQL4タンパク質分子の中でとくにヘリケース活性をもつ部分に集中している(図1の矢印部分)。そこで、RECQL4遺伝子のヘリケース活性部分の変異がRTSの原因なのかを確認し、RTS患者のマウスモデルを作る目的で、RECQL4遺伝子を破壊したマウス個体の作製が試みられていた。本発明の目的は、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す非ヒト哺乳動物、特にマウス及びその作製方法を提供することである。具体的には、RECQL4遺伝子のエキソン13に変異を有し、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示すマウス及びその作製方法に関する。本発明者らは、マウスRECQL4遺伝子(単にRecql4とも記載する)のエクソン13のみを改変することによって、RECQL4遺伝子欠損マウスを作製し得ること、及び、作製された遺伝子欠損マウスが、ヒトのロスモンド・トムソン症候群の特徴の少なくともいくつかを示すことを見いだした。本発明はこれらの知見に基づいてなされたものである。本発明は、(1)ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す非ヒト哺乳動物;(2)ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示すげっ歯類動物;(3)ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示すマウス;(4)RECQL4遺伝子のエキソン13に変異を有し、かつ、RECQL4遺伝子のエキソン14~22が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン14~22に対応するアミノ酸配列をコードする、前記(3)に記載のマウス;(5)RECQL4遺伝子のエキソン13に変異を有し、かつ、RECQL4遺伝子のエキソン14~22が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン14~22に対応するアミノ酸配列をコードする、RECQL4遺伝子欠損マウス;(6)RECQL4遺伝子のエキソン13が配列番号3に記載の配列を有する、前記(4)又は(5)に記載のマウス;(7)RECQL4がヘリカーゼ活性を喪失している、前記(3)~(6)のいずれか1つに記載のマウス;(8)RECQL4遺伝子のエキソン13に変異を導入することを特徴とする、前記(3)~(7)のいずれか1つに記載のマウスの作製方法;(9)作製されたマウスのRECQL4遺伝子のエキソン13全体が欠失している、前記(8)に記載の方法;(10)作製されたマウスのRECQL4遺伝子のエキソン14~22が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン14~22に対応するアミノ酸配列をコードする、前記(8)又は(9)に記載の方法;(11)RECQL4遺伝子のエキソン13が配列番号3に記載の配列を有する、請求項(8)~(10)のいずれか1つに記載の方法;及び(12)RECQL4遺伝子のエキソン13への変異導入をジーンターゲッティングによって行う、前記(8)~(11)のいずれか1項に記載の方法である。悪性腫瘍といったヒトRTSの特徴のうち1以上の特徴を示すことをいう(後述の表1を参照)。本明細書において、「RECQL4遺伝子欠損マウス」とは、RECQL4遺伝子に変異を有し、その結果、REQCL4タンパク質が正常な機能を有しないマウス、特にREQCL4のヘリカーゼ活性が失われているマウスをいう。本発明の「RECQL4遺伝子欠損マウス」は、ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す。本発明においては、RECQL4遺伝子のエキソン13に変異が導入され、それによってRECQL4タンパク質の機能、特にヘリカーゼ活性が失われている。マウスRECQL4のcDNA配列を配列番号1に、アミノ酸配列を配列番号2に示した。本発明の一実施態様においては、エキソン13は配列番号3に記載の配列を有する。配列番号3に記載のエキソン13は、配列番号1中のヌクレオチドNo.1945-2124に相当する。本発明の一態様では、マウスRECQL4遺伝子のエキソン13全体が欠失している。エキソン13(180bp)は、ヘリケース活性に不可欠なアミノ酸配列をコードするエキソンである。エキソン13は、その構成塩基数が3の倍数(180bp)である。したがって、エキソン13全体が通常のスプライシングから除外されると、次のエキソン14~22においてフレーム(アミノ酸配列の読み枠)が保たれて野生型Recql4と相同なタンパク質を発現するようなエキソンとなる。エキソン14~22のいずれのエキソンも構成塩基数が単独では3の倍数ではないので、このようなエキソンを構成しうるエキソンとしては、エキソン1~22の中でエキソン13が最もC末端のエキソンとなる。したがって、本発明のRECQL4遺伝子欠損マウスでは、そのRECQL4遺伝子のエキソン14~22が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン14~22に対応するアミノ酸配列をコードしていることが好ましい。【0005】RECQL4タンパク質は、ヘリケーススーパーファミリーII型(SFII)に属し、7つの保存領域を有するタンパク質である。その中で、エキソン13はモチーフIIIをコードする。1465-1470)。2565-2571.)によって、ヘリケース活性が欠損することが示されている。migration)を抑制することが示されている。これらの報告は、モチーフIIIの存在がヘリケース活性にとって不可欠であることを示している。したがって、本発明の一つの実施態様においては、エキソン13のモチーフIIIを破壊する変異が導入されていてもよい。この場合でも、本発明のRECQL4遺伝子欠損マウスは、そのRECQL4遺伝子のエキソン14~22が、野生型RECQL4遺伝子のエキソン14~22に対応するアミノ酸配列をコードしていることが好ましい。マウス以外の非ヒト哺乳動物、特にげっ歯類動物を標的とする場合も、モチーフIIIが含まれるエキソンを変異導入の標的とし、かつ上述した性質を有する変異を導入することができる。マウスとしては、一般的にモデルマウスの作製に用いられる129/SVを使用することができる。本発明において、RECQL4遺伝子への変異の導入は、いわゆる遺伝子ターゲッティングによって行うことができる。arm)を有するベクターを利用することができる(図2、中段)。armは、一般には長い方が好ましいと考えられており、例えば、5’側領域はRECQL4遺伝子のエキソン1~12を含み長さが4kb以上あることがより好ましいが、3’側及び5’側のいずれについても長さは本発明に本質的ではなく、このような遺伝子ターゲティングに通常利用される長さを有していればよい。相同組換えを生じさせる領域は、標的領域と完全に同一である必要はなく、相同組換えが生じる程度の配列類似性を有していればよい。ポジティブ選択マーカーとしては、一般に薬剤耐性遺伝子を用いることができ、例えば、ネオマイシン耐性遺伝子、ハイグロマイシン耐性遺伝子、ピューロマイシン耐性遺伝子を用いることができる。ターゲッティングベクターは、相同組換えが起きたことを確認するためのネガティブ選択マーカーを更に含んでいてもよい。そのようなマーカーとしては、チミジンキナーゼ遺伝子、ジフテリア毒素A遺伝子を利用することができる。次に、このようなターゲッティングベクターを胚性幹細胞(ES細胞)へ導入する。導入方法は特に限定されず、このような場合に用いられる当業者に知られた一般的な方法及び条件を利用することができる。エレクトロポレーション、リポフェクチン法などが利用できる。ターゲティングベクターを導入したES細胞は、適切な条件下で培養することができる。ES細胞の培養に適し、かつ、ポジティブ選択用マーカー及びネガティブ選択用マーカーに対応した薬剤を含む培地中で培養することができる。ES細胞の培養条件及び培養方法は当業者にはよく知られたものである。必要であれば、更にPCR等により導入された遺伝子及びその位置、方向を確認することもできる。+/-)を、当業者によく知られた方法に従って、胚盤胞へマイクロインジェクションする。その後、偽妊娠動物への導入等により目的とする遺伝子が導入されたキメラ動物を得ることができる。得られたキメラ動物は、ES細胞由来の性質、例えば毛皮の色等を指標として導入遺伝子について選抜することができる。選抜された動物と遺伝子導入していない動物とを交配して子孫動物(F1動物)を得る。ES細胞由来の性質、例えば毛皮の色を指標にして生殖細胞に導入遺伝子を有する動物を更に選抜することができる。必要であれば、更に得られた動物の一部、例えば尾部からDNAを取得し、PCRによって導入遺伝子の有無を確認することもできる。-/-)、例えばRECQL4遺伝子のエキソン13全体が欠失している変異動物を得ることができる。+/+)を対照として、その性質を調べることができる。転写産物量は、例えばトータルRNA又はポリ(A)RNAをRT-PCRによって定量することができる。組織標本観察は、常法に従って、ホルマリン等で固定し、パラフィン包埋した切片を用いて行うことができる。細胞学的解析は、組織から細胞を単離し、例えば、種々の刺激、特に放射線、又は紫外線に対する感受性を測定することによって行うことができる。指標に動物の成育能を測定することもできる。-/-)、特にマウスでは、顕著な脱毛、びらん性の出血を伴う病変が見られる。マウスでは、骨組織の形成、特に、骨梁形成が不良となる。マウスでは生長も遅延し、生後10週において正常固体の約1/3程の大きさしかない。このようなマウスから採種した細胞は増殖速度が野生型の2/3程度に低下する。マウスは小腸上皮の絨毛の大きさ及び数が正常固体に比べて減少する。表1は、本発明のRECQL4遺伝子欠損マウスのこれらの特徴、及びその他の特徴とヒトのRTSの症状を比較した結果である。マウスがヒトのロスモンド・トムソン症候群(RTS)のモデルとして利用し得ることを示す。本明細書において、「ロスモンド・トムソン症候群の特徴を示す」とは、下記の表においてRTSの特徴として示される1以上の特徴を示すことをいう。表1.本発明のRECQL4欠損動物の特徴とヒトのRTSの症状の比較a:一部のRTS患者の細胞はX線及び紫外線に感受性だが、そうでない患者もいる。b:2~8週齡のマウス(n=23)について得られたデータ。c:T細胞が僅かしか見られない。d:組織学的検査によればRecql4遺伝子欠損マウスの精子形成は正常であったが、Recql4遺伝子欠損マウスをC57BL/6マウス又は同腹仔と交配した場合には新生仔は生まれなかった(オスn=5、メスn=4)。e:MEFについてのデータ。armを挿入することにより構築した。BglIIで切り出し、得られたPGKNeopAを、制限酵素EcoRI及びBamHIで切断したpBluescriptIIへ挿入し、更にチミジンカイネース遺伝子(HSV-TK)を常法に従い挿入することにより作製した。arm(ポジティブ選択マーカーの5’側領域)は、マウスES細胞のRecql4遺伝子のエキソン1からエキソン12を含む4.3kbのゲノムDNA(ES細胞株R1から通常のフェノールクロロホルム抽出により調製)を鋳型に、次のプライマーを用いたPCRにより作製した。arm(ポジティブ選択マーカーの3’側領域)は、マウスES細胞のRecql4遺伝子のエキソン14からエキソン20を含む1.9kbのゲノムDNA(ES細胞株R1から通常のフェノールクロロホルム抽出により調製)を鋳型に、次のプライマーを用いたPCRにより作製した。(TOYOBO)を用い、添付のプロトコールに従いPCRを行った。armを常法により挿入した。ターゲティングベクターの作製の基礎になったベクターNTBluntを図3に示す。8424-8428.)であった。(BioRad)を用いたエレクトロポレーション(電圧:250V、容量:950μF)によりマウスES細胞へ導入した。Canada.)にしたがい、選択薬剤G418(ポジティブ選択用;ネオマイシン誘導体)及びガンアシクロビル(ネガティブ選択用)を含む培地中で培養した。双方の選択薬剤に耐性を示す細胞のクローンを培養し、常法によりゲノムDNAを抽出した。抽出したDNAを、制限酵素XbaIで消化し、アガロースゲル電気泳動に付し、ナイロンメンブレンへ転写した。