開発するバイオ技術のブログ。誰かの役に立つかもしれない事を思い付くままに書いています。5LoQ(定量限界)最後にLoQ。Quantificationの略。sensitivity)という言葉を使っていました。今でも通じると思います。Guidelineで勧告したのが始まりだったと思います。私たちはみんなSpencerの論文を読んで勉強したものです。この考え方が一般的に広まって、CLSIのEP17でも採用された時にLoQという言葉になったと記憶しています。Profileと呼ばれる図をご存じでしょうか。CVと濃度の関係を示したもので、縦軸にCV、横軸に濃度をとってプロットすると、一般的にはU字型のグラフが描かれます。この図はイムノアッセイの重要な性質を教えてくれます。CV=SD÷濃度なので、濃度が0に近づくほどCVが大きくなる。測定範囲には上限もある。(検量線の頭打ちとか、固相抗体のキャパシティ、酵素反応速度のVmaxなど)CVが低くなる、得意な濃度範囲がある。LoQを求める時に必要なのは、濃度0付近でCVが大きくなる性質です。低値付近の濃度の試料を10例ほど作るか探すかして、1日2回ずつ、5日間に渡って測定します。このとき蛍光強度ではなく、検量線で換算した濃度を使います。可能な限り丸め誤差を含まないように、有効数字に気をつけてデータを取得してください。+10SDがLoQ、としている例があります。profileをプロットする方法を推奨しているようです。このときCVのばらつきが気になることもありますが、そういうものだと思ってください。気にせずにExcelで指数回帰して、回帰式からCV20%になる濃度を求めます。(本当は双曲線回帰が良いのでしょうが、Excelのグラフでは難しいので。LoQの説明をしてきましたが、いかがでしょうか。面倒くさい事この上ないですね。こんな実験するくらいなら、臨床検体を一つでも多く測って測定系の信頼性を上げるべきだ、とか思ってしまいますけど。それは言いっこなし、ということで。4LoD(検出限界)次にLoD。Detectionの略。要するにLoDを下回る測定値は、ブランクと有意に切り分けられない、つまり統計的にブランクと有意差がないと見なされる訳です。このLoDが測定系の検出性能の指標と見なされているのです。(あくまで「測れているか」は別として、です。)さて、LoDを測ってみましょう、と思って文献を見てみると、いきなりこんな数式が出てきて凹むかもしれません。こんなものでめげないように、頑張ってExcelで書いてみます。LoB付近の濃度と、それよりちょっとずつ高濃度の試料を計5~6例用意します。実検体でそんな都合の良い試料がある訳ないので、ブランク試料に抗原を添加(Spike)して作るのがほとんどです。これらの試料を1日2回、5日間以上にわたって測定します。今回の例では5試料6日間、1日2回で、計60テスト測定しました。Excelなら平均(AVERAGE)と標準偏差(STDEV)は簡単に出せますよね。ここで冒頭に出てきた、うんざりする式は、標準偏差の合成を行っているのです。測定値(平均値)は無関係で、ばらつきだけ60テスト分で出そうとしているのです。行16:SDを2乗して分散(VAR)に戻します。これが式のSD^2に相当する部分です。次に行17:データ数(COUNT)は各試料で12です。行18:自由度は12から1引いて11です。これが式の(nk-1)に相当する部分です。自由度の説明はいずれ自分で書きたいです。行19:自由度と分散を掛けて、偏差平方和(DEVSQ)に戻します。ここで、標準偏差というのは、偏差平方和を自由度で割って√を取って計算したものです。Excelだと即SDが出てきてしまうので、順番が逆になって、SDから偏差平方和を計算しているという事なんですね。今回の例で60回分の標準偏差を求めるには、標準偏差をそのまま足しちゃだめなんです。標準偏差には加法性がないから。標準偏差を計算する大元の値である、自由度(行18)と偏差平方和(行19)を足すのです。列Hが5つの試料分のデータを足したもの。セルH18:自由度は合計55です。これが式の分母N-kに相当します。Nが60でkが5だから計算は合うでしょう。どちらの方法で計算しても同じことです。セルH19:自由度×分散、つまり偏差平方和を足します。これが式の分子に相当する部分です。最後にセルH20:偏差平方和の合計(H19)を自由度の合計(H18)で割って√(SQRT)を取ります。これでやっと60回分の標準偏差(SDS)に合成できました。本題のLoDですが、前回計算したLoBの吸光度とか蛍光強度に、1.645×SDSを足します。これを濃度換算した値がLoDになります。測定するのも計算するのも大変でしたね。