開発するバイオ技術のブログ。誰かの役に立つかもしれない事を思い付くままに書いています。抗体の酵素標識(2)酵素へ抗体を結合マレイミド基を導入したALPができました。次に抗体を結合させます。2.SH基を使う方法の3まで実施しておきます。還元して定量するまでですね。ALPに抗体Fab'を、モル比でだいたい1:5になるように添加します。ここでポイントですが、ALPにマレイミド基が3~4個導入されますので、それより少し多いFab'を入れるようにします。Fab'をわざと余らせるようにするのです。これはマレイミド基を確実にブロックするためです。して一晩静置し、十分に反応させた後、ゲルろ過カラムに掛けます。右側のピークは余ったFab'です。これが含まれたままだとイムノアッセイ系に邪魔をしてしまいますので、確実に除去します。ALP単独のピーク(つまり抗体が結合しなかったALP)が見える事もありますが、これは無視して構いません。B/F分離で洗い流されるだけで害はありません。左側の、ALPが結合したフラクションを全て回収すればOKです。これでFab'-ALPが完成。イメージとしては、大きい酵素に小さい抗体をくっつけるようなものです。ところで酵素標識抗体っていうと、こういう形をイメージしていませんでしたか?私たちも仕事がら、こんな絵をよく描きます。実はこれは、見てきたような嘘。試薬をお使い頂くお客様(臨床検査技師の皆様)に測定原理を説明するときに、イメージしやすいように、抗体と酵素をただくっつけただけの絵を使っているのです。本当はこんな形していないのです。概念図ってそういうものなのです。1.アミノ基を使う方法それでは抗体に標識する方法を説明していきます。低分子量の蛍光物質や、ビオチンなんかをよく付けます。イムノアッセイでは検出できるものをくっつける時に「標識する」と言いますので、ビオチンを付けてそれを固相抗体に利用する場合には、「標識する」と言いません。そんな固い事言わなくてもいいじゃない、と思いますけど。ポピュラーな、抗体のアミノ基に標識する方法。タンパク質のアミノ酸配列には普通、リジンがいくつも入っています。それらが親水性が高くてタンパク質表面にアミノ基が出た形になっていますので、タンパク質の表面にはアミノ基がたくさんある訳です。僕らは普通、蛍光色素やビオチンを直接アミノ基に付けたりはしていません。NHS基の付いた蛍光色素や、NHS基の付いたビオチンを買ってきて、抗体と混ぜているのです。NHSとは「N-Hydroxysuccinimide」の略で、アミンと置き換わってアミド結合を作る官能基です。NHS基が付いた「標識試薬」がたくさん売られています。手順としてはだいたい以下の通りです。抗体を定量して、モル数を計算する。F(ab')2なら吸光度を測定し、1.48で割ってmg/mL濃度を計算して、分子量100,000で割って体積を掛けます。標識試薬を溶かすだいたい有機溶媒に溶かします。どんな溶媒に溶けるかは事前に確認しておきましょう。抗体のモル数の10倍くらいになるように計算して標識試薬を入れ、良く混合します。抗体に結合しなかった、余分な標識試薬を脱塩カラム(PD-10など)を使って除去します。抗体は加工するときにはmg単位で扱いますが、イムノアッセイや組織染色ではμgやngの単位で扱いますので、数千倍に希釈して使うのが普通です。アミノ基に標識する方法は、一長一短があります。長所は、簡便で、抗体だけでなくどんなタンパク質にも適用できるところ。短所は、アミノ基にランダムに結合する所。アミノ基はタンパク質にいくつもあり、どこに付くかは確率の問題です。抗原認識部位(CDR)のアミノ基が標識されてしまって抗体の特異性に影響する可能性があります。このような性質のため、特異性が大事なイムノアッセイに使うよりは、量が大事な組織染色やウエスタンブロットのような用途でよく用いられる標識方法です。2.解説編それでは次に解説編です。抗体をペプシンで消化する、という実験でつまづいている人も多いはず。そもそもなぜペプシンで消化するの?診断薬では多くの場合、Fc部位は邪魔だからです。補体活性も使いません。血清中にリウマチ因子を含む患者さんは沢山います。リウマチ因子の多くは抗体のFc部位に対する抗体です。この部位を除く事で、特異性の高い(リウマチ因子の影響を受けない)試薬ができます。Fc部位は疎水性が強く、凝集の原因になります。Fcを除去したF(ab')2は安定である事が多く、安定的に利用できます。パパインで消化する事もできますが、フラグメントはFabになります。S-S結合を還元してSH基を利用する加工方法に持って行けなくなります。どんなクローンでもペプシン消化できますか?ペプシン消化は、元々は抗血清からポリクローナル抗体を高純度に精製する技術なのです。そもそもの目的が違うのです。(参考文献)抗体がF(ab')2より小さな断片にならないのに対し、コンタミはペプシンで低分子量に切られてしまうため、精製度の低い抗血清からF(ab')2だけを、ゲルろ過カラムだけで効率よく精製できたのです。消化条件を事前に検討する必要があります。できないクローンもあります。電気泳動などで小スケールで検討できますよ。一般的にIgG1は過消化がおきにくい、IgG2aは切れすぎないように時間を至適化がある、IgG2bは過消化しすぎてF(ab')2は得られないと言われています。これらは大体が合っていますが、例外も経験しています。事前に小スケールで条件検討しておくのが大事です。この辺の技術は1970年代には既に知られていたようです。モノクローナル抗体技術が一般的になるだいぶ前。(参考文献)ペプシン消化が上手くいかないのですが...こういう問い合わせを最近良く受けるようになりました。大体が切れすぎを恐れ、高めのpHで消化してみて、上手く切れないからと消化時間をだらだら伸ばしている事が多いです。至適pHを外せば、どんなクローンも切れません。ちなみに「どういう条件で消化したの?」と聞くと、「某社のキットを使いました」という返答が多いです。