バイオテクノロジー・データサイエンス、研究留学を中心に発信。プロフィールはこちらウェスタンブロットは、タンパク質実験で最もよく使われている方法の1つでしょう。ウェスタンブロッティングは、タンパク質の電気泳動、膜への転写、そして目的のタンパクの検出という大きく3つのステップからなりますが、この記事ではそのうちの膜への転写について、少し掘り下げて解説します。し、抗体を使って目的のタンパク質を検出する方法です。SDS-PAGEによる電気泳動については、長くなるので別の記事にまとめています。【その他のタンパク泳動方法も】SDS-PAGEの次にやることは、ゲルからメンブレンにタンパクを転写することです。具体的には、専用の装置を使ってタンパク質を電気的に移動させます。ブロッティングと呼ばれるこの操作には、セミドライ式の装置とタンク式の装置が利用可能です。https://www.thermofisher.com/blog/learning-at-the-bench/chemiluminescent-westernblotting-guide/セミドライ式は、転写を短時間で行うことができ、バッファーの使用量も少ないというメリットがありますが、高分子量のタンパク質の転写効率が悪いという弱点もあります。タンパク質が高分子である場合は、タンク式の方が転写効率は高いです。タンパク質はゲルとの相互作用が強くゲルから離れにくいので、これをセミドライ式で転写するにはアルカリ性の転写バッファーを使った方がいいと言われています。アルカリ性転写バッファーの弱点は、低分子量のタンパク質がメンブレンから抜けやすくなってしまうということです。転写バッファーに入れるメタノールはゲルの安定剤で、ゲルの膨張を防いでいます。通常は転写バッファーの20%がメタノールですが、高分子量のタンパクを見たい場合は10%にします。これによりゲルが緩み、ゲルからタンパク質が溶出しやすくなります。使われているメンブレンには、ニトロセルロース膜とPVDF膜がありますが、どちらを使うかは好みの問題です。する場合などに向いています。染色し、転写がうまくいったかどうかを確認することもできます。PVDF膜を使う場合は、使用前にメタノールに1分間以上浸した後に転写バッファーにつけておく。ニトロセルロース膜の場合は、メタノールにつけないでそのまま転写バッファーに浸す。メタノールを加えた後に熱が出るので、SDS-PAGEが始まった頃くらいのタイミングで作成しておき、転写の時には室温になるようにしておく。プラスチックのケースの中で、プラス極の電極の上に転写バッファーに浸したろ紙3枚をおき、その上にメンブレン、そしてゲルを泡が入らないように重ねる。濾紙が必要以上に大きいと電流の一部がゲルを通過しないで流れてしまうため転写効率が悪くなる。そのため、なるべくゲルの大きさに合わせて濾紙を切った方がいい。転写バッファーに浸したろ紙を3枚乗せ一番最後にマイナス極をのせる。mAで1時間通電する。タンパクはプラス極側に泳動される。S染色液に約1分間ひたす。3回)タンク式ブロッティングの方法タンク式はバッファーの使用量が多く、しかもバッファーを冷却しないといけないなど面倒な点もありますが、綺麗な像が得られるという利点もあります。セミドライ式では熱が発生して転写にムラが出来やすいという弱点がありますが、ですがタンク式ではまんべんなく転写されます。(セミドライ式と同じ)。SDS-PAGEをした後の分離ゲルを転写バッファーに浸しておく。タンク式ブロッティング装置のゲルホルダーカセットの片側にスポンジをのせ、その上に転写バッファーに浸したろ紙を1枚のせる。ろ紙の上に、メンブレン、ゲル、転写バッファーに浸した濾紙1枚の順にのせていく。上からスポンジをのせ、ゲルホルダーカセットを閉じる。スターラーバーと容器に入れた氷もセットし、転写バッファーを上から注いだ後、電極を取り付けタンクをスターラーの上に置く。mAに電流をあげてさらに30分通電するここから後はセミドライ式と同じ。S染色液に約1分間ひたす。3回)関連サイト・図書この記事に関連した内容を紹介しているサイトや本はこちらです。【その他のタンパク泳動方法も】リンクまとめ最後に今回の内容をまとめます。ポータルサイト】生命医学をハックするをお読みいただきありがとうございました。生命科学研究は、研究手法が大きく前進したこととコンピューターの発達なども相まって、かつてないほどの勢いで知識の整備が進んでいます。ない方や、未来を担う学生さんに向けた情報発信をしています。2週間に1回のペースで、サイトの更新情報や、それらをまとめた解説記事をニュースレターとして発行しています。メールアドレスの登録は無料で、もちろんいつでも解除することができます。サイト名の「ハックする」には、分かってきたことを駆使し、それを応用して、病気の治療や研究などにさらに活用していこうという意味があります。【のど飴タイプもある】うがい薬はいろいろなタイプがありますが、有効成分はどれもほとんど同じです。生命科学系の実験ではタンパク質を精製することがよくあります。この記事では、やや発展的なタンパク質精製タグについて紹介します。薬局にはたくさんの痛み止めの湿布があります。これらの貼り薬はそれぞれに特徴があります。この記事ではそれらについてまとめました。健康診断で毎回のように行われる血液検査。喘息にリンゴ酢は効果があるのか?喘息の患者さんは通常、長期間つづく薬と短期の薬を併用して炎症を治療します。