医学・生命科学のポータルサイト。バイオテクノロジー・データサイエンス、研究留学を中心に発信。プロフィールはこちらタンパク質の電気泳動には、SDS-PAGEが最もよく使われています。この記事では、SDS-PAGEのやり方やその後の染色の仕方について、その原理も併せてまとめました。頭文字をとったものです。【失敗原因の考察も】SDS-PAGEでは、小さいタンパク質ほど早く移動するため分子量マーカーと比較することでおよその分子量が推定できます。還元剤を加えてボイルします。陰極性の界面活性剤で、タンパク質を強力に変性させさせると同時にその疎水性の部分でタンパク質の主鎖と結合します。還元剤は、タンパクのS-S結合を還元して切断します。その結果タンパク質は完全に変性し、複数のサブユニットからなる場合でも全体がほぼ均一に負電荷を帯びた状態となります。これをポリアクリルアミドゲル中で電気泳動すると、DNAの電気泳動と同じゲルのふるい効果のため小さいものほど早く流れるのです。膜タンパクや糖タンパク、リン酸化タンパク、プロリンの多いタンパクなどでは、SDS結合量が通常のタンパク量と若干違うため、SDS-PAGEでの見かけの分子量が実際の分子量と異なる場合があることに注意が必要です。アクリルアミドの濃度を高くするほど網目が細かくなり、小さいタンパク質を分離するのに適したゲルができます。一般的には5から15%の濃度を使うことが普通です。広く行われているSDS-PAGEは、1970年にLaemmliにより報告された手法を踏襲しています。使用するポリアクリルアミドゲルは、濃縮ゲル(pH6.8)と分離ゲル(pH8.8)の2つのpHが違うゲルを重ねて作ったもので、泳動バッファーとしてTris-Glycine-SDS(pH8.3)を使用します。このようにすると、まず上にある濃縮ゲルでタンパク質が濃縮され、次に下側の分離ゲルでタンパク質を分子量に応じて分離できます。8.1)はプラスの電荷を帯びるため陰極側に移動します。塩素イオンとグリシンとに挟まれた状態で泳動されます。各領域の境界では一時的に電圧が大きくなるので、間に挟まっているタンパク質が濃縮されます。順番に塩素イオン、BPB、SDS、タンパク、グリシンの順番に並んでいます。pH8.8の分離ゲルに到達すると、グリシンはマイナスに荷電するので、タンパク質よりも移動度が大きくなります。グリシンがタンパク質を追い越した後は、タンパク質は分子量の違いにより分離されることになります。順番に塩素イオン、BPB、SDS、グリシン、タンパクの順番に並んでいます。2つの異なるpHのバッファー中でのイオンの挙動を上手に利用したLaemmli法は、現在でも最も分離性能が良い優秀な方法です。SDS-PAGEのやり方SDS-PAGEを行うためには、タンパクを抽出した後、次のような工程が必要になります。電気泳動の開始それぞれ順番に解説します。適当な濃度の分離ゲル用溶液を作り、室温にする。液体の状態のアクリルアミドには神経毒性があるので注意する。cmぐらいのところまで流し込む。全部は使わず、少し残しておくと、あとでどれくらい固まったのかわかって便利。30分ほどしてイソプロとゲルの境界がはっきりと見えてきたら、ゲルが固まっているので重曹したイソプロを捨てる。15分ぐらいでゲルが固まる。サランラップで包み、乾燥しないようにしておけば少なくとも一日は保存可能。作りたてのゲルでは重合していない古いアクリルアミドが残っている可能性があり、これはシステインと結合するので質量分析で解析する場合は注意が必要。購入することもできます。