2.グラジェントの遅れと溶媒が平衡に達する時間の検証アセトニトリルはHPLCの移動相溶媒としてよく使用されている。Sではアセトニトリルに代わってメタノール溶媒が頻繁に使用されていてみた。溶媒組成を設定してからはすぐに測定を開始しないことは経験から知ってる。沸点が65°Cとアセトニトリルの82°Cと比べて低く、イオン化(噴霧)の過程で濃縮いる。経験的には10分待つとか、UVのベースラインが安定するのを見計らってからされやすいからである。溶出力が低くなり、より高いメタノール組成で溶出するので、アセトニトリル溶媒と比較してイオン化効率が増大することも一因である。溶媒の沸点と粘性を右記に示す。ニトリル820.34メタノール650.54エタノール781.08タノール溶媒組成の圧力を示す。メタノールとエタノール溶媒は50%の溶媒組成で測定を開始している。カラムの系が安定しないからである。どのくらいの時間で安定するのであろうか。その安定化時間を流量の系の体積から評価してみた。安定化するまでの時間はポンプヘッドからUVまでの流路の容積に依存している。溶媒ミキサ、インジェクターループ、カラム、配管を合わせた容積である。現在、使用している装置の流路の容積を評価した。用の1ml/minの流量で設定され、内径0.5mmφと大きい径の配管で接続されてい最も高い圧力を示している。アセトニトリルは20%組成の時に最大値を与え、メタることがある。そのため、流路の体積を押ノールの条件と比較すると半分以下の圧力である。そのためHPLCの移動相溶媒さえるために内径0.1とか0.25φの配管にとしてアセトニトリルがもっぱら使用される。材はることができるからである。吸収が少ないことも一因している。極が劣化し、イオン化効率が低下することがあり、その使用は控えられている。能に、濃度感度を上げるためである。ミキサインジェクタループカラム(2.1φ×15cm)カラム(4.6φ×15cm)PEEK(0.1φ×1m)PEEK(0.25φ×1m)PEEK(0.5φ×1m)PEEK(0.75φ×1m)420μl100μl519μl2500μl8μl49μl196μl442μl移動相の流路は溶媒ボトルから溶媒を吸引し、押し出し、溶媒ミキサで混合し、インジェクター、カラム、UV検出器、イオン源に流れ出る。溶媒組成が安定化する時間を、流量と流路の容積から計算した。SMS条件の最適化のノウハウを知るμlと計算される。1ml/minの流量で測定すると約3分で置換されることになる。実にはクロマトグラムのベースラインが安定化するには4分ほどの時間がかかっている。グラジェント分析のときは設定値よりも4分以上の遅れが生じていることを理解しなければならない。測定者のなかには、よりよい再現性のあるクロマトグラムを得るために10分以上の時間を見て測定することもある。LC/MS分析のために例えば0.2ml/minの小さい流量で測定するときは、安定化するのにより時間がかかる。化する時間を計算してみる。溶媒組成を流量に換算するとそれぞれ0.01と0.19ml/minの流量比となる。0.01ml/minの低流量がミキサに押し出されて混合されていることになる。ミキサ(420μl)からインジェクター部を内径0.25φ×1m(49μl)、インジェクターループを100μl、カラムを2.1mmφ×15cm(519μl)として総体積を計算すると1088μlとなる。流量0.2ml/minで流すと、5.4分で置換されることになる。4.6mmφの分析用カラムと比較するとグラジェント遅れや溶媒組成が平衡に達する時間は倍以上に大きくなる。流量を50μl/min以下に設定すれば安定化時間はいっそう長くなることを理解しなければならない。持時間の再現性がなくなり分析の失敗の原因となり、注意しなければならない。このような測定の失敗は装置の性能の悪さと勘違いされ、業務上出向くことがあった。下段:0.25ml/min)が、その流量に適したカラムは内径2.1mmφのものを選択している。15cmの長さとしてそれぞれの内径でのカラム体積と最適流量どの流量条件が最適かと質問すると誰もが「0.25ml/minの条件がよい」と答えるを以下に記した。どの条件が最適とは言えないが、ケースバイケースで考える必要がある。2.5ml1.0ml/min迅速分析であれば4.8分で溶出する1ml/minの流量条件を選択する。感度や再4.01.90.8ml/min現性を優先するならば0.25ml/minや0.5ml/minの流量条件がよいであろう。3.01.10.4ml/minこのように、どの流量条件が良いかは測定者の判断に任せるが、その系の安定性2.10.520.2ml/minや感度から考慮すると0.5ml/minの流量が最適と考える。この条件で迅速分析を考えるならばエタノール組成を90%にするなど高くして測定すると数分で溶出し、ク最適な流量条件は内径4.6mmφで1ml/minとすると、それぞれの内径に合った最ロマトグラム強度も倍以上に高くなる。適流量は0.8、0.4、0.2ml/minに相当する。持時間は2.5分である。nの条件で測定してもよい。早く出て、迅minの流量条件で評価した。0.5ml/minの流量でLC/MSを行うとなると、最適なカ速分析となる。圧力が高くなるので、その時は長さ10cm以下と短くするなど工夫がラム径は3.2mmφと計算される。このようなカラムは市販されていないので、入手でき必要である。従来の分析用のカラム4.6φのカラムを使って0.5ml/minの条件る内径3.0mmφや4.0mmφのカラムで対応した。迅速分析とカラム圧の観点から長で測定すると溶出時間は長くなるが、溶媒組成を高くするなど工夫することはできさ10cmと短いものを選択した。15cmのものと比較して分離の低下があるが、それる。カバーするために粒子径3μmの充填剤を選択した。カラムは市販のODS4mmφ×10cmのカラムである。その系の体積を計算すると1.25mlとなる。このカラムを用おわりにいて1ml/min、0.5ml/min、0.25ml/minの流量条件で溶出時間、感度を評価し、LC/MSで用いる移動相溶媒、グラジェント遅れ、流量の選択について評価した。移それぞれの流量条件で測定したときのトータルイオンクロマトグラムを図-2に示す。動相溶媒については感度の点から沸点が68°Cと低いメタノールが適している。定流量から評価することができた。脱溶媒室温度:450°Cにより、グラジェント遅れの時間は分析用カラム条件に匹敵した。移動相:エタノール/アセトニトリル=1/12.1mmφや3mmφでもよい。測定時間は長くなるが4.6mmφの分析用を使用しても構わない。移動相はエタノール/アセトニトリルLC/MS条件の最適化のために流量0.5ml/min、移動相溶媒はメタノール、カラム=1/1、イオン化はAPCIである。溶出時間は流量に比例し、それぞれ4.8分、9.7分、はODSとして、それに見合ったカラム径、長さを考慮して測定すればよいと考える。a過去のHPLCやLC/MS分析条件にとどまらず、迅速分析や感度、クロマト分離をニュース92)。加味しながら新しい分析条件を確立されることを期待する。一見すると1ml/minの流量条件でのクロマトグラムは良くない。霧)で多量の溶媒が除去できず、イオン化効率が低下している。0.5、0.25ml/minとお困りの分析があればお手伝いいたします。流量が少ないほど、明瞭なクロマトグラムを与えている。