FJを上記のように等級付けした。組織源および詳細な組織情報は表Iに列挙されている。Signaling、Danvers、MA、USA)を使用して、ヒトFJC組織からの総タンパク質を抽出した。ヒトFJC組織のタンパク質濃度は、ビシンコニン酸タンパク質アッセイ(Pierce、Rockford、IL、USA)によって決定した。PAGEにより分離し、次いでウエスタンブロット分析のためにニトロセルロース膜上にエレクトロブロットした。Biosciences、米国ニュージャージー州ピスカタウェイ)を用いて視覚化した。試薬(Invitrogen、Carlsbad、CA、USA)を用いて全RNAを単離した。PCRシステム(Invitrogen)を使用して、1μgの全RNAでRTを実施した。Hercules、CA、USA)を用いてcDNAを増幅した。Softwareを用いて各増幅曲線から閾値サイクル(Ct値)を得た。製造業者(Bio-Rad)により詳述されているように、相対的なmRNA発現をΔΔCT法を用いて決定した。プライマー配列およびそれらの条件は要求に応じて提供されるであろう。Array、RayBio、Norcross、GA、USA)を用いてサイトカインレベルの変化を決定した。マイクロアレイアッセイについては、製造業者によって提供された指示に正確に従った。簡単に説明すると、膜を2mLの1×ブロッキング緩衝液と共に室温で30分間インキュベートして膜をブロックした。ブロッキング緩衝液をデカントした後、無症候性ドナー対照(莢膜肥大の徴候のないFJグレード0または1)から抽出した500μgの全タンパク質または症候性LBPを有する対象からの外科用FJC組織と共に、膜を4°Cで一晩インキュベートした。ビオチン結合抗体による。デカントした後、全ての膜を2mLの1×洗浄緩衝液Iで室温で5分間3回洗浄し、続いて1×洗浄緩衝液IIでさらに2回室温で洗浄した。その後、全ての膜をビオチン結合抗体の希釈物(1:250)と共に室温で2時間インキュベートし、そして洗浄工程を繰り返した。免疫反応性を可視化し測定するために、これらの膜をさらにインキュベートした。セイヨウワサビペルオキシダーゼ(HRP)結合ストレプトアビジン。Enhancerシステム(Pierce)を用いて免疫反応性を視覚化し、シグナル強度を拡大した。1-D分析ソフトウェア(Bio-Rad)を使用して各スポットの積分密度値(面積相対強度)を計算することによって行った。各膜の陽性対照シグナルを用いてシグナル強度を標準化した。組織学的/免疫組織学的評価ヒト腰椎FJを4%パラホルムアルデヒド中で72時間固定し、22%ギ酸および10%クエン酸溶液中で脱灰し、骨組織が柔らかくなるまで4日ごとに交換した。脱灰したFJ組織を横断面で切断し、パラフィン包埋した。正確に厚さ5μmの連続FJ切片を切断してスライドを調製した。サフラニン−Oファストグリーン染色を用いて、軟骨粉砕物質中の一般的な形態およびプロテオグリカンの損失を評価した。アルシアンブルーヘマトキシリン/オレンジG染色を用いて、一般的な形態学および構造変化を評価した。Abcam、ケンブリッジ、マサチューセッツ州、米国)。SMA)(ab5694、Abcam)。CD11b(サンタクルスバイオテクノロジー、ダラス、テキサス州、米国)。Scientific、Waltham、MA、USA)。神経成長因子(NGF)/トロポミオシン受容体キナーゼA(TrkAの)(Abcam社)。ペルオキシダーゼ複合体技術を用いてIHCを実施した。Laboratories、カリフォルニア州バーリンゲーム)を用いて切片を視覚化し、続いてで染色した。添加し、スライドを暗所にて室温で1時間インキュベートした。Optical、米国ペンシルベニア州センターバレー)を用いて調べた。g)を二酸化炭素で安楽死させた。L1からL5までの両側腰椎DRG(ラットあたり10個のDRG)を、立体顕微鏡下で無菌解剖により慎重に除去し、特に物理的損傷を避けるように注意した。無作為に選択した3つのラットDRGを個々のウェルに入れ、1%mini-ITS、1%GlutaMAX、および1%HEPESを含むDMEM培地中で5日間、正常または変性FJC組織または培地対照と共に共培養した。各実験群は、培地対照を有する3つのウェル、または各ウェル中の独特の正常もしくは変性FJC組織を含んだ。各ウェル中の3つのDRGを、以前に記載されたように33、RNA抽出およびPCRのために回収した。Institute、ノースカロライナ州ケアリー)を用いて記述統計量を計算し、群の相違を試験しそして多重試験によるエラーインフレを補正した。正規分布と同様の分散を持つ変数については、両側t検定を使用してグループを比較しました。Hochberg(1995)34に記載されているように、誤発見率(FDR)を制御する調整方法を使用しました。Pの分析部によりグループ化された-値は、従ってエラー膨張の問題を最小限に抑える、FDRを制御するようにしてリニアステップアップ調整を使用して調整しました。誤差インフレの調整後、≦0.05の有意水準をすべての統計的検定に使用した。図中に示されている個々のP値。データは平均として表した。エラーバーは95%信頼区間(CI)として表した。結果ヒトFJDの肉眼的および組織学的外観ヒトFJSの総出現を調べ、下関節面の外観(コリンのグレード:G0-G4;のための代表的なグレードを割り当てた。図1のA及びB)32、35。軟骨の発熱のサイズの増加を示した。症状のある外科用サンプルは明らかに最も退行性の高い形態学的変化を示した(表I)。ヒトFJの肉眼的外観を、正常グレード(G0)と異なるグレードの病理学的状態を有する変性面とを比較することによるプロテオグリカン含有量についての組織学的検査によってさらに分析した(G2〜4)。4)を有するFJにおけるプロテオグリカンの枯渇(図1C)。FJのアルシアンブルーヘマトキシリン/オレンジGおよびH&E染色の結果は、グレードと相関する構造的および形態的変化の観察をさらに支持した(図1DおよびE)。高解像度画像をダウンロード(1MB)フルサイズの画像をダウンロード図1。通常および変性FJSのグロスと組織学的出演。A、ヒト腰椎FJの解剖学的構造および腰椎FJにおける下関節突起の作製。B、FJおよびFJC組織の全体的な外観。各FJは、下位ファセットの外観に対して代表的な等級を割り当てられています。高いグレードのFJサンプルは、エッジ骨棘、反応性骨、および軟骨の焼灼のサイズの増加を示しています。C、サフラニンO、D、アルシアンブルーヘマトキシリン/オレンジG、およびFJ軟骨のE、ヘマトキシリンおよびエオシン染色は、プロテオグリカンの激しい枯渇を示す。変性FJC組織では炎症が増加する免疫細胞浸潤のマーカーであるCD11bについての染色の結果は、変性FJC組織における炎症性細胞の浸潤を示した(図2A)。4)におけるサイトカインの発現を調べた。<0.05)(図3A)。正常および変性FJC組織における炎症、血管新生、およびニューロンの内方成長の評価。4)における炎症細胞の浸潤の増加を示す。4)組織において著しく増加した血管新生事象を示す。4)におけるVEGFの誘導の増加を示す。M;神経突起のマーカー)を実証する。NGF、およびその同族受容体TrkA。6を表す(G1〜4)。正常及び変性椎間関節嚢(FJC)組織におけるサイトカインプロファイリング。4)由来のFJC組織溶解物を使用する、サイトカイン抗体アレイのデンシトメトリー分析。10)における変化したサイトカインのレベルを示す。個人P図に示されている値。データは平均として表した。エラーバーは95%CIとして表した。(qPCR)分析を採用した。結果は、誘導されたタンパク質レベルが炎症誘発性サイトカインのmRNAレベルの増加と相関することを証明した(図3B)。我々の個々のqPCRデータは、サイトカイン抗体アレイによって評価されたmRNAとタンパク質レベルとの間のわずかな相違を明らかにした。<0.05)(図3)。