サンプル調製における注意点タンパク質解析手法の中でも、二次元電気泳動はサンプル調製(サンプル溶液の状態)が結果に占める重要度が高いです。塩をはじめとした泳動を阻害する夾雑物を、どのようにして除くかがポイントになります。タンパク質沈殿法や脱塩・バッファー交換を組み合わせて、効果的にサンプル調製を行いましょう。塩を徹底的に除く一次元目の等電点電気泳動でタンパク質のフォーカシングがうまくいかない原因のほとんどは、サンプル中に残存する塩にあります。mM以下に抑える必要があります。mMまで塩濃度を上げることができますが、可能かぎり塩は除去しましょう。下図に泳動パターンに対する塩の影響を示しました。一次元目の等電点電気泳動中に「電圧が上がらない」、「BPB色素がゲルの端まで流れきらない」などの現象が見られる場合も、サンプル溶液中に塩が含まれている可能性が高いです。このような場合には、泳動前に脱塩のステップを加えましょう。TCA/アセトン沈殿がよく用いられます。脱塩カラムなど担体を用いた脱塩方法では、サンプルの担体への非特異吸着が起こります。これを抑制するためには0.15M程度の塩の添加が必要ですので、あまり適していません。同サンプルを用いて溶解バッファーに含まれる塩の影響を検証しました。存在下のパターン(左図)では、縦筋、横筋、スポットの空白部分がみられますが、塩非存在下(右図)ではきれいにスポットが分離されています。塩以外に泳動を阻害する物質を以下に挙げます。Kitにより除くことができます。Kit二次元電気泳動における不純物を徹底して除去することで、スポットパターンをクリアにします。発現量比較には欠かせません。不純物の少ない試薬(ハイグレード試薬)を使うサンプル溶解バッファーや電気泳動に用いる試薬(例:尿素、チオ尿素、Tris、SDS)は、不純物の少ないハイグレードの試薬を使うことが望まれます。低グレードの試薬は荷電性・不溶性の夾雑物を含むことがあり、これらは泳動を阻害します。尿素やチオ尿素はグレードの高い試薬であっても、微量の荷電物質を含むことがあります。IRN-150L)を用いて処理することで、このような荷電物質を除くことができます。プロトコールバッファー成分の内、尿素/チオ尿素のみを先に溶解する。1~数%(w/v)のアンバーライトを加え、1時間撹拌する。溶液をろ過してアンバーライトを除き、Trisなど残りの試薬を加え溶解する。調製してから長期間保存した試薬では、泳動に悪影響を与える場合があります。凍結融解のくり返しは避け、一定期間内に使うようにします。mM酢酸マグネシウム)では、-20°Cで3ヶ月間は保存可能です。塩基性タンパク質の分離改善のためにpH7以上の塩基性領域では、通常サンプル溶液の還元剤として含まれるDTT(ジチオスレイトール)が作用しにくくなり、システイン残基の還元が不十分になります。システインの酸化はタンパク質間の非特異的な凝集や尿素との反応を引き起こし、泳動パターンには乱れが生じます。できるだけ塩基性領域のタンパク質分離の改善するための、サンプル調製・サンプル添加法をご紹介いたします。従来の還元剤に変わるチオール修飾試薬であり、塩基性におけるタンパク質の非特異的酸化を防ぎます。システインの多い動物由来サンプルにも有効です。下図にDeStreak添加の効果を示しました。塩基性側のストリーキングが明らかに改善していることがわかります。Holder)で行うことで、スポット分離が改善され泳動時間も短縮できます。(サンプル調製ガイドの項に泳動パターン例がございますので、ご参照ください)お問合せフォーム※よくあるお問合せとご回答(FAQ)は「こちらで»」ご覧いただけます。※ファイルを添付してのお問合せは、お手数ですが「Tech-JP@ge.comまでメールにて」お問合せください。提供、新製品・新サービスの研究開発等並びに市場調査のために利用します。対する必要かつ適切な監督を行います。個人情報に関するお問い合わせは個人情報相談窓口(042-5855111:平日午前10時~午後5時)にて承ります。