酵素の生物学的活性を有するヒト蛋白質又は酵素の断片、又は当該ヒト蛋白質又は酵素と実質的アミノ酸配列相同性を有するペプチドである。ある態様において、当該酵素物質は、ヒト又は哺乳類の配列、起源又は誘導である蛋白質である。他の態様において、当該酵素又は蛋白質は、その障害(欠損)が、ポーンプ病の如きヒトの疾患を生ずるようなものである(例えばα−グルコシダーゼ)。他の態様において、当該酵素は、その薬効のため選択される。0012当該酵素又は蛋白質は、ヒト又は哺乳類の配列、起源又は誘導のものでもある。本発明のさらに他の態様において、その各態様において、当該酵素又は蛋白質は、ヒト又は哺乳類ポリペプチドのアミノ酸配列の対応部分とアミノ酸配列において一致する。他の態様において、当該ポリペプチド部分は、ヒト又は哺乳類由来の天然蛋白質である。他の態様において、当該ポリペプチドは、当該ヒト又は哺乳類酵素の天然酵素配列に対して、当該ポリペプチドの少なくとも25、50、100、150、又は200アミノ酸に渡る長さ、又は全長の実質的な相同性(すなわち、アミノ酸配列において、少なくとも80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%、又は99%の一致。他の態様において、当該酵素が投与される対象は、人間である。0013好ましい態様において、当該酵素は、ヒト組換えリソソーム酵素であって、エンドソ−ム酸性化欠損細胞系により産生されるものである。好ましい態様において、当該ヒト組換え体は、蛋白質1モルあたり少なくとも0.7ビス−リン酸化オリゴマンノース鎖を超える、リン酸化オリゴ糖の高い値を有し、及び低レベルの非リン酸化高マンノース型オリゴ糖を有する。好ましい態様において、当該酵素は、高リン酸化ヒト組換え酸性αグルコシダーゼ(rhGAA)である。0014第4態様において、本発明は、本発明の方法により産生される当該リソソーム酵素を精製する方法を提供する。好ましい態様において、酵素を、4つのステップを含む3カラム法(ブルー−セファロース、q−セファロース、フェニル−セファロース)を使用して精製した:ろ過された収穫物を、最初に、余計に混じった蛋白質の沈殿を誘導するためにpH調整する。可溶性物質を、実施例において記載するような染料−リガンド、アニオン交換及び疎水性樹脂における連続クロマトグラフィーにより分離する。0015第5態様において、本発明は、リソソーム酵素の欠損により全て又は一部引き起こされる疾患の治療方法を提供する。態様において、当該方法は、本発明の方法により産生される治療酵素を投与することを含み、ここで、当該酵素は、MPR受容体と結合し、そして当該細胞膜を通過し輸送され、当該細胞内へ入り、そして当該細胞内のリソソームへデリバリーされる。変異体を、単独で又は医薬として許容される担体と組み合わせて投与することを含む。他の態様において、当該方法は、生体内で、1又は複数の当該宿主細胞の中に全長リソソーム酵素又はそれらの断片、変異体又は突然変異体をコードする核酸配列を転移することを特徴とする。好ましい態様は、治療される対象、好ましくは哺乳類、そして最も好ましくはヒトの必要とする用量を、当該病徴を最も効果的に改善するために最適化することを含む。ゴーシェ病、クラッベ病、ポーンプ病、CLN2、ニーマン−ピック病、及びテイ−サックス病である。他の態様において、本発明は、リソソーム蓄積症を引き起こす欠損蛋白質又は酵素を含む、医薬組成物もまた提供する。シンドラー病、及びシアル酸蓄積病である。III型、MLD又はGM1である。0018さらに他の態様において、本発明は、酵素補充療法の必要のある対象に治療有効量の融合体又は複合体を投与することによる酵素補充療法を提供する、ここで、当該患者の細胞は、当該細胞に対する損傷を阻害又は低減するために不十分な量の酵素を含むリソソームを有しており、そのため、十分量の酵素が、当該細胞に損傷を阻害し又は低減するためにリソソームに入る。当該細胞は、CNSの範囲内か又はCNSなしであり、又はその内皮細胞が活性成分の拡散に対して密着結合によりきっちりと密封される毛細血管壁により、血中から埋め合わされる必要がないかもしれない。0019特定の態様において、本発明は、標的リソソーム内で低減され、不十分であり、又は存在せず、及び当該対象に投与される生物学的活性を有する活性物質を含む化合物を供給する。γ−サブユニット、アルファ−L−イズロニダーゼ、イズロネート−2−スルファターゼ、ヘパラン−N−スルファターゼ、アルファ−N−アセチルグルコサミニダーゼ、アセチルCoA:N−アセチルトランスフェラーゼ、N−アセチルグルコサミン6−スルファターゼ、ガラクトース6−スルファターゼ、アルファ−ガラクトシダーゼ、N−アセチルガラクトサミン4−スルファターゼ、ヒアルロノグルコサミニダーゼ、パルミトイル蛋白質チオエステラーゼ、トリペプチジルペプチダーゼI、酸性スフィンゴミエリナーゼ、コレステロール輸送、カテプシンK、ベータ−ガラクトシダーゼB、α−グルコシダーゼ、及びシアル酸輸送体を非制限的に含む。4−スルファターゼが、当該酵素である。0020好ましい態様において、本発明は、END3相補群細胞により産生されるヒト組換え酸性αグルコシダーゼ(rhGAA)を投与することによるポーンプ病の治療方法を提供する、ここで、当該rhGAAは、高レベルのリン酸化(酵素1モルあたりオリゴマンノースビス−リン酸塩の0.7超)、及び低レベルの高マンノース型オリゴ糖を有する。0021上記の疾患の治療のための薬剤の製造において、本発明の高リン酸化酵素の対応する使用であって、好ましくは本発明の方法により産生される当該酵素の使用もまた企図される。0022第6の態様において、本発明は、組換え治療酵素を含む医薬組成物を提供し、ここで当該酵素は、そのような酵素における欠損により全て又は一部を引き起こす疾患の治療に有用である。全長酵素又はそれらの断片、変異体、又は突然変異体であって、リソソーム酵素欠損の影響を受ける細胞内へ生体内で投与され得るものをコードする核酸配列を特徴とする態様は、この態様の範囲内である。本発明は、標的リソソームに効果的であり、そしてそれ故、治療効果のある高リン酸化リソソーム酵素製剤の要件と、リソソーム酵素のラージスケール生産の必要性を調整する方法の発見に関する。0024リソソーム酵素オリゴ糖上のマンノース6−リン酸マーカーの存在に加えて、酵素のリソソーム経路は、トランスゴルジ層板の末端から浮上する輸送エンドソームの酸性化に決定的に依存する。43(3):316−21(1987))。3(2):94−103,2002)。このATPaseの不足は、リソソーム経路を犠牲にして、リソソーム酵素の分泌の強化を予想させる。当該小胞ATPaseにおける欠損を有する産生細胞系は、細胞内リソソーム区画へのリン酸化組換え酵素の非生産的な迂回路を阻害することが予想されるだろう。17(2):137−50(1991))。CHO−K1細胞は、化学的に突然変異を起こさせられ、そして毒素存在下、高温で生き残るように選択された。選択を避けるように選択された。当該原則としては、ある特定の毒素に抵抗性をもたらす予期しない変異の可能性が少ないのに、2つの全く異なる毒素に特異的な2つ同時に起こる予期しない変異の可能性はゼロである。選択は、温度感受性変異を達成するために、高温で実施された。この遺伝的スクリーニングは、高温で毒素に抵抗性のある2つの変異をもたらし、その内の1つは、G.7.1(G71)として指定された。G71の損傷(欠損)は、当該2つの毒素の吸収、及び作用メカニズムに関連なく発見された。それどころか、当該クローンは、高温でエンドソームを酸性化するための著しい不能を示した。興味深いことに、この不能は、より少ない程度ではあるけれども、許容温度(34°C)でも明らかとなった。al.,J.Biol.Chem.261(30):14154−9(1986))。鉄は、低pHでのみトランスフェリンから放出されるので、通常のトランスフェリン吸収にもかかわらず鉄に対する栄養要求は、エンドソーム酸性化における機能不全を示す。これらのデータは、エンドソーム酸性化の欠陥と一致した。al.,J.Biol.Chem.262(20):9883−6(1987))。G71に関するデータは、変異が、エンドソーム酸性化に関与する小胞ATPアーゼの不安定化をもたらすという結果と一致した。不安定化は、高温(39.5°C)で最も明らかであるが、低温(34°C)でさえ一部、表される。17(2):137−50(1991))は、双方の酵素が、高温で定量的に分泌され、そして当該酵素のグリコシル化は影響を受けないことを示した。リン酸化αグルコシダーゼの分泌は、許容温度で著しく強化されることに留意すべきである。0026このように、ヒト・リソソーム酵素を過剰発現するような、エンドソーム酸性化における欠陥のある変異体CHO細胞であるG71細胞の能力は、高リン酸化ヒト組換えリソソーム酵素のラージスケール生産メカニズムを提供する。定義のない限り、本明細書に使用される技術的、及び科学的全用語は、本発明の属する分野における当業者によって一般に理解され得るのと同じ意味を有するものとする。BIOLOGY(1991)。他の本明細書に挙げられた引用文献の内容全体を、本明細書中の記載と矛盾しない程度に、本願明細書中に援用する。0029本明細書、添付の請求項、図において使用されるような、単数形“a”、“an”、及び“the”は、文脈に明らかな指示のあるときを除いて、複数形を含むことに本明細書では注意すべきである。0030本明細書中に使用するとき、以下の用語は、別段の定めのない限り、それらに与えられた意味を有する。0031“対立遺伝子多型”は、同じ遺伝子座を占有する遺伝子の多形相のいずれかをいう。対立遺伝子変異は、当然ながら変異を通じて発生し、及び多形相の結果をもたらし得る。mRNA転写物由来のcDNA、並びにそれらによりコードされる蛋白質もまた言及する。0032“増幅”とは、例えば、逆転写、ポリメラーゼ連鎖反応、及びリガーゼ連鎖反応といった、ポリヌクレオチド配列をコピーし、そして、多くのポリヌクレオチド分子に拡大する、いずれの手段を言及する。0033もし、その配列が第1配列であるポリヌクレオチドが、その配列が第2配列であるポリヌクレオチドと特異的にハイブリダイズならば、当該第1配列は、第2配列に対する“アンチセンス配列”である。0034“cDNA”は、mRNAに対して相補的な又は同一のDNAであって、1本鎖又は2本鎖のいずれをも言及する。0035慣習的な表記法が、以下のポリヌクレオチドを記載するものとしてここに使用される:1本鎖ポリヌクレオチド配列の左手末端は、5’末端である;2本鎖ポリヌクレオチドの左手方向は、5’方向として言及される。新生RNAに対するヌクレオチドの5’から3’付加方向が、転写方向として言及される。mRNAと同一の配列を有するDNA鎖は、“コード鎖”として言及され;DNA鎖から転写されるmRNAと同一の配列を有するDNA鎖上の配列であって、そして当該RNA転写物の5’末端に対して5’に位置する配列は、“上流配列”として言及され;当該RNAと同一の配列を有するDNA鎖上の配列であって、そして当該RNA転写物の3’末端に対して3’に位置する配列は、“下流配列”として言及される。0036“相補的”とは、2つのポリヌクレオチドの相互作用表面の位相的な適合性又は共に適合することをいう。このように、当該2分子は、相補的として記載され得、そしてさらに、当該接触表面の特徴は、互いに相補的である。当該第1ポリヌクレオチドのヌクレオチド配列が、当該第2ポリペプチドのポリヌクレオチド結合パートナーのヌクレオチド配列と同一であれば、と第1ポリヌクレオチドは、第2ポリペプチドに対して相補的である。このように、5’−TATAC−3’の配列である当該ポリヌクレオチドは、5’−GTATAー3’の配列であるポリヌクレオチドと相補的である。対象のヌクレオチド配列に対する配列相補性が、実質的に一致するならば、ヌクレオチド配列は、関連ヌクレオチド配列に対して“実質相補的”である。0037“保存的置換”は、機能的に似ているアミノ酸で、アミノ酸のポリペプチドにおいて置換することをいう。以下の6グループは、お互いに保存的置換となる、アミノ酸を含む:1)アラニン(A)、セリン(S)、スレオニン(T);2)アスパラギン酸(D)、グルタミン酸(E);3)アスパラギン(N)、グルタミン(Q);4)アルギニン(R)、リジン(K)5)イソロイシン(I)、ロイシン(L)、メチオニン(M)、バリン(V);及び6)フェニルアラニン(F)、チロシン(Y)、トリプトファン(W)0038ポリペプチドへの言及に使用される際の用語“誘導体”は、ユビキチン化、標識化(例えば、放射性核種又は様々な酵素によるもの)、例えば、ペグ化(ポリエチレングリコールでの誘導)の如き共有ポリマー結合、及びヒトの蛋白質として通常生じないオルニチンの如きアミノ酸の化学的合成による挿入又は置換のような技術により、化学的に修飾されるポリペプチドをいう。0039細胞系への言及に使用される際の用語“誘導体”は、親細胞系の由来である細胞系をいい;例えば、この用語は、親細胞からパッセージ、又はサブクローンされ、及び所望の特性を保持し、突然変異させられ、そして当該所望の特性の保持について選択された親細胞系に由来し、及び異なる発現ベクター又は異なる外から加えられた核酸を含むように変えられた親細胞系に由来する細胞を含む。0040“検出”は、サンプル中に検体が存在するのか、しないのか又はその量を測定することをいい、サンプル中の1細胞につき又はサンプル中の検体の量を定量化することを含み得る。0041“検出可能部分”又は“標識”は、分光器の、光化学作用の、生化学的な、免疫化学的な又は化学的な手段により検出可能な組成物を言及する。(例えば、ELISAにおいて一般的に使用されるようなもの)、ビオチン−ストレプトアビジン、ジオキゲニン、ハプテン、及び抗血清又はモノクローナル抗体が入手できる蛋白質又は標的に相補的な配列を有する核酸分子を含む。当該検出可能な部分は、しばしば、サンプル中の測定可能な部分に結合する量を定量するために使用され得る測定可能シグナルであって、例えば、放射性、発色又は蛍光シグナルを産生する。当該検出可能な部分は、共有、又はイオンを通して、ファンデルワールス、又は水素結合のいずれか、例えば、ストレプトアビジンにより認識される放射性ヌクレオチド又はビオチン化ヌクレオチドの組み入れの如く、プライマー又はプローブに組み入れられ又は接合される。当該検出可能な部分は、直接的又は間接的に検出可能となり得る。結合パートナーのリガンドとなり得、例えば、ストレプトアビジンの結合パートナーであるビオチン、又は相補配列の結合パートナーであり、特異的にハイブリダイズできるヌクレオチド配列である。当該結合パートナーは、それ自身直接的に検出可能であり、例えば、抗体は、蛍光分子で、それ自身標識され得る。A.Klausner,Bio/Technology(1988)6:1165を参照のこと。シグナルの定量は、例えば、シンチレーションカウンティング、デンシトメトリー又はフローサイトメトリーにより達せられる。0042“診断”は、病態の存在又は種類を同定することを意味する。診断方法は、特異性、及び選択性の点で異なる。特定の診断方法は、症状の確定診断を提供し得ないとはいえ、当該方法が診断における支援となる建設的な指摘を提供するかどうかについては十分である。疾患に関して又は診断目的のために、所望の成果をもたらす十分な投与量を意味する。当該所望の成果は、当該用量の服用者において主観的又は客観的改善を含み得る。“治療有効量”は、健康上の所望の薬効を産生する有効な製剤の量を言及する。0044“コーディング”は、明確なヌクレオチド配列(すなわち、rRNA、tRNA、及びmRNA)か、明確なアミノ酸配列のいずれか、及びそれらからの生物学的特性を有する、生物学的プロセスにおける他のポリマー、及び高分子の合成の鋳型として役立つような、例えば、遺伝子、cDNA、又はmRNAといったポリヌクレオチドにおけるヌクレオチドの特定配列の自明事項を言及する。このように、遺伝子は、当該遺伝子より産生されたmRNA配列の転写及び翻訳が、細胞又は他の生物学的システム内で蛋白質を産生するという条件において、蛋白質をコードする。mRNA配列と一致し、及び通常配列リストに提供されるヌクレオチド配列である当該コード鎖、及び転写のための鋳型として使用される、当該遺伝子又はcDNAの非コード鎖の双方は、当該遺伝子又はcDNAの当該蛋白質又は他の産生物をコードするように言及され得る。別段の定めのない限り、“アミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列”は、互いの縮重型であって、及び当該同一のアミノ酸配列である全ヌクレオチド配列を含む。蛋白質、及びRNAをコードするヌクレオチド配列は、イントロンを含み得る。0045“等価線量”は、同量の活性化物質を含む投与量を言及する。0046“発現コントロール配列”は、影響を及ぼすようにそこに連関されたヌクレオチド配列の発現(転写、及び/又は翻訳)を調節する、ポリヌクレオチドにおけるヌクレオチド配列を言及する。“影響を及ぼすような連関”とは、ある部分の活性(例えば、転写を調整する能力)が、もう一方の他の部分に作用(例えば、当該配列の転写)をもたらす、2つの部分間の機能的な関係をいう。発現コントロール配列は、例えば、プロモーター配列(例えば、誘導可能又は構成的)、エンハンサー、転写ターミネーター、スタートコドン(すなわち、ATG)、イントロンのためのスプライシングシグナル、及びストップコドンを、非制限的に含み得る。0047“発現ベクター”は、発現させられるためのヌクレオチド配列に影響を及ぼすように連関する発現コントロール配列を含む組換えポリヌクレオチドを含む、ベクターをいう。発現ベクターは、発現のための十分なシス作用成分を含み;発現のための他の成分は、宿主細胞又は生体外発現システムにより供給され得る。発現ベクターは、本分野において知られる全ての当該ベクターを含み、例えば、コスミド、プラスミド(例えば、裸の又はリポソーム中に含まれるもの)、及び組換えポリヌクレオチドを組み入れられたウイルスである。0048“高リン酸化される”、“高レベルのリン酸化”、及び“リン酸化オリゴ糖の高い値”は、少なくとも70%の蛋白質が、リン酸化オリゴ糖を通してカチオン依存性マンノース6−リン酸受容体と結合する当該蛋白質の製造をいう。結合は、マンノース6−リン酸と競合するような感受性によりさらに特徴付けられる。高度にリン酸化された酵素は、蛋白質1モルあたり少なくとも0.7ビス−リン酸化オリゴ糖鎖を有する酵素もまた言及する。0049複数のポリヌクレオチド又はポリペプチド配列との関連で、用語“同一の”又はパーセント“同一性”は、最大一致のために比較及び整列されるとき、その後の配列比較アルゴリズムの内の1つを使用して又は目視検査により測定されるような、同一の又は同一のヌクレオチド又はアミノ酸残基の特定のパーセンテージを有する複数の配列又はサブシークエンスをいう。0050“リンカー”は、共有結合、又はイオン、ファンデルワールス又は水素結合を通じてのいずれかにより、2つの異なる分子であって、例えば、5’末端で一方の相補的配列と、及び3’末端で他方の相補的配列とハイブリダイズする核酸分子をいい、このように2つの非相補的配列を接合することをいう。0051“低レベルのリン酸化”又は“低リン酸化”は、線維芽細胞の中への吸収が、10nM超の最大濃度の半分を有し又はman6−P受容体カラムに結合する酵素のフラクションが30〜50%未満である蛋白質の製造をいう。0052“低レベルの非リン酸化高マンノースオリゴ糖”は、各蛋白質分子が、ヒト−マンノースオリゴ糖の代わりに複合オリゴ糖の少なくとも1分子を有する蛋白質の製造をいう。複合オリゴ糖は、他の糖に加えて、ガラクトース、アセチルグルコサミン(GlcNAc)、及びシアリン酸を含む。0053対象に適用されるような“天然”とは、対象が自然に見出され得る事実をいう。自然の起源から単離され、及び研究室内の人間により意図的に修飾され得ない組織(ウイルスを含む)内に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、天然由来である。0054“医薬組成物”とは、ヒト、及び哺乳類を含む、対象動物において、医薬としての使用として好適な組成物をいう。医薬組成物は、薬理学的有効量の治療酵素を含み、及び医薬として許容される担体もまた含む。形成する不活性成分、並びに、直接的又は間接的に、複数の当該成分の組み合わせ、複合体又は凝集体、又は複数の当該成分の解離、又は複数の当該成分の反応又は相互作用の他の型に起因するいずれの製品を含む組成物を包含する。従って、本発明の医薬組成物は、本発明の共役化合物と医薬として許容される担体との混合により製造されるいずれの組成物をも包含する。D形グルロースの5%水溶液、及び油/水又は水/油の乳濁液の如き乳濁液、及び湿潤剤及び/又はアジュバントの様々な型である。CO.,Easton,1995)に記載される。好ましい医薬組成物は、当該活性成分の投与の意図する形態に依存する。腹腔内投与;又は局所性、経皮、又は経粘膜的投与)を含む。“医薬として許容される塩”は、医薬として使用されるための化合物中に配合され得る塩をいい、例えば、金属塩(ナトリウム、カリウム、マグネシウム、カルシウムなど)、及びアンモニア又は有機アミンの塩を含む。0056“ポリヌクレオチド”は、ヌクレオチドユニットからなるポリマーをいう。ポリヌクレオチドは、天然由来の核酸であって、例えば、デオキシリボ核酸(“DNA”)、及びリボ核酸(“RNA”)、並びに核酸類似物を含む。核酸類似物は、当該天然由来のホスホジエステル結合以外の他のヌクレオチドとの連鎖に従事する、非天然由来の塩基、ヌクレオチドを含み、又はホスホジエステル結合以外の連鎖を通じて接合される塩基を含む当該核酸類似物を含む。このように、ヌクレオチド類似物は、例えば、ホスホロチオエート、ホスホロジチオエート、ホスホロトリエステル、ホスホラミデート、ボラノホスフェイト(boranophosphate)、メチルホスホネート、キラル−メチルホスホネート、2−O−メチルリボヌクレオチド、ペプチド−核酸(PNAs)などを非制限的に含む。そのようなポリヌクレオチドは、例えば、自動DNA合成装置を使用して合成され得る。当該用語“核酸”は、大きなポリヌクレオチドを典型的にいう。当該用語“オリゴヌクレオチド”は、短いポリヌクレオチドであって、一般的には約50ヌクレオチドと同じくらいのものを典型的にいう。ヌクレオチド配列がDNA配列(すなわち、A、T、G、C)により表示されるとき、これは、“U”が“T”に置き換わるRNA配列(すなわち、A、U、G、C)をも含むものと理解されるであろう。0057“ポリペプチド”は、天然由来の構造的異種及び人工の非天然由来のそれらの類似物に関連し、ペプチド結合を経由して結合する天然由来の構造的異種及び人工の非天然由来の類似物に関連する、アミノ酸残基からなるポリマーをいう。”は、典型的に、大きなポリペプチドをいう。当該用語“ペプチド”は、典型的に短いポリペプチドをいう。慣習的な表記法が、ポリペプチド配列を表現するために本明細書中に使用される:ポリペプチド配列の当該左手末端は、アミノ末端であり;ポリペプチドの右手末端は、カルボキシ末端である。0058“プライマー”は、指定されたポリヌクレオチド鋳型への特異的ハイブリダイジングを可能とし、及び相補的ポリヌクレオチドの合成のための開始点を供給することを可能とするポリヌクレオチドをいう。そのような合成は、当該ポリヌクレオチド・プライマーが合成を誘導する条件下に置かれたときに生じ、当該条件とは、すなわち、ヌクレオチド、相補的ポリヌクレオチドの鋳型、及びDNAポリメラーゼの如き重合のための物質の存在下である。プライマーは、典型的に1本鎖であるが、2本鎖であり得る。プライマーは、典型的にデオキシリボ核酸であるが、広範な、合成及び天然由来のプライマーが、多くの用途において有用である。プライマーは、当該鋳型に対して相補的であり合成の開始部位として役立つためにハイブリダイズするよう設計されるが、当該鋳型の正確な配列を反映する必要はない。そのような場合において、当該鋳型に対する当該プライマーの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プライマーは、例えば、発色性の、放射性の、又は蛍光性の部分で標識化され得、そして検出可能な部分として使用され得る。0059ポリヌクレオチドに関して使用される際の“プローブ”は、指定された他のポリヌクレオチドの配列に対して特異的ハイブリダイゼーションを可能とするポリヌクレオチドをいう。プローブは、標的相補的ポリヌクレオチドに特異的にハイブリダイズするが、当該鋳型の正確な相補的配列を反映する必要はない。そのような場合において、当該標的に対する当該プローブの特異的ハイブリダイゼーションは、ハイブリダイゼーション条件のストリンジェンシーに依存する。プローブは、例えば、発色性の、放射性の、又は蛍光性の部分で標識化され得、そして検出可能な部分として使用され得る。0060“予防的”治療は、病変に発展するリスクを低減するために、疾患の兆候を表していない又は初期兆候のみを表す被験者に投与される治療である。本発明の化合物は、病変を発達させる可能性を低減するために、又はもし発達するならば、当該病変の重症度を最小化するための予防的治療として与えられる。0061“組換えポリヌクレオチド”は、天然には共に結合されない配列を有するポリヌクレオチドをいう。増幅された又は組み合わされた組換えポリヌクレオチドは、好適なベクター内に含まれ得、そして当該ベクターは、好適な宿主細胞を形質転換するために使用され得る。当該組換えポリヌクレオチドを含む宿主細胞は、“組換え宿主細胞”として言及される。組換えポリヌクレオチドは、非コーディング機能(例えば、プロモーター、複製起点、リボソーム結合部位など)もさらに供給する。0062“特異的にハイブリダイズする”又は“特異的ハイブリダイゼーション”又は“選択的にハイブリダイズする”は、配列が複合混合物の(例えば、総細胞の)DNA又はRNA内に存在する際、ストリンジェント条件下、特定のヌクレオチド配列に対して選択的に核酸分子が結合すること、2本鎖となること、又はハイブリダイズすることをいう。0063当該用語“ストリンジェント条件”は、プローブが、その標的サブシークエンスと選択的にハイブリダイズし、他の配列とはより少ない程度で、又は全くハイブリダイズしないであろう条件をいう。サザン、及びノザンハイブリダイゼーションの如き、核酸ハイブリダイゼーション実験に関連する“ストリンジェント・ハイブリダイゼーション”、及び“ストリンジェント・ハイブリダイゼーション洗浄条件”とは、配列依存性であり、異なる環境パラメーターの下で異なる。Yorkの中に見出される。一般的に、高ストリンジェント・ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は、確定したイオン強度及びpHで、特定の配列の融点温度(Tm)よりも約5°C低く選択される。当該Tmは、標的配列の50%が(確定したイオン強度及びpHの下で)完全に対応するプローブとハイブリダイズする温度である。非常にストリンジェントな条件は、特定のプローブのTmと同等にすることを選択される。0064サザン又はノザン・ブロットにおいてフィルター上に100超の相補的残基を有する相補的核酸のハイブリダイゼーションのためのストリンジェント・ハイブリダイゼーション条件の例は、一晩中ハイブリダイザーションが実施されるとき、42°Cで、ヘパリン1mgを有する50%ホルマリンである。高ストリンジェント洗浄条件の例は、0.15MのNaCl、72°Cで、15分間である。bufferを参照のこと)。高ストリンジェント洗浄は、バックグラウンドのプローブ・シグナルを除去するために、低ストリンジェント洗浄により先行される。100超のヌクレオチドの2本鎖に対する例示的な中程度ストリンジェント洗浄は、1×SSC、45°Cで、15分間である。100超のヌクレオチドの2本鎖に対する例示的な低ストリンジェント洗浄は、4−6×SSC、40°Cで、15分間である。一般的に、特定のハイブリダイゼーション分析における非関連プローブに観察されるよりも2×(又はより高い)の信号対雑音比は、特異的なハイブリダイゼーションの検出を示唆する。0065診断又は治療の“被験者”は、ヒト、又は哺乳類又は霊長類を含むヒトではない動物である。00662つの核酸又はポリペプチドに関連する当該句“実質相同”又は“実質同一”は、一般的に、複数の配列又はサブシークエンスであって、後述の配列比較アルゴリズムの内の1つを使用して又は目視検査より測定されるような最大一致として比較、及び整列させたときに、少なくとも40%、60%、80%、90%、95%、96%、97%、98%又は99%のヌクレオチド又はアミノ酸残基の同一性を有することである。好ましくは、当該実質同一は、少なくとも長さ約50残基である当該配列対領域に渡り、より好ましくは少なくとも約100残基の領域に渡り存在し、そして最も好ましくは、当該配列対は、約150残基に渡り実質同一である。好ましい態様において、当該配列対は、比較の生体高分子対(バイオポリマー)のどちらか又は双方の全長に渡り、実質同一である。0067配列比較のために、典型的に、ある配列は、検査配列が比較される参照配列として作用する。配列比較アルゴリズムを使用するとき、検査及び参照配列は、コンピューターに入力され、もし必要であれば、部分配列の座標が指定され、そして配列アルゴリズムプログラムのパラメーターが指定される。当該配列比較アルゴリズムは、次いで、当該指定されたプログラムパラメーターに基づいて、当該参照配列と比較する当該検査配列についてのパーセント配列同一性を計算する。al.,supra)により実施される。0069有用なアルゴリズムの1つの例は、PILEUPである。PILEUPは、関連性、及びパーセント配列同一性を示すための連続的な、対合する整列を使用して、関連する配列群から多配列整列を創造する。それは、当該整列を創造するために使用されるクラスタ化関連を示す系図又は系統樹をもプロットする。PILEUPは、Feng&Doolittle,J.Mol.Evol.35:351−360(1987)の連続的整列方法の単純化したものを使用する。5:151−153(1989)により記載された方法と類似する。当該プログラムは、各最長5,000ヌクレオチド又はアミノ酸の長さで、300配列まで整列することができる。多重整列の手順は、2つの整列させた配列の集団を作り出し、2つの最も類似する配列の対合する整列から始める。この集団は、次いで、整列配列の、次に最も関連する配列又は集団と整列させられる。2つの配列集団は、2つの個々の配列の対合する整列の単純拡大により整列させられる。最終的な整列は、一連の、連続性の対合する配列により達成される。当該プログラムは、特定の配列、及び配列比較領域についてのそれらのアミノ酸又はヌクレオチドの組み合わせを指定することにより、及び当該プログラムのパラメーターを指定することにより実行される。参照配列は、以下のパラメーターを使用する配列同一性関連のパーセントを決定するために、他の検査配列と比較される。当該パラメーターは、デフォルトギャップ重量(3.00)、デフォルトギャップ全長重量(0.10)、及び荷重した最終ギャップである。22:4673−4680(1994))である。al.J.Mol.Biol.215:403−410(1990)に記載される。BLAST分析を実施するためのソフトウェアは、全米バイオテクノロジー情報センターから公的に入手できる(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)。このアルゴリズムは、検索要求配列における、長さWの短いワードを同定することによる点数の高い配列ペア(HSPs)を第1に同定することを含み、そしてそれは、データベース配列中の同じ長さのワードと整列させたとき、正値の最低基準スコアTに適合するか満足させるかのいずれかである。これらの初期の近傍ワードスコアのヒットは、それらを含むより長いHSPsを見出すための開始検索の種として作用する。当該ワードのヒットは、累積整列スコアが増加され得る限り各配列に沿って双方向に拡張される。累積スコアは、ヌクレオチド配列として、パラメーターM(適合残基ペアとしての報酬スコア;常に>0)、及びN(不適合残基としてのペナルティスコア;常に>0)を使用して計算される。アミノ酸配列について、得点マトリクスは、当該累積スコアを計算するために使用される。各方向におけるワードヒットの拡張は、以下のとき停止され、それは:当該累積整列スコアが、その得られた最大値から数量X単位で減少するとき;当該累積スコアが、1又は複数の負のスコアである残基整列の蓄積に起因して、ゼロ又はそれ以下となるとき;又は各配列の末端に至るときである。当該BLASTアルゴリズムのパラメーターである、W、T、及びXは、当該配列の感受性及びスピードを決定する。BLASTNプログラム(ヌクレオチド配列用)は、ワード長(W)の11、期待値(E)の10、M=5、N=4、及び双方の鎖の比較を初期設定として使用する。89:10915(1989)を参照のこと。90:5873−5787(1993)を参照のこと。当該BLASTアルゴリズムにより提供された類似の測定値は、最小合計確率(P(N))であって、2つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の適合が偶然生ずることによる確率の指摘を提供する。当該参照配列と当該検査配列との比較における当該最小合計確率が、約0.1未満、さらに好ましくは約0.01未満、及び最も好ましくは約0.001未満であるならば、核酸配列は参照配列と類似すると考えられる。00722つの核酸配列又はポリペプチドが実質的に同一であるという更なる兆候は、第1の核酸によりコードされるポリペプチドが、以下に記載されるように、第2の核酸によりコードされるポリペプチドと免疫学的に交差反応性であることである。このように、例えば、当該2つのペプチドが同類置換によってのみ異なるとき、ポリペプチドは、第2ポリペプチドに対して、典型的に、実質同一である。2つの核酸配列が実質的に同一であるという他の兆候は、当該2つの分子が、本明細書に記載のようなストリンジェント条件の下、互いにハイブリダイズすることである。0073“実質的に純粋”又は“単離された”は、対象の種が、存在する主要な種である(すなわち、モル濃度基準で組成物中の他の個々の高分子の種より豊富である)ことを意味し、そして十分に精製された画分は、当該対象の種が存在する全高分子の種の少なくとも50%(モル濃度基準)を含む組成物である。一般的に、実質的に純粋な組成物は、存在する全高分子の種の約80%〜90%又はそれ以上が当該着目の精製された種であることを意味する。当該組成物が単一の高分子の種から本質的になるならば、当該対象の種は、精製され、本質的な均質性(混入物質種が、慣習的検査方法により当該組成物中に検出され得ない。溶媒種、小分子(<500ダルトン)、安定剤(例えばBSA)、及び元素イオン種は、この定義のため高分子種とはみなされない。ある態様において、本発明の複合体は、実質的に純粋であり又は単離される。ある態様において、本発明の複合体は、それらの合成において使用される高分子出発材料に対して実質的に純粋であり、又は単離される。ある態様において、本発明に医薬組成物は、実質的に精製された又は単離された治療酵素であって、1又は複数の医薬として許容される賦形剤と混合された当該酵素を含む。0074“治療上の”措置は、兆候又は症状を低減する又は消去するために、病変の兆候又は症状を表す被験者に投与する措置である。当該兆候、及び症状は、生化学的、細胞の、組織学の、機能的な、主観的な又は客観的なものである。本発明の化合物は、治療措置として又は診断のために与えられ得る。0075“治療指数”は、最小治療量超、かつ非許容毒素量未満の用量範囲(量、及び/又はタイミング)をいう。0076“措置、治療”は、予防的治療又は治療上の措置又は診断治療をいう。0077本明細書中に使用される用語“ユニット剤形”は、ヒト及び動物の被験者への単一の調剤として好適な物理的に別個のユニットをいい、各ユニットは、医薬として許容される希釈剤、担体又は媒体に関連して、所望の効果を作り出すために十分な量において計算された本発明の所定の多数の化合物を含む。本発明の新規ユニット剤形の仕様は、使用される特定の複合体、及び当該得られる効果、宿主内の各化合物に関連した薬力学に依存する。0078II.リソソーム酵素の製造ある態様において、本発明は、リソソーム酵素の治療上の使用を可能とする量の当該酵素の新規製造方法を特徴付ける。一般的に、当該方法は、全長のリソソーム酵素又は生物学的に活性のある断片、変異体又はそれらの突然変異体をコードするcDNAを有する好適な細胞系の形質転換を特徴付ける。いわゆる当業者は、好適な形質転換された細胞系におけるそのようなリソソーム酵素の最適な製造について本明細書中に特に記載されるもの以外の発現コンストラクトを製造し得る。天然に生じるリソソーム酵素の突然変異体であって、当該天然に生ずる全長酵素と類似する生物学的活性を有する当該突然変異体をコードするcDNAを容易に設計し得る。蛋白質を製造するために使用される宿主細胞は、治療的な当該酵素の使用を可能とする量のリソソーム酵素を製造する能力により特徴付けられる、エンドソ−ム酸性化欠損細胞系である。本発明は、G71に指定される、CHO−K1−由来のEND3相補群細胞系を提供する。当該発明は、さらにサブクローンされるG71細胞系、又はG715、及びG71GAA2に各々指定される、異なる発現プラスミドを含むG71細胞系をも提供する。0080当該キメラ蛋白質をコードするDNA又はRNAを含み及び発現する細胞は、本明細書中に、遺伝子組換えされている細胞として言及される。当該キメラ蛋白質をコードするDNA又はRNAを含み及び発現する哺乳類細胞は、遺伝子組み換えされている哺乳類細胞として言及される。bombardment)、リン酸カルシウム沈殿、改良リン酸カルシウム沈殿、陽イオン性脂質処理、フォトポレーション(photoporation)、フュージョン法、受容体仲介トランスファー、ポリブレン沈殿である。当該DNA又はRNAは、ウイルスベクターでの感染により導入される。Therapy”(1994年4月20日出願)である。これらの各出願の教示は、その内容全てを本願明細書中に特に援用する。0081好ましい態様において、蛋白質を製造するために使用される当該宿主細胞は、治療的に当該酵素の使用を可能とする量のリソソーム酵素を製造する能力により特徴付けられる、エンドソ−ム酸性化欠損細胞系である。好ましい態様において、本発明は、G71に指定される、CHO−K1−由来のEND3相補群細胞系であって、“定義”に特定されるような、高リン酸化リソソーム酵素の高収率を可能とし、それ故、治療上のリソソーム酵素のラージスケール製造を可能とする、当該細胞系を提供する。好ましい態様において、当該細胞系は、組換えリソソーム酵素を、約1ピコグラム/細胞/日又はそれ以上の量で、発現及び分泌する。0082ベクター及び核酸コンストラクト当該キメラ蛋白質を発現するために使用される核酸コンストラクトは、当該トランスフェクトされた哺乳類細胞中で、染色体外的に(エピソーム的に)発現するもの、又は、当該受容体細胞のゲノム中に、不規則か、又は相同的組換えを通して事前に選択された標的部位かのどちらかで、組み入れられるものである。染色体外で発現された構築物(コンストラクト)は、キメラ蛋白質のコード配列に加えて、当該細胞中で当該蛋白質を十分発現するための配列、及び場合により、当該コンストラクトの複製配列を含む。それは、典型的に、プロモーター、キメラ蛋白質エンコーディングDNA、及びポリアデニル化部位を含む。当該キメラ蛋白質をコードするDNAは、当該コンストラクト中で、その発現が当該プロモーターの制御下におかれるように配置される。場合により、当該コンストラクトは、追加成分を含み得、当該追加成分は、例えば、以下に挙げるものの1又は複数のものである:スプライス部位、エンハンサー配列、適切なプロモーターの制御下における選択可能マーカー遺伝子、及び適切なプロモーターの制御下における増幅可能なマーカーである。0083当該DNAコンストラクトが当該細胞ゲノム中に組み入れられる態様において、それは、当該キメラ蛋白質エンコーディング核酸配列のみを含むことを必要とする。マーカー、及び/又は受容細胞中のゲノムDNAと相同のDNAを、当該ゲノム中の選択部位への当該DNAの標的組み入れとして、含み得る。0084細胞培養方法キメラ蛋白質をコードするDNA又はRNAを含む哺乳類細胞は、当該細胞の成長、及びDNA又はRNAの発現に適した条件下で培養される。キメラ蛋白質を発現するそれらの細胞は、知られた方法及び本明細書に記載される方法を使用して同定され、そしてキメラ蛋白質は、知られた方法及び本明細書に記載される方法をも使用して、キメラ蛋白質製造の増幅を伴うか、伴わないかのいずれかで単離され、そして精製され得る。同定は、例えば、キメラ蛋白質をコードするDNA又はRNAの存在を示す表現型を表す遺伝的に改良された哺乳類細胞のスクリーニングを通して実施され、例えば、PCRスクリーニング、サザンブロット分析によるスクリーニング、キメラ蛋白質の発現としてのスクリーニングである。キメラ蛋白質をコードするDNAを組み入れられた細胞の選択は、当該選択可能な遺伝子を発現する細胞のみの生き残りに適した条件下で、当該DNAコンストラクト中に選択可能なマーカーを組み入れ、選択可能なマーカー遺伝子を含むトランスフェクト又は感染させた細胞をその後培養することにより達成される。当該導入されたDNAコンストラクトの増幅は、適した条件下(例えば、増幅可能なマーカー遺伝子の多数のコピーを含む細胞のみが生き残ることができる薬物濃度の存在下で、増幅可能な遺伝子を含む遺伝的に改良された哺乳類細胞を培養すること)で、遺伝的に改良された哺乳類細胞を培養することにより影響され得る。0085当該キメラ蛋白質を発現している遺伝的に改良された哺乳類細胞は、本明細書に記載されるように、発現産物の検出により同定され得る。高リン酸化酵素を発現する哺乳類細胞は、サンドウィッチ酵素免疫学的検定により同定され得る。0086リソソーム酵素の変異体ある態様において、高リン酸化リソソーム酵素の類似体及び変異体が製造され得、そして高リン酸化リソソーム酵素が使用され得る様々な適用において有用となるであろう。欠損型の変異体は、天然蛋白質の、機能又は免疫原性活性に必要不可欠ではない1又は複数の残基を欠損する。欠損変異体の一般型は、分泌シグナル配列の欠損型、又は細胞の特定部分に結合するための蛋白質に直接作用するシグナル配列の欠損型である。挿入型変異体は、典型的に、当該ポリペプチドの非末端部分での構成要素の追加を含む。これは、免疫反応性エピトープ又は単に単一残基の挿入を含み得る。末端への追加は、融合蛋白質ともいわれ、以下に議論する。0087変異体は、上記のような非改良リソソーム酵素と、実質的に相同又は実質的に同一であり得る。好まれる変異体は、当該リソソーム酵素の少なくともいくつかの生物学的活性、例えば、触媒活性を残す、高リン酸化ポリペプチドの変異体である。グルコシダーゼのポリペプチドの変異体を含む。0088置換型変異体は、当該蛋白質内の1又は複数の部位で、他の野生型のあるアミノ酸を別のものに、典型的に交換し、及び、当該ポリペプチドの1又は複数の特性、例えば蛋白分解の開裂に対する安定性を、他の機能又は特性の欠損なしに、調節するよう設計され得る、この種の置換は、好ましくは同類置換であり、すなわち、1つのアミノ酸は、似たような形及び電荷を有するものの内の1つと置換される。同類置換は、本分野においてよく知られ、そして、例えば:アラニンのセリンへの;アルギニンのリジンへの;アスパラギンのグルタミン又はヒスチジンへの;アスパラギン酸塩のグルタミン酸塩への;システインのセリンへの;グルタミンのアスパラギンへの;グルタミン酸塩のアスパラギン酸塩への;グリシンのポロリンへの;ヒスチジンのアスパラギン又はグルタミンへの;イソロイシンのロイシン又はバリンへの;ロイシンのバリン又はイソロイシンへの;リジンのアルギニンへの;メチオニンのロイシン又はイソロイシンへの;フェニルアラニンのチロシン、ロイシン又はメチオニンへの;セリンのスレオニンへの;スレオニンのセリンへの;トリプトファンのチロシンへの;チロシンのトリプトファン又はフェニルアラニンへの;及びバリンのイソロイシン又はロイシンへの変換を含む。基質結合潜在性に関連する重要な情報をもたらすだろう。保持するが、基質結合活性を増大又は低減させるように、産生されることが企図される。そのようなものとして、当該活性部位又は触媒領域の変異は、変化された基質結合活性を有する蛋白質変異体を産生するために、特に企図される。そのような態様において、当該高リン酸化リソソーム酵素の配列は、他の関連酵素と比較され、そして選択された残基は、特に変異させられる。J.289(Pt3):681−6,1993)。Genet.53(Pt2):177−8,1989)。そのような変異は典型的であると考慮して、いわゆる当業者は、当該酵素配列の他の変異は、この蛋白質及びその活性について、さらなる構造的、及び機能的情報を提供するために作成され得ることを認識するだろう。0091上記のような変異体を構築するために、いわゆる当業者は、よく知られる標準的技術を使用し得る。びにランダム及びポイント変異生成である。存在を利用する欠損変異生成型である。当該DNAは、当該部位で開裂され、そして当該切断末端は、BAL31、エキソヌクレアーゼIII、DNアーゼI、及びS1ヌクレアーゼの如きヌクレアーゼにより分解される。様々な大きさの欠損を有する一連のDNAを製造する。そのような変異体から発現する蛋白質は、適した生物学的機能、例えば酵素活性を、当該分野における標準技術を使用して分析され得、本明細書中に記載される。類似の技術が、2つの適切に配置された制限酵素認識部位を使用することによる内部欠損変異体について使用され、その結果、正確に定義される欠損を作成すること、及び上記のように末端を再結合することを達成し得る。0093部分消化変異体もまた企図される。cutter)”を使用するだろう。このように、様々な反応条件により、様々な大きさの一連の変異体を産生することが可能となり、そして次いで活性についてスクリーニングされるだろう。0094無作為な挿入変異は、例えばDNアーゼIでDNA配列を切断すること、及び3、6、9、12個などのアミノ酸をコードするヌクレオチドの伸長を挿入し当該末端を再びライゲートすることによっても実施され得る。そのような変異が製造されると、当該変異体は、野生型蛋白質により与えられる様々な活性について審査され得る。0095点突然変異は、特に、どのアミノ酸残基が、リソソーム酵素の生物学的活性に関連する活性に特別に重要であるか同定するためにも使用され得る。このように、当業者は、DNA鎖中の1塩基変化を産生し、変化されたコドン及びミスセンス変異の結果を得るだろう。0096特定の蛋白質のアミノ酸は、等価な、それとも改良された第2世代分子を創造するために変化させられ得る。そのような変化は、例えば、基質分子又は受容体上の抗体の抗原結合領域又は結合部位の如き構造を有する相互作用的な結合能力のかなりの欠損なしに、与えられる蛋白質のアミノ酸の置換を企図する。蛋白質の生物学的機能活性を規定する事は、蛋白質の当該相互作用的な能力及び本質であるので、あるアミノ酸置換は、蛋白質配列、その基礎をなすDNAコーディング配列中に作り出され得、そして、にもかかわらず、類似の性質を有する蛋白質を得る。このように、様々な変化が、以下に記載のように、それらの生物学的有用性又は活性の相当な損失なしに、遺伝子のDNA配列中に作り出され得る。0097そのような変化を作り出す際に、アミノ酸の疎水性親水性指数が考慮される。DNA、抗体、抗原などの他の分子との、当該蛋白質の相互作用を順番に規定する。J.Mol.Biol.157(1):105−132,1982、本願明細書中に、この内容全てを援用する。