野生型マウス(Recql4+/+)(すなわち、2本の染色体のいずれにおいてもRecQL4のエキソン13が欠損していない遺伝子)のES細胞クローンは8kbのバンドを与えた。RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-)、すなわちターゲッティングにより1本の染色体のRecQL4のエキソン13が欠損したマウスのES細胞クローンは6kb及び8kbのバンドを与えた。RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)、すなわち2本の染色体のいずれにおいてもRecQL4のエキソン13が欠損したマウスのES細胞クローンは6kbのバンドのみを与えた。RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-)のES細胞クローンを更なる工程に用いた。維持されているストレイン)の卵管切除によって得たブラストシスト(桑実胚)へ、マイクロインジェクター(ナリシゲ)およびピエゾマイクロマニピュレーター(プライムテック)を用いて注入した。この胚を精管結紮した雄と交配させた偽妊娠の代理母マウスの胎内に導入しキメラマウスを作製した。作製したキメラマウスの中から、Recql4+/-のES細胞が示す毛皮の色(アグチ)が80%以上含まれるオスのマウスを選択した。選択したオスのマウスとC57BL/6のメスのマウスとを交配して、エキソン13が欠損したRecQL4アレル遺伝子(Recql4-)が生殖系列へ導入されたF1マウスを作製した。F1マウス個体の遺伝子型の識別は、尾の一部を切除してDNAを抽出し、Recql4遺伝子に対するプライマーを用いたPCRにより行った。使用したプライマーは以下の通りである。+/-)とC57BL/6との交配により、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)を作製した。精巣から常法にしたがいトータルRNAを調製した。調製したトータルRNAに対し、下記のプライマー(図2の矢頭)を用い、Recql4遺伝子転写産物についてのRT-PCRを行った。(配列番号13)RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)のMEF及び精巣から得られた変異PCR増幅産物(転写産物)は、対応する野生型マウス(Recql4+/+)のPCR増幅産物(転写産物)と比較して短かかった。Eazy(プロメガ)へ常法によりクローニングし、下記のプライマーを用いて塩基配列を決定した。(配列番号15)配列決定したRECQL4遺伝子ホモ欠損マウスのPCR増幅産物の配列と野生型マウスのPCR増幅産物の配列とを比較したところ、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)のPCR増幅産物では、エキソン13を構成する配列(180塩基)が完全に欠失していることが明らかになった(図5)。このことは、上述のターゲッティング方法により得られたマウスにおいて、(1)RECQL4遺伝子のエキソン13全体が欠失していること、及び(2)スプライシングの結果、エキソン12の3’末端とエキソン14の5’末端とが正常に結合していること(すなわち、エキソン14以降に対応するアミノ酸配列は野生型の対応するアミノ酸配列と同じである)を示している。試験例1RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)におけるエキソン13欠失転写産物の発現量の評価RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)における変異Recql4転写産物(エキソン13欠失転写産物)の量と、野生型マウス(Recql4+/+)における正常Recql4転写産物の量とを定量的PCRにより比較した。1μgより合成されたcDNAを基準として、野生型マウスの精巣のトータルRNAより合成されたcDNAの希釈系列を作製した(RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスを1として野生型マウス0~0.1)。作製した野生型マウスのcDNAの各希釈系列とRECQL4遺伝子ホモ欠損マウスのcDNAとの混合物を鋳型として、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスで欠失しているエキソン13を挟む下記のプライマーのセット5'-CTCGTGGTCTCGCCTCTCCTGTCACTCATG-3'(配列番号16)5'-CAGCTGGGCACTGCCGCCAAGGCAATGCAG-3'(配列番号17)でPCRを行った。示されている各混合物の混合比は、それぞれ同一のcDNAサンプルを鋳型としてGapdh遺伝子に特異的なプライマーセットによるRT-PCRを行ったデータをもとに補正された値である。図6より、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスにおける変異転写産物の発現量は野生型マウスの野生型転写産物の発現量の1~2%であることが明らかになった。頭のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)うち、約40%は生まれた直後に死亡した。生存した個体のうち、80%は生後2日以内に死亡し、95%の個体は生後2週間以内に死亡した。残りの5%は生後2週間以降も生存していた。RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の胎生致死率を観察するため、帝王切開によって得られた胎児の遺伝子型を調べた。その結果、野生型マウス(Recql4+/+):RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-):RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)=19:43:14であり、メンデルの法則にほぼ従った分布を示した。したがって、胎生期の死亡はRecql4遺伝子の変異によるものではないと考えられる。野生型マウス(Recql4+/+)、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-)及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の19日目の胎児における体重はそれぞれ、1.48±0.17g、1.51±0.21g及び0.86±0.12gであった。したがって、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスの体重は野生型マウスの約60%であった(図7)。RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスの成長遅延はその後も持続し、生後10週間後では、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスの体重は野生型マウスの体重の約1/3であった(図8)。野生型マウス(Recql4+/+)、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-)及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の各個体からMEFを単離し、その細胞増殖を調べた。MEFの単離は、14.5日胚の頭部と内臓を除去し、組織を細かく破砕し、トリプシン処理により行った。2-メルカプトエタノールを添加したものを用いた。培養は10mmのシャーレ中、37°C、CO2濃度5%に管理したインキュベーターにて行った。細胞培養は、105個の細胞を60mmのシャーレ2枚ずつに播種し、毎日培地を代えて行った。細胞の計数は、24時間毎にコールターカウンター(ベックマン=コールター)によって行った。野生型マウス(Recql4+/+)及びRECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-)由来のMEFと比較して、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)由来のMEFは有意に低い増殖能力を示した。以上の結果より、本発明のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)は、野生型マウス(Recql4+/+)と比較して成長遅延を示すことが明らかになった。成長遅延は、ヒトRTSの症状の一つであるので、本発明の変異型マウスはヒトRTSのモデル動物として利用可能である。試験例3皮膚の異常(1)外観による評価ほとんどのRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)が何らかの皮膚の異常を示した。生後は目立たなかったが、生後6週までに頸部、背部、前足の付け根から側腹部にかけて脱毛があった。尻や腹部に毛の脱色を示した個体もあった。脱毛部位が個体表面の20%に達する個体も存在した。生後2~3月後には、脱毛部位にびらん性の出血をともなう病変が観察された。これらの病変はかさぶたを作って治癒に向かったが、再び発毛を見るには至らなかった。本病変は、皮膚が脆弱でありかつ物理的接触の機会が多い部分(例えばオスでは陰茎)で多く観察された。皮膚の乾燥は尾部において最も顕著であり、生後3~4ヶ月の個体の60%で観察された。行うために、マウス組織を、10%の緩衝フォルマリンによって固定し、パラフィン包埋して切片を作製し、ヘマトキシリン・エオジン染色を行った。TE300(ニコン)により倍率40×、100×及び400×で撮影した。野生型マウスと比較して、変異マウスの皮膚は、上皮、真皮、および皮下組織の低形成を示した。以上の結果より、本発明のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)は、野生型マウス(Recql4+/+)と比較して、皮膚の異常を示すことが明らかになった。皮膚の異常は、ヒトRTSの症状の一つであるので、本発明の変異型マウスはヒトRTSのモデル動物として利用可能である。リンパ組織の顕微鏡写真を試験例3と同様の方法により撮影した。野生型マウスと比較して、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)では骨形成層における骨梁形成の減少が見られた。小腸上皮の絨毛の大きさと数の減少も明らかであった。クリプト及び結合組織における細胞分裂像も少なかった。これは、RECQL4遺伝子のエキソン13の欠損が、増殖の盛んな腸上皮に特に影響を及ぼすことを示唆している。リンパ系の組織を観察したところ、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の胸腺は、野生型マウスと比較して顕著に小さかった。胸腺細胞の数も、野生型マウスと比較して有意に小さかった(新生仔マウスについて野生型マウスは1×107(n=1)、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスは0.6~5×105(n=2);成体マウスについて野生型マウスは2.0×107(n=1)、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウスは1.3×107(n=1))。RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の胸腺ではリンパ濾胞の皮質と髄質の区別が不明瞭であった。pulp)の大きさと数が野生型マウスと比較して顕著に少なかった。異常及びリンパ組織の異常を示すことが明らかになった。骨形成障害は、ヒトRTSの症状の一つであるので、本発明の変異型マウスはヒトRTSのモデル動物として利用可能である。本発明により、従来、致死性が高いと考えられていた、RECQL4遺伝子欠損ホモ動物(Recql4-/-)、特にRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)及びその作製方法が提供される。【図1】図1は、ヒトRTS患者で報告されているRECQL4遺伝子の突然変異の位置を示す図である。図中の矢印が突然変異の位置を示す。矩形は一つのエキソンに相当する。RecQヘリケースドメインを示す。【図2】図2は、本発明のRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の作製スキームを示す。上段は野生型マウスのRECQL4遺伝子の構造を示す。中断は、遺伝子ターゲティングベクターの構造を示す。下段は遺伝子ターゲッティングによる相同組み換え後のRECQL4遺伝子の構造を示す。TKはチミジンカイネース遺伝子を示し、Neorはネオマイシン耐性遺伝子を示す。矢印は転写の方向を示す。XbaIの認識配列の部位を示す。「3’プローブ」は、サザンハイブリダイゼーションに使用したプローブの領域を示す。矢頭はRT-PCRに用いたプライマーを示す。【図3】図3は、RECQL4遺伝子のエキソン13を破壊させるための、遺伝子ターゲティングベクターの作製の基礎になったベクターNTBluntを示す。【図4】図4は、野生型マウス(Recql4+/+)、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-)及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の個体の尾の一部から抽出したDNAの、Recql4遺伝子の3'プローブによるサザンブロットの結果を示す。【図5】図5は、遺伝子ターゲッティング前後の、マウスのRECQL4遺伝子の転写産物より作製したcDNAの塩基配列を示す。【図6】図6は、RECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)におけるエキソン13欠失転写産物についての定量的PCRの結果を示す。【図7】図7は、野生型マウス(Recql4+/+)、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-)及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の19日目における外観を示す。【図8】図8は、野生型マウス(Recql4+/+)及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の生後10週間後における外観を示す。【図9】図9は、野生型マウス(Recql4+/+)、RECQL4遺伝子ヘテロ欠損マウス(Recql4+/-)及びRECQL4遺伝子ホモ欠損マウス(Recql4-/-)の各個体に由来するMEFの細胞増殖を示す。