様はじめに我々はこれまで、T7ファージディスプレイシステムを利用したライブラリ技術を用いて、標的分子に特異的な結合活性を有するペプチドのデザインに関する研究を行ってきました(1,2)。(hIgA)を標的として、ファージライブラリを使って得られた特異的な結合ペプチドのBiacoreによる親和性解析と、その親和性増強の過程で明らかになった相互作用の熱力学的特性について述べます。後半では、Biacoreを用いてT7ファージ上に提示されたペプチドと標的分子との相互作用を直接解析する手法について紹介します。mg/kg/day)であり、バクテリアやウイルスなどに対する最初の防衛ラインである粘膜免疫において主要な役割を担っています(3)。これらのことから、hIgAもhIgGと同様に、抗体医薬としての有用性を十分に有していると考えられ、新しい抗体医薬候補として注目されはじめています(6)。IgGにおけるプロテインAのように、産業応用可能なhIgA特異的リガンドが無く、未だhIgAの精製システムが確立されていないというのが現状です。頭部を構成するg10タンパクのC末端側に外来のタンパク/ペプチドを提示することができます(7)。Fab)などのタンパク質の提示に従来より多く用いられているM13ファージ(繊維状ファージ)とは異なり、T7ファージはホストである大腸菌から溶菌により放出されるため、膜透過過程を経ないことから提示分子のアミノ酸配列に偏りが少ないという特徴を持ちます(8)。大腸菌への感染から溶菌完了までわずか2時間程度で完了するため、特異的な結合ファージを濃縮する手法であるバイオパンニングやその後のスクリーニングにかかる時間を大きく短縮することが出来るといった利点があります。IgA結合ペプチドのデザイン我々は、新たなhIgA精製用の特異的アフィニティリガンドをデザインするために、T7ファージディスプレイシステムを利用したランダムペプチドライブラリ(図1)を用いました。図1に示すX3CX7-10CX3型のペプチドライブラリを用いて、IgAに対するバイオパンニングを5ラウンド行った結果、4種類のIgA結合ファージクローンの単離に成功しました(表1)。μMと弱い結合力しか示さないことがわかりました(図2)。180秒間インジェクトし、結合反応を観測した。測定は、HBS-EP緩衝液(pH7)中、25°Cで行った。そこで、親和性を改善するため、A2ペプチド配列を基に部分ランダムペプチドライブラリを作製し、再度IgAに対するバイオパンニングを行いました。nMと親和性としては不十分なままでした。180秒間インジェクトし、結合反応を観測した。測定は、HBS-EP緩衝液(pH7)中、25°Cで行った。そこで、先の部分ランダムライブラリから得られた配列の中に結合力の向上に関わる配列が含まれていると考え、A2-3aペプチド配列をベースにして、1部分ランダムライブラリ得られた中で出現頻度の高いアミノ酸(表2)への置換体、2各アミノ酸部位のAla置換体、また、3元のA2由来アミノ酸への置換体を化学合成して、hIgAに対する親和性を評価し、実際に結合を上昇させるアミノ酸置換の特定を行いました。部分ランダムライブラリより単離された約30種のIgA結合ペプチド配列の各座位において高い出現頻度を示したアミノ酸とその出現頻度(%)を示す。nMと強い結合を示しました。kcal/mol)にほぼ相当することから、これらの変異には加成性が成り立ったことが分かります。nMのKd値で結合しました。μl/minで180秒間インジェクトし、結合反応を観測した。測定は、HBS-EP緩衝液(pH7)中、25°Cで行った。nMへと約80倍上昇させることに成功しました。T100を用いたIgAとの結合における熱力学的パラメータ解析を行いました。nmの負の吸収が大きくなり、αへリックスの2次構造を形成していることが分かります(図5A)。この様に、2次構造の増大と結合力の増大とが相関していることから、IgAとの結合状態のペプチド構造は、αへリックスを有していること示唆されました。ここには示していませんが、Opt-1とIgAのFcとの結合の分子シミュレーション結果から、IgA結合ペプチドはN末端側にヘリックス構造を持った形で結合することが示されており、これらの観察結果を強く支持しています。Hoff解析により熱力学的パラメータを得ました。kcal/mol)の減少が見られました。kcal/molの減少が観察されました。このことは、結合力の向上は、エンタルピーの変化よりもむしろ、エントロピー項の減少によってもたらされていることを示しています。以上のことから、A2ペプチドからA2-3aさらにはOpt-2への結合力の改善は、アミノ酸置換によるIgAのFcとの直接的な相互作用による結合の増加というよりも、αへリックスを持つ結合構造への平衡的なシフトを促し、ペプチドのチェーンエントロピーを減少させた結果であると考えられます。このようにペプチドリガンドの親和性の向上においては、分子間の水素結合等による直接の相互作用に関与する残基だけでなく、結合構造をコンフォメーション的に安定化するアミノ酸置換も重要であること、少なくとも本研究のIgA結合ペプチドの場合には、それらの置換は加成性を示すことがわかりました。7.4)中、J-820(日本分光)を用いて、CDスペクトルを測定した。d(1/T)より、ΔHを算出した。ギブスエネルギー変化の式ΔG=RTlnKd=ΔH-TΔSより、ΔSを算出した。T7ファージ上に提示されているペプチドの直接相互作用解析ファージライブラリによって同定された特異的ペプチドモチーフの正確な親和性解析には、合成ペプチドを準備することが今のところ必須ですが、これはコストも手間もかかるステップです。そこで、我々は、ファージ上に提示されたペプチドの、より正確な親和性の評価について検討を行ってきました。最後に、この解析手法について現状を紹介します。T7ファージ上に提示されているペプチドの標的分子に対する結合は、ELISAなどの手法により評価することが一般的ですが、Biacoreを使っても簡便に評価することが可能です。図6Aに示したように、標的分子をセンサーチップに固定化し、親和性ペプチドを提示するT7ファージをインジェクトした場合には、結合反応に由来するRUの直線的な増加と極めて遅い解離反応を確認することができます。nMとかなり異なりますが、いずれのセンサーグラムも同じような形を取っています。これは、T7ファージ上に複数の分子が提示されているため、この場合のセンサーグラム上に現れる結合反応は、アビディティ効果や再結合の効果により、ペプチドリガンドと標的分子間のアフィニティよりもかなり強いみかけの結合を示してしまうことが原因と考えられます。そこで我々は、T7ファージを固定化し、ファージ上に提示されたペプチドと標的分子(アナライト)との親和性を直接解析する手法を検討しました。概要としては、CM5センサーチップ上に抗T7ファージ抗体を固定化し、これに、T7ファージを流してキャプチャーさせ、次に濃度が既知の標的分子をインジェクトすることで提示ペプチドと標的分子の親和性を解析するという手法です。RU以下に抑えることで、アビディティ効果や再結合効果を最小限に抑えることができます。上記と同じファージをセンサーチップに固定化し、標的分子をインジェクトした場合、ファージ上ペプチドと標的分子間の結合・解離反応を、合成ペプチドの場合と近い形でモニターすることができました(図6B、C)。現在のところ、合成ペプチドと完全に同じ親和性パラメータを得るまでには至っていませんが、ファージ上に提示されたペプチドのある程度正確な結合力の評価、ランキングができるようになっています。CM5センサーチップ上に標的分子を固定化し、特異的結合ファージをインジェクトした。.25μM)をインジェクトした。180秒間インジェクトし、結合反応を観測した。測定は、HBS-EP緩衝液(pH7)中、25°Cで行った。ファージへの結合レスポンスを差し引いている。おわりに我々は、ファージディスプレイ法を利用したペプチドライブラリを用いて単離したIgA特異的ペプチドの親和性解析を行い、最初に得られたペプチドをベースに親和性向上のストラテジーを組むことによって、高い親和性を有するIgA結合ペプチドのデザインに成功しました。今後、これらの手法とともに、ファージに提示されたペプチドの正確な親和性解析が可能になれば、様々な標的分子に対する迅速かつ低コストのペプチドリガンド探索研究の進展が期待されます。2013年4月バイオダイレクトメールは弊社WEB会員向けメールマガジンです。バイオダイレクトメールの配信をご希望の方は、下記リンク先からご登録をお願いいたします。疾患プロテオミクスラボラトリーお問合せフォーム※よくあるお問合せとご回答(FAQ)は「こちらで»」ご覧いただけます。※ファイルを添付してのお問合せは、お手数ですが「Tech-JP@ge.comまでメールにて」お問合せください。提供、新製品・新サービスの研究開発等並びに市場調査のために利用します。対する必要かつ適切な監督を行います。個人情報に関するお問い合わせは個人情報相談窓口(042-5855111:平日午前10時~午後5時)にて承ります。