0098さらに、そのようなアミノ酸の置換は、親水性に基づいて効果的に作り出され得る。米国特許第4,554,101号は、蛋白質の最も大きな部分的平均値は、その隣接アミノ酸の親水性により支配されるように、当該蛋白質の生物学的特性と相関関係があると述べており、ここでその内容全体を本願明細書中に援用する。免疫学的等価な蛋白質をさらに得る。0099本発明に関連して使用され得る典型的なアミノ酸置換は、アルギニン及びリジン;グルタミン酸塩及びアスパラギン酸塩;セリン及びスレオニン;グルタミン及びアスパラギン;及びバリン、ロイシン、及びイソロイシンを変化することを非制限的に含む。当該蛋白質の2次構造を変化する間の生物学的活性のいくつか又は全ての保持に必要と考慮される、そのような他の置換は、いわゆる当業者によく知られるだろう。0100本発明に関連するポリペプチドの製造のために企図される変異体の他の型は、ペプチド模倣薬に使用され得る。模倣薬は、蛋白質2次構造の要素を模倣するペプチド含有分子である。York(1993)を参照のこと。ペプチド模倣薬の使用の背後にある根本的論理的根拠は、蛋白質のペプチド骨格が、抗体及び抗原の相互作用の如き分子間相互作用を促進するような方法で、アミノ酸側鎖を主に正しく配置するために存在することである。ペプチド模倣薬は、当該天然の分子と類似する分子間相互作用を可能とするよう期待される。これらの原則は、上記原則と連動して、リソソーム酵素の天然の特性の多くを有するが、変化されそしてさらに改良された特徴を有する第2世代分子を設計するために使用され得る。高リン酸化リソソーム酵素の変異体は、親ポリペプチドと比較して改良された糖鎖付加パターンを有するように製造され得る、例えば、1又は複数の糖質成分を欠損すること、及び/又は天然ポリペプチド中には存在しない1又は複数の糖鎖付加部位を付加することである。0102糖鎖付加は、典型的にN−結合型かO−結合型のいずれかである。N−結合型は、アスパラギン残基の側鎖へ糖質成分の結合をいう。トリペプチド配列、アスパラギン−X−セリン、及びアスパラギン−X−スレオニンであって、ここでXがプロリンを除くいずれかのアミノ酸である当該トリペプチド配列は、アスパラギン側鎖へ糖質成分の酵素的結合のための認識配列である。1又は複数のこれらのトリペプチド配列を含むようにアミノ酸配列を変えることによりポリペプチドに付加され得る。O−結合型糖鎖付加は、糖類N−アセチルガラクトサミン、ガラクトース、又はキシロースの内の1の、5−ヒドロキシプロリン又は5−ヒドロキシリジンも使用され得るけれども、ヒドロキシアミノ酸への、最も一般的にはセリン又はスレオニンへの結合をいう。1又は複数のセリン又はスレオニン残基を元々のポリペプチドの配列に挿入又は置換することにより付加され得る。0103ドメイン・スイッチングリソソーム酵素蛋白質の様々な部分は、相当の配列相同性を有する。変異は、その機能を変えるリソソーム酵素ポリペプチドに同定され得る。これらの研究は、少なくとも2つの理由から潜在的に重要である。びこの遺伝子の突然変異体が、関連する種、例えば、ラット、ラビット、サル(モンキー)、テナガザル(gibbon)、チンパンジー、サル(エイプ)、ヒヒ、ウシ、ブタ、ウマ、ヒツジ、そしてネコの中に存在し得るという適度な期待を提供する。これらのホモログ、変異体及び突然変異体の単離において、及び他の分析と連動して、ある活性又は機能的ドメインが単離され得る。第2には、上記のような分子のさらなる突然変異分析についての出発点を提供するだろう。この情報が引き出され得る1つの方法は、“ドメイン・スイッチング”である。0104ドメイン・スイッチングは、異なるが、しかし関連するポリペプチドを使用するキメラ分子の産生を含む。リソソーム酵素であって、例えば、酸性αグルコシダーゼの配列と、他の源由来の類似リソソーム酵素の配列、及びこれらのポリペプチドの突然変異体及び対立遺伝子多型とを比較することにより、これらの分子の機能的に重要な領域について予想し得る。酵素機能に対するこれらの領域の臨界、及びリソソーム蓄積症における有効性を決定するために、これらの分子の関連ドメインをスイッチすることが可能である。これらの分子は、これらの“キメラ”が天然の分子と区別され得ることにおける加算値を有し得、一方、場合により同様の又は促進する機能を提供する。0105現在同定されている多くのリソソーム酵素に基づいて、突然変異体のさらなる分析、及び2次構造における予測効果は、この理解に追加されるだろう。リソソーム酵素間においてドメインをスイッチした当該突然変異体は、それらと相互作用するこれらの分子及びポリペプチドとの構造的/機能的関係について有用な情報を提供するだろうと企図される。上記の突然変異体に加えて、本発明は、融合蛋白質として知られる、特定の種の挿入変異の産生をさらに企図する。この分子は、一般的に、N−又はC−末端で、全ての又は一部の第2ポリペプチドに結合する全ての又は大部分の天然分子を有する。融合は、典型的に他の種由来のリーダー配列を使用し、異種宿主において蛋白質の組換え発現を可能とする。他の有用な融合は、当該融合蛋白質の精製を促進するために、免疫学的活性ドメイン、例えば抗体エピトープの付加を含む。当該融合結合部で又はその近くで外部からの開裂部位の含有は、精製後、ポリペプチドの除去を促進するだろう。ドメイン、細胞標的シグナル又は膜貫通領域の結合を含む。0107本発明に使用され得る、様々な商業的に入手可能な融合蛋白質発現システムがある。Haven,CT)、及び6×Hisシステム(Quiagen,Chatsworth,CA)を非制限的に含む。これらのシステムは、わずかな追加アミノ酸のみを有する組換えポリペプチドを製造することができ、そして当該追加アミノ酸は、当該組換えポリペプチドの抗原性能力に影響を与える可能性が低い。FLAGシステム及び6×Hisシステムの双方は、短い配列のみを付加し、それらの双方は、乏しい抗原性として知られ、及びその天然立体構造に対する当該ポリペプチドの折りたたみに悪影響を与えない。有用であると企図される他のN−末端融合は、当該蛋白質又はペプチドのN−末端領域でのMet−Lysのジペプチドの融合である。そのような融合は、蛋白発現又は活性において、有益な増殖を作り出し得る。0108特定の有用な融合コンストラクトは、リソソーム酵素融合コンストラクトの免疫原生を促進するために、高リン酸化リソソーム酵素のポリペプチド又はその断片が、ハプテンと融合されるものとなり得る。これは、当該蛋白質の検出を可能とする高リン酸化リソソーム酵素に対する抗体の産生に有用となり得る。他の態様において、融合コンストラクトは、当該リソソーム酵素に関連する組成物の特定の部位又は細胞へのターゲッティングを促進するように作られ得る。0109所望の特性、例えば、血清半減期を延長するためのIg定常領域、又はターゲッティングのための抗体又はそれらの断片を有する異種ポリペプチドを含む他の融合コンストラクトもまた企図される。他の融合システムは、所望のポリペプチドから当該融合パートナーを切除することが望ましいポリペプチド・ハイブリッドを製造する。他の態様において、当該融合パートナーは、プロテアーゼの特定認識配列を含有するペプチド配列により、組換え高リン酸化リソソーム酵素のポリペプチドと結合させられる。Biolabs,Beverley,MA)により認識される配列である。上記のように、誘導体は、ユビキチン化、標識化(例えば、放射性各種又は種々の酵素で)のような技術、ペグ化の如き共有ポリマー結合(ポリエチレングリコールによる誘導体化)、及びオルニチンの如きアミノ酸の化学合成による挿入又は置換により化学的に改良されたポリペプチドをいう。リソソーム酵素の誘導体は、治療薬としても有用であり、そして本発明の方法により製造され得る。0111ポリエチレングリコール(PEG)は、生体内でより長い半減期を提供するために、本発明の方法により製造されたリソソーム酵素に結合され得る。当該PEG基は、いずれの都合の良い分子量を有し、直鎖となるか又は分岐され得る。当該PEGの平均分子量は、好ましくは約2キロダルトン(“kD”)〜約100kDaの範囲であり、より好ましくは約5kDa〜約50kDa、最も好ましくは約5kDa〜約10kDaの範囲である。当該PEG基は、一般的に、本発明の化合物における反応基(例えば、アルデヒド、アミノ、又はエステル基)への、PEG成分における反応基(例えば、アルデヒド、アミノ、チオール、又はエステル基)を通じたアシル化又は還元的アルキル化を経由して、本発明の化合物に結合されるだろう。着目のポリペプチドへのPEG成分の付加は、本分野においてよく知られる技術を使用して実施され得る。国際特許公開第WO96/11953号、及び米国特許第4,179,337号を参照のこと。0112PEGを有する酵素ポリペプチドのライゲーションは、通常、水相で生じ、そして逆相分析的HPLCにより、容易に測定され得る。当該PEG化ペプチドは、分取HPLCにより容易に精製され得、分析的HPLC、アミノ酸分析、及びレーザー脱離質量分析により特徴付けられる。0113標識ある態様において、治療酵素は、その検出を容易にするために標識される。他の物理的手段により検出可能な組成物である。(例えば、ELISAにおいて一般に使用されるようなもの)、ビオチン、ジゴキシゲニン、又はハプテンを含み、並びに、例えば、放射性標識を当該ハプテン又はペプチドに組み入れることにより、又は当該ハプテン又はペプチドと特に反応する検出抗体を使用して、検出可能に製造された蛋白質を含む。0114本発明における使用に好適な標識の例は、蛍光色素(例えば、フルオレセイン・イソチオシアネート、テキサス・レッド、ローダミンなど)、放射標識(例えば、3H、125I、35S、14C、又は32P)、酵素(例えば、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、及びELISAにおいて一般的に使用される他のもの)、及びコロイド金、色ガラス又はプラスチックビーズ(例えば、ポリスチレン、ポリプロピレン、ラテックスなど)の如き比色分析標識を非制限的に含む。0115当該標識は、本分野においてよく知られる方法に従い、当該分析の所望の成分に直接的又は間接的に結合し得る。好ましくは、ある態様における当該標識は、本発明に関する活性物質の結合のためのイソシアネート試薬を使用して、当該バイオポリマーに共有結合させられる。本発明のある態様において、本発明の2官能性イソシアネート試薬は、バイオポリマーに標識を結合し、そこに結合される活性物質なしで標識バイオポリマー複合体を形成するために使用され得る。当該標識バイオポリマー複合体は、本発明に関する標識された複合体の合成のための中間体として使用され得、又は当該バイオポリマー複合体を検出するために使用され得る。処分条件を含めて、広範囲の標識が使用される。非放射性の標識は、直接的手段によりしばしば結合される。一般的に、リガンド分子(例えば、ビオチン)は、当該分子に共有結合する。化学発光による化合物の如きシグナルシステムに対する共有結合かのどちらかである。0116本発明の化合物は、例えば、酵素又は蛍光プローブとの結合によりシグナル産生化合物にも直接結合し得る。標識としての使用に好適な酵素は、ヒドロラーゼ、特にホスファターゼ、エステラーゼ及びグリコシダーゼ、又はオキシドターゼ、特にペルオキシダーゼを非制限的に含む。標識としての使用に好適な蛍光化合物、すなわち蛍光プローブは、フルオレセイン及びその誘導体、ローダミン及びその誘導体、ダンシル、ウンベリフェロンなどを非制限的に含む。ジヌクレオチドなどを非制限的に含む。標識としての使用に好適な化学発光化合物は、ルシフェリン、及び2,3−ジヒドロフタラジンジオン、例えば、ルミノールを非制限的に含む。本発明の方法において使用され得る様々な標識又はシグナル産生システムの再調査のために、米国特許第4,391,904号を参照のこと。0117標識を検出する手段は、いわゆる当業者によく知られている。従って、例えば、当該標識が放射性である場合、検出手段は、オートラジオグラフィーとして、シンチレーション・カウンター又は写真用フィルムを含む。当該標識が蛍光標識である場合、光の適切な波長で蛍光色素を励起させること、及び当該得られた蛍光発光を検出することにより検出され得る。当該蛍光発光は、電化結合素子(CCDs)又は光電子増倍管の如き電子感知器の使用により視覚的に検出され得る。同様に、酵素標識は、当該酵素に適切な基質を提供すること、得られた反応性生物を検出することにより検出され得る。比色分析の又は化学発光法の標識は、当該標識に関する色を観察することにより簡単に検出し得る。本発明の方法における使用に好適な他の標識化及び検出システムは、当業者に容易に明らかとなるだろう。そのような標識化された変調装置及びリガンドは、疾患又は健康状態の診断において使用され得る。0118好ましい態様において、当該方法は、リソソーム輸送の欠損した細胞系から高リン酸化リソソーム酵素を製造するステップを含む。好ましい態様において、当該方法は、CHO細胞系、G71から高リン酸化組換えヒト酸性αグルコシダーゼ(rhGAA)を製造するステップを含む。リソソーム酵素の製造は、以下のステップ:(a)アルファ−グルコシダーゼ(GAA)を発現する組換えG71の開発;(b)当該細胞の培養;及び(c)リソソーム酵素の製造のためのバイオリアクターとして細胞系のスケールアップ、を含む。6510−1)から増幅され、そして哺乳類発現ベクターであるpCINt(BioMarin)の中にサブクローンする。当該ベクターpCINtは、ヒトCMVエンハンサー−プロモーター、ラビットβ−グロビンIVS2イントロン、pcDNA3.1(+)(Invitrogen)からの多重クローニング部位、十分な転写終止のためのウシ成長ホルモン・ポリアデニル化シグナル、及び酵素効率を低減するための点変異を有する選択的マーカー・ネオマイシン・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含む。当該弱毒マーカーは、弱いHSV−tkプロモーターでさらにマイナスとなる。0119細胞系の開発について、G71を、線状発現プラスミドでトランスフェクトし、そして組換え体を選択した。形質転換体のサブクローニングの第1ラウンドの後、4つの細胞系を、蛍光基質を使用して選択し、そして特に指定した。CIN細胞系を、微少担体を有するスピナーにおける細胞特異的生産性(製品/細胞のpg)について分析した。302培地中で培養し、Cytopore微少担体の上に種を蒔き、200mLのスピナーフラスコ内で成長させた。BSAがELISAにより検出されなくなるまで、血清を1週間に渡り希釈により除去した。よい製造法を同定し、前臨床材料の製造のためのバイオリアクターとしてスケールアップした。通過ろ過される細胞収穫培地は、5.5に調整されたpHであり、保存され、そして次いで、pH4.5に調整され、そして4°Cで4日間保存される。材料は、沈殿物を除去するために再ろ過される。収率は、このステップとして>90%である。ろ液は、ブルー−セファロース上にロードされ、20mMのアセテート/ホスフェイト、50mMのNaCl、pH4.5で洗浄され、そして20mMのアセテート/ホスフェイト、50mMのNaCl、pH5.9で溶出される。このステップについての収率は、>70%である。溶出液は、Q−セファロースにロードされ、10mMのヒスチジン、pH6.0、70mMのNaClで洗浄され、そして10mMのヒスチジン、pH6.0、165mMのNaClで溶出される。このステップについての収率は、>50%である。溶出液は塩であり、1.3MのNaCl及び5.0MのNaClに応じて調整され、それぞれ、フェニル−セファロースにロードされ、1.3M〜0.5MのNaClで濃度勾配溶出される。当該リソソーム酵素は、全長酵素、又は当該酵素の治療上の又は生物学的活性のいくらか、実質的に全て、全てをなお保持するような断片である。ある態様において、当該酵素は、もし発現されず又は作り出されず、又はもし発現又は作成において実質的に低減されると、リソソーム蓄積症を非制限的に含む疾患を発生させるであろう。好ましくは、当該酵素は、ヒト由来、又はヒトから入手されるものである。0122当該化合物は、全長酵素、又は当該酵素の活性をいくらか、実質的に全て又は全てをなお保持するような断片である。好ましくは、リソソーム蓄積症の治療において、当該酵素は、もし発現されず又は作り出されず、又はもし発現又は作成において実質的に低減されると、リソソーム蓄積症を発生させるだろう細胞内に見出される酵素である。好ましくは、当該酵素は、ヒト又はマウス由来、又はヒト又はマウスから入手されるものである。好ましくは、当該酵素は、リソソーム内蓄積酵素であって、例えば、アルファ−L−イズロニダーゼ、イズロネート−2−スルファターゼ、ヘパランN−スルファターゼ、アルファ−N−アセチルグルコサミニダーゼ、アリールスルファターゼA、ガラクトシルセラミダーゼ、酸性−アルファ−グルコシダーゼ、チオエステラーゼ、ヘキソサミニダーゼA、酸性スフィンゴミエリナーゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、又は他のリソソーム内蓄積酵素である。リソソーム蓄積症、及び活性物質として有用であるその欠損蛋白質の表は、以下の通りである。シアル酸輸送体0124好ましい態様において、当該酵素は、エンドソーム酸性化欠損細胞系により製造されたヒト組換えリソソーム酵素である。好ましい態様において、当該ヒト組換え型は、“定義”の記載の通り、リン酸化オリゴ糖の高レベル、及び非リン酸化高マンノースオリゴ糖の低レベルを有する。好ましい態様において、当該酵素は、高リン酸化ヒト組換え型酸性アルファグルコシダーゼ(rhGAA)である。(MLD)、クラッベ病、ポーンプ病、セロイド脂褐素症、テイ−サックス病、ニーマン−ピック病A及びB、及び他のリソソーム蓄積症を非制限的に含む。0126それ故、上記表によって、各疾患について、当該共役物質は、好ましくは、当該疾患における特定の活性物質である酵素欠損を含む。Iに関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、α−L−イズロニダーゼである。IIに関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、イズロネート−2−スルファターゼである。IIIAに関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、ヘパラン−N−スルファターゼである。(MLD)に関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、アリールスルファターゼAである。クラッベ病に関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、ガラクトシルセラミダーゼである。ポーンプ病に関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、酸性α−グルコシダーゼである。CLNに関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、トリペプチジルペプチダーゼである。テイーサック病に関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、ヘキソサミニダーゼアルファである。ニーマン−ピック病A及びBに関連する方法について、当該好ましい化合物又は酵素は、酸性スフィンゴミエリナーゼである。本発明の化合物は、種々の経路により投与され得る。香料添加剤との組み合わせである。防腐剤の如き慣習的添加剤との組み合わせである。0129本発明の化合物は、吸入を経由して投与されるエアロゾル形成において使用され得る。本発明の化合物は、ジクロロジフルオロメタン、プロパン、窒素などの如き加圧するのに許容される推進剤中に配合され得る。0130さらに、本発明の化合物は、乳化基剤又は水溶性基剤の如き様々な基剤と混合することにより、坐薬中に製造され得る。本発明の化合物は、坐薬を経由して直腸から投与され得る。当該坐薬は、ココアバター、カルボワックス(carbowaxes)、及びポリエチレングリコールであって、体温で融解し、室温で凝固されるものの如き媒体を含む。0131シロップ、エリキシリル剤、及び懸濁剤の如き経口又は直腸投与のための当該複合体、モジュレーター、及びLRPリガンドのユニット剤形が提供され得、ここで、例えば、茶さじ1杯分、テーブルスプーン1杯分、タブレット又は坐薬のような各一回の用量は、活性物質を含む当該組成物の所定の量を含む。他の医薬として許容される担体の溶液としての組成物中に当該複合体を含み得る。0132実用において、本発明の化合物は、密接な混合剤中の当該活性成分として、医薬複合技術に応じて医薬担体と混合され得る。当該担体は、例えば、経口又は非経口(静脈内を含む)の投与のために所望される剤形の好まれる形に依存する広範な形をとる。担体であり、例えば、液体製剤に移ることが好まれる固形経口製剤の場合、粉剤、ハード及びソフトカプセル、及びタブレットである。Co.,1985)に記載される。皮膚(dermal)又は皮膚(skin)用パッチ剤は、本発明の複合体、モジュレーター、及びLRPリガンドの経皮デリバリーのための好ましい手段である。パッチ剤は、好ましくは、当該化合物の吸収を増大するためDMSOの如き吸収エンハンサーを提供する。経皮薬物デリバリーのための他の方法は、米国特許第5,962,012号、同第6,261,595号、及び同第6,261,595号に記載され、その各内容全てを本願明細書中に援用する。0134医薬として許容される賦形剤であって、例えば、媒体、アジュバント、担体又は希釈剤は、商業的に入手可能である。商業的に入手可能である。(皮下、筋肉内、及び静脈を含む)、肺(経鼻又は口腔吸入)、又は経鼻投与に好適な組成物を非制限的に含む。例示的な投与経路は、経口、及び静脈経路である。当該組成物は、ユニット剤形において便利に存在し得、そして、薬の分野においてよく知られる方法のいずれかにより製造され得る。0136実用において、本発明の化合物は、密接な混合剤中の当該活性成分として、医薬複合技術に応じて医薬担体と混合され得る。当該担体は、例えば、経口又は非経口(静脈内を含む)の投与のために所望される剤形の好まれる形に依存する広範な形をとる。担体であり、例えば、液体製剤に移ることが好まれる固形経口製剤の場合、粉剤、ハード及びソフトカプセル、及びタブレットである。0137投与の容易性を理由として、固形医薬担体が明らかに使用される場合、タブレット剤、及びカプセル剤は、最も有用な経口剤形を表す。所望により、タブレットは、標準的な水性又は非水性技術によりコートされ得る。これらの組成物中の活性化合物のパーセンテージは、もちろん、変化され得、かつ、便利なことに、当該ユニットの重量の約2パーセント〜約60%の間となり得る。当該使用されるバイオポリマーに依存する部位のいずれかにおける当該活性物質の選択的蓄積、及び/又は放出を示す。0139本発明の組成物は、ウイルス・エンベロープ又は媒体の中にカプセル化され又はそれらに結合され、又は細胞内に組み入れられて、投与され得る。媒体は、通常球状であり、かつ頻繁に脂質となるミセル粒子である。リポソームは、2分子膜から形成される媒体である。好適な媒体は、単層媒体、及び多重膜脂質媒体又はリポソームを非制限的に含む。そのような媒体、及びリポソームは、広範囲の脂質又はリン脂質化合物であって、例えば、ホスファチジルコリン、ホスファチジン酸、ホスファチジルセリン、ホスファチジルエタノールアミン、スフィンゴミエリン、糖脂質、ガングリオシドなどであり、例えば米国特許第4,394,448号に記載される技術の如き標準的技術を使用して製造され得る。そのような媒体又はリポソームは、細胞内に化合物を投与するために使用され得、当該標的組織へ化合物をデリバリーするために使用され得る。着目のp97−組成物の制御放出は、カプセル化を使用しても達成され得る(例えば、米国特許第5,186,941号を参照のこと。0140血流中に、又は好ましくは血液脳関門の少なくとも外側に、当該組成物を希釈する投与経路が使用され得る。好ましくは、当該組成物は、末梢に、最も好ましくは静脈内に投与され、又は心臓カテーテルにより投与される。頸静脈内及び頚動脈内注入もまた有用である。組成物は、局所的又は局部的、例えば、腹腔内、皮下又は筋肉内に投与される。ある態様において、組成物は、好適な医薬希釈剤又は担体とともに投与される。0141当業者は、当該特定の化合物の機能、症状の重症度、及び副作用に対する被験者の感受性により投与量が変化し得ることを容易に認識するだろう。生体外で実施される用量反応、及び薬物動態評価を非制限的に含む種々の手段により、いわゆる当業者に容易に決定され得る。0142投与量は、個人の要求、所望の効果、使用される活性物質、バイオポリマー、及び選択される投与経路にも依存し得る。複合体の好ましい用量は、約0.2pmol/kg〜約25nmol/kgであり、及び特に好ましい用量は、2〜250pmol/kgであり;あるいは、当該複合体の好ましい用量は、0.02〜2000mg/kgとなり得る。これらの用量は、当該バイオポリマーに関連する活性物質又は薬成分の数により影響されるだろう。用量は、投与される当該活性成分に基づいて算出され得る。化合物は、特定の組織において選択的蓄積が見られ得る。)に関連する症状を含む。0144当該対象方法は、種々の異なる疾患の症状の治療における使用を見出す。ある態様において、特に着目すべきは、以下の疾患症状における当該対象方法の使用であり、ここで当該疾患症状は、所望の活性を有する活性物質又は薬物が前もって同定されている場合であるが、当該活性物質又は薬物が、完全に満足できる治療効果をあげるように標的部位、領域又は区画に十分にデリバリーされない場合である。そのような活性物質又は薬物に加えて、高リン酸化化合物を製造する当該対象方法は、治療効果、及び活性物質又は薬物の治療指数を促進するために使用され得る。0145治療は、化合物の投与に関する被験者にとっての有益な結果を含むことを意図されており、当該有益な結果は、病気となることの低減される可能性、疾患の阻害、疾患の進行を減速すること、止めること又は克服すること、又は宿主を苦しめる疾患症状に関連する兆候の改善を含み、ここで当該改善又は利益は、パラメーターの大きさにおいて少なくとも低減を言及する広い意味で使用され、当該パラメーターは、例えば、病態に関する炎症及び痛みの如き、治療される当該病態に関する兆候である。そのようなものとして、治療は、病態又は少なくともそれらに関する兆候が、当該宿主が当該病態にもはや苦しまないように又は少なくとも当該病態を特徴付ける症状にもはや苦しまないように、例えば発生を防ぐこと又は止めること、例えば終わらせることの如く完全に抑制されるような状態もまた含む。0146種々の宿主又は被験者は、当該対象方法により治療可能である。一般に、そのような宿主は、“哺乳類(mammals)”又は“哺乳類の(mammalian)”である、ここでこれらの用語は、人間以外の肉食動物(例えば、イヌ及びネコ)、げっ歯目(例えば、マウス、モルモット、及びラット)、及び霊長類(例えば、人間、チンパンジー、及びサル)を含む哺乳類クラス範囲内の有機体を記載するために広範に使用され得る。多くの態様において、当該宿主は人間だろう。0147以下の実施例は、本発明をさらに例証する。これらの実施例は、単なる本発明の実例を意図したものであり、限定することとして構成されるものではない。以下の実施例は、高リン酸化リソソーム酵素の製造、及び精製、そしてリソソーム蓄積症の治療におけるそれらの使用について例示的な手順を提供する。低用量で治療的に有用である組換え型の高リン酸化リソソーム酵素を製造するために、改良したリン酸化レベルを提供する細胞系の開発が、まず第1に必要である。K.Draper)を、CHO−K1(ATCCCCL−61)から直接的に導いた。CHO培地中、34°Cで維持した。6510−1)から増幅した(図1)。図10150当該増幅されたGAA配列を、側面にあるKpnI、及びXhoIを使用して、哺乳類発現ベクターであるpCINt(BioMarin)の中にサブクローンした。当該発現ベクターは、ラビットβ−グロビンIVS2イントロンに連結するヒトCMVエンハンサープロモーター、及びpcDNA3.1(+)(Invitorogen、Carlsbad、CA)由来のマルチクローニング部位を含んだ。効率的な転写終結を、ウシ成長ホルモンのポリアデニル化シグナルにより保証する。選択マーカーは、酵素効率性を低減するための点変異を実施するネオマイシンリン酸転移酵素(ホスホトランスフェラーゼ)遺伝子だった。当該弱体化マーカーを、弱体HSV−tkプロモーターでさらにマイナスとした。当該プラスミドに挿入したhGAAの当該ヌクレオチド配列及び蛋白質翻訳を、図3に示した(それぞれ、配列整列番号1及び2)。高リン酸化GAAを得るために、当該GAA含有発現ベクターを、G71CHO細胞の中にトランスフェクトした。0152G71を、線状化発現プラスミドでトランスフェクトし、そして組換え型を200μg/mLのG418において選択した。30:132−43,1978)。この基質は、加水分解後、4−メチルウンベリフェロン(4MU)を産生し、それは、UV−ライト(約366nm)で照射されるとき特徴的な青色蛍光体により検出され得る。1.8〜4.6(pg/産生物の細胞)の範囲内である。当該4つCIN細胞系を、マイクロキャリアを有するスピナー中において、酵素産生物について分析した。0153比較として、GAAを過剰発現するジヒドロ葉酸還元酵素欠損CHO細胞、DUBX11を類似の手段により製造した。高産生のDUBXB11クローン、3.1.36を、さらなる試験のために選択した。当該G71形質転換体からの酵素産生を測定するために、4MU分析による上記測定のように、最も大量の酵素活性を示す当該細胞系を細胞培養における酵素産生について、さらに評価した。Excell302培地中で培養した。細胞をCytoporeマイクロキャリア(Pharmacia/Amersham)上に蒔き、そして200mLのスピナーフラスコ内で培養した。BSAがELISAにより検出されなくなるまで、1週間に渡り希釈することにより、血清を除去した。当該4つのCIN系を、GAA産生について分析した。CIN11の力価は、約4mg/L/日で、最も産生するものとなった。3.1.36の力価は、約1mg/L/日だった。0156このスクリーニングからの最も良い候補である、CIN11(G71GAA2として知られる)を、前臨床材料の製造のためのバイオリアクターにスケ−ルアップした。大量の組換えGAAを得るために、形質転換されたG71細胞を、バイオリアクターの培養条件下で成長させ、酵素を当該細胞培地から精製した。0158ろ過された細胞収穫培地を、5.5に調整されたpHで、及び4.5に調整されたpHで保存し、及び4°Cで4日間保存した。材料を、沈殿物を除去するために、再ろ過した。このステップついての収率は、>90%であった。ろ過液をブルー−セファロース(Pharmacia/Amersham)上にロードし、20mMのアセテート/ホスフェイト、50mMのNaCl、pH4.5で洗浄し、そして、20mMのアセテート/ホスフェイト、50mMのNaCl、pH5.9で溶出した。このステップについての収率は、>70%であった。ろ過液をQ−セファロース(Pharmacia/Amersham)上にロードし、10mMのヒスチジン、pH6.0、70mMのNaClで洗浄し、そして、10mMのヒスチジン、pH6.0、165mMのNaClで溶出した。このステップについての収率は、>50%であった。ろ過液は塩であり、そしてpHを、1.3MのNaCl及び5.0に調整し、それぞれ、フェニル−セファロース(Pharmacia/Amersham)上にロードし、1.3M〜0.5MのNaClで濃度勾配溶出した。ウエスタンブロットにより評価した通り、98%超だった(図4)。図40159これらの分析は、組換えリソソーム酵素を製造する上記手順が、大量の高度に精製された酵素の製造のための効果的な方法を提供することを示す。当該G71細胞系は、平均的な哺乳類細胞系において知られるより高い値の高マンノースリン酸化反応を有する蛋白質、及び低レベルの非リン酸化高−マンノースオリゴ糖を産生する。al.)において入手される分子と比較され、そしてそれは、複合体オリゴ糖を含まず、及び高マンノースオリゴ糖のみを示す。0161非リン酸化高−マンノースの値を決定するために、いわゆる当業者は、販売されたオリゴ糖のエキソグリコシダーゼ配列(“FACE配列”)を使用し得、非リン酸化高−マンノースオリゴ糖鎖のパーセンテージを特定する。通常のロット販売のFACE探査ゲル上で、非リン酸化高マンノースは、特定の複合体オリゴ糖(例えば、オリゴマンノース6、及び完全にシアル化された2分岐の複合体)と、共に移動する。非リン酸化高マンノースは、酵素的シークエンスにより他のオリゴ糖と区別される。0162当該精製された組換え蛋白質が、増大されたリン酸化を示すのかどうか特定するために、当該蛋白質に関するマンノース−6−ホスフェイトの値を測定し、並びに、当該マンノース6−リン酸受容体への酵素の結合も測定した。0163精製された、当該2つの形質転換された細胞系由来の組換え酵素である、G71CIN11及びDUBX11を、蛍光ラベル糖鎖電気泳動分析システム(FACE)により、及びMPR−セファロース樹脂に関するクロマトグラフィーにより分析した。測定するためにポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用する。37(43):151154−61(1998))の相対強度は、蛋白質1モルあたりのリン酸化値の信頼性のある測定値を与える。GAAのわずか6.7%がO7Pであることを示す(図5)。GAAに起因すると考えられることも示した(図5)。結合はごくわずかであることもまた示した(図6)。図5図60164これらの結果は、他のCHO細胞系よりもG71細胞により産生された酵素における方がマンノース6−ホスフェイトの値において約3倍高かったことを示す。このように、リソソーム酵素でトランスフェクトされたG71細胞は、高リン酸化酵素を効率的に産生し、これらの酵素における高マンノース残基の低減した値を導き、そしてそれは、細胞上のMPRによる増大された取り込みを導き得る。0165実施例VIポーンプ線維芽細胞へのrhGAAの取り込み当該精製されたGAA蛋白質が細胞上の当該MPRへ効率的に結合するかどうか測定するために、リソソームに障害のあるポーンプ病の患者から入手した細胞を、組換え高リン酸化GAAを結合するためのそれらの能力について、評価した。データ等)を元に構成されています。出典元のデータには一部間違いやノイズがあり、情報の正確さについては保証致しかねます。一時的に、各データの収録範囲や更新周期によって、一部の情報が正しく表示されないことがございます。当サイトの情報を元にした諸問題、不利益等について当方は何ら責任を負いかねることを予めご承知おきのほど宜しくお願い申し上げます。”未来を創るためのプラットフォーム”astamuseは、世界中で未来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