開発このコンテンツはJavaScriptに最適化されています。JavaScriptが無効になっている場合は、有効にしてください。:気管内投与試験及び吸入暴露試験を行った試験動物を対象として、肺組織の切片に対するナノメートルオーダーの高解像度による細胞の観察とミリメートルオーダーの肺組織の広視野の観察を組み合わせ、肺組織内におけるナノ材料の体内分布と生体反応の分布を定量化する方法を確立します。開発した方法は技術解説書としてまとめて公開します。主な成果:生物組織は解剖による生命活動の停止とともに蛋白や脂質の流失等によって微細構造が変化してしまいます。組織の微細構造を維持した観察試料を作製することが必要です。一方で、広範囲の光学顕微鏡観察のためには袋状の柔らかい臓器である肺全体を薄切化する必要があります。生体反応分布の可視化のためには、免疫染色を利用するため抗原抗体反応を失活させない観察試料の作製方法が必要です。用いて細胞中に取り込まれたナノ材料についてナノメートルオーダーの高解像度の分析観察技術を開発しました。二酸化チタンナノ粒子分散液をラットに気管内投与し、3日後の肺組織の光学顕微鏡観察像を図3(a-1)-1(a)に、10μmに収束したX線を照射して発生したチタンの蛍光X線強度をマッピングして図3(a-1)-1(b)に示します。二酸化チタンナノ粒子が気道に留まるのではなく周辺の肺胞まで侵入すること、二酸化チタンナノ粒子が肺中に局部的に多く取り込まれていることが分かります。透過型電子顕微鏡によるナノメートルの分解能で細胞組織内でのナノ材料の局在観察や定量元素マッピングが可能となりました。細胞の微細構造は明瞭に保持されており、黒色粒子がファゴゾーム中に存在していることが分かります。電子線エネルギー損失分光法によるニッケルのマッピング像を図3(a-1)-2(b)に示します。黒色粒子とニッケルのマッピング像は良く一致することから、肺胞マクロファージに取り込まれた黒色粒子は酸化ニッケルであると判定されます。ナノ材料の生体反応として、炎症性M1マクロファージの表面レセプターの一つであるToll様受容体4(TLR4)の産生とナノ粒子投与量との相関性に関する先行研究から、TLR4産生に注目しました。酸化ニッケルナノ粒子を吸入暴露し1か月後のラット左肺の位相差観察像及び蛍光観察像を図3(a-1)-3(a)及び図3(a-1)-(b)にそれぞれ示します。図3(a-1)-3(a)中の肺胞マクロファージと図3(a-1)-(b)中の蛍光発光箇所が一致することから、肺胞マクロファージがTLR4を産生してFITC標識によって蛍光発光していることが分かります。図3(a-1)-4(a)に酸化ニッケルナノ粒子を吸入暴露し1か月後のラット左肺の肺胞マクロファージTEM像を示します。黒色の凝集粒子近傍の拡大像を図3(a-1)-4(b)に、肺胞マクロファージの端部の拡大像を図3(a-1)-4(c)に示します。図3(a-1)-4(b)中に矢印で示すようにマクロファージによる黒色の酸化ニッケルナノ粒子の貪食が観察されます。図3(a-1)-4(c)中矢印で示すようにマクロファージ端部には2次抗体の金コロイド標識が観察され、TLR4の産生を示しています。この金標識粒子を数的にカウントすることによって、TLR4の産生量を相対的に評価することができます。