いずれにせよウェット技術者の腕の見せ所なのですよ。抗体のFc部位を利用した特殊な感作技術もありますが、Confidentialなのでここでは書かない事にします。診断薬用の抗体は、多くの場合ペプシンで消化して、Fc部位を除去したF(ab')2にプロセスします。今回はその具体的な方法を紹介します。酸性の緩衝液を用意します。実は抗体のクローンによって至適条件が違います。抗体を酸性の緩衝液に置換します。これには色々な方法があり、どれでもOKです。透析、脱塩カラム(PD-10みたいな)、限外濾過、など。最終的に抗体濃度を1mg/mLぐらいにします。ペプシンを溶解ペプシンを数mg秤量し、酸性の緩衝液で1mg/mLぐらいになるように溶解します。ペプシンは必ず、消化するpHの緩衝液で溶解してください。中性にするとペプシンは不可逆的に壊れるからです。ペプシンは自己消化を起こしますので、この作業は消化の直前に行います。抗体にペプシンを添加して、37°Cで保温します。添加量は抗体量の1/10~1/100ぐらい。時間は30分~1晩ぐらい。これも抗体のクローンによって至適条件が異なります。消化の終了pHを中性~弱アルカリ性にすれば消化は止まります。ペプシンはpH6以上で不活性化するといわれていますので、Trisなどの塩基を加えてpH7以上にします。ゲルろ過SephacrylやSuperdexのような、抗体分画に適したゲルろ過カラムに通し、100kDa付近に出てくるF(ab')2の分画を回収します。それより低分子量の分画には、Fc断片や血清・腹水由来のコンタミがありますので、ここで分離・除去します。この時、クロマト用のバッファーは20mM位のリン酸緩衝液(pH7.0、脱気済み)が一般的です。プロセスの邪魔になるような余計な添加物は入れない方が良いと思います。「はじめての抗体精製ハンドブック」で勉強しておきましょう。AKTAとか使うと簡単です。これでF(ab')2の精製は完了です。実はこの中に色々ノウハウがありますので、次回に続きます。今回は2のアフィニティ精製を説明します。AとかGで精製する方法ですね。Aに関わる裏話とかが、生化夜話にあるので勉強しましょう。実験室レベルでは、以下のように実施します。Aカラムとかに腹水を流します。これで抗体が吸着します。2.洗浄バッファーでコンタミを洗い流します。3.酸性の溶出バッファーで抗体を洗い流します。溶出液の回収容器にTrisとか入れておいて中和するようにします。塩析透析イオン交換するよりずっと簡単です。診断薬に使う抗体の場合は、この後クロマトをするステップがあるので、この段階で若干コンタミが残っても気にしない事が多いです。治療薬の場合には、コンタミがそのまま注射されるとどんな副作用が出るか分からないので、この段階でコンタミを徹底的に除去するように設計しなくちゃいけないそうです。大変ですけど、診断薬と治療薬では、抗体を使う目的が違うので、注意するポイントも違うんですよ。Aが外れてコンタミになったりしたそうです。今の製品は改良されていて大丈夫だと思いますが。あと使い捨てできるほど安価じゃない。何回ぐらいリサイクルして使えるのか、品質管理が難しい。いうわけで実験レベルでは良く使うけど、スケールアップや工程設計に苦労する一面もあります。AはマウスIgG1に対する結合力が弱いと言われている件、僕らの印象ではクローンごとに結合する・結合しにくいの違いがあります。抗体っていうのは、クローンが違ったら全く別の性質のタンパクと考えた方がいいほど個性が強いものなんですよ。事前の条件検討がすごく大事なんです。ウェットの実験者の腕の見せ所なんです。