生化学ノート大腸菌の力を借りてほしいDNA配列を手に入れる:遺伝子組換え生化学ノート2019.06.08スポンサーリンクここからはより分子生物学的な内容に入っていきます。いわゆる「遺伝子組換え」という技術についてです。以前紹介した核酸の塩基配列決定法とともに、現在の研究には欠かせないものとなっています。塩基にはACGTUがあるが、もし現実的に目の前にDNA溶液があったとする。やってその配列(並び方)を知ることができたのだろうか?当然肉眼では見えないので、色々と工夫をする必要がある。今回は塩基配列決定法の元となったジデオキシ法について解説する。got-it-lab.com2019.05.06遺伝子組換えの必要性はどこにあるのでしょう?それは、ほしい領域はゲノムDNAに比べて非常に少ないということを考える必要があります。mg程度しか得られません。そこからさらに、ゲノムDNAから目的の配列部分のみを取り出す必要があります。精製過程でもロスが避けられないので、必要量のDNAを得るのはかなり大変な作業となります。ここで組換DNA技術というのが確立し、特定DNAを単離、増量、改変することを可能にしました。菌体内にほしい配列を持ったDNAがたくさんある状態を作ることができます。今回はこの遺伝子組換えによってほしいDNAを手に入れる手順について、見ていきましょう。最後にスポンサーリンククローニング法によるDNAの増幅ここでは、以下の項目に分けて紹介していきます。選別した大腸菌の培養・精製ほしいDNA断片を得るまずは元となるDNA配列を手に入れなければ始まりません。以下の方法が考えられます。制限酵素で切り出すゲノムDNAもしくはほかのベクターからほしいDNA配列を切り出してきます。発現系を持っているけれどもプロモーターなどを入れ替えたいときに有効です。「切る」とは、ヌクレオチド同士をつないでいるリン酸ジエステル結合を加水分解することです。ここで特定の塩基配列を認識してDNAを切断するエンドヌクレアーゼである制限酵素を利用します。詳しくは以下の記事で解説しています。ほしいDNA配列を増やす:ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)PCRは自分がほしいDNAの配列を「増やす」技術である。キットも豊富で、増やすための酵素も失敗しにくいように改良されている。私は学部時代の化学実験でも行ったが、実験は難なくできた。レポートでプライマーの設計法などで苦しんだ記憶がある。いうことで、ここでまとめてみたい。got-it-lab.com2019.05.06化学合成で断片をつくるタンパク質の発現が目的であればPCRが圧倒的に多いでしょう。短い配列ならば化学合成も手です。ベクターと組み合わせる通常、ベクターには自身の複製に必要な配列を含んでいます。この配列を持つベクターが大腸菌内にあると、増殖するときにベクターも一緒に複製してくれます。発現用のプラスミドを制限酵素によって切り、上記で切り出した配列とつなぐ酵素であるリガーゼによって組み合わせると、目的の配列を含んだ大腸菌プラスミドを作製することが可能となります。目的とするプラスミドが完成したら、クローニング用の大腸菌に取り込ませます。この操作を形質転換(トランスフォーメーション)と言います。形質導入(トランスフェクション)と似ているが、異なる用語であるので注意しましょう。いえ、いきなり大腸菌とプラスミドを混ぜても取り込んではくれません。プラスミドを持つというのはエネルギーを使うので、大腸菌としては基本的に保持していたくないのです。そのため、形質転換には、まず大腸菌を受け入れる状態にする必要があります。このプラスミドを受け入れやすい状態はコンピテント状態といいます。やられるのは大腸菌をカルシウムなどで処理すると、細胞壁が弱くなってコンピテント状態になります。市販されているクローニング用の大腸菌はすでにコンピテント状態になっているものも多いので、たくさんクローニングをする方には便利です。コンピテント状態の大腸菌にプラスミドを混合すると、ようやく菌体内にプラスミドが入ります。いえ、形質転換の効率というのはせいぜい0.1%程度です。いうことは、形質転換された大腸菌とされていない大腸菌を選別する必要があります。いれておき、寒天培地に抗生物質を添加しておくことで選別します。寒天培地は培地に寒天を加え、シャーレに流し込んで固めたものです。寒天培地にはベクターに入っている耐性遺伝子に対応する抗生物質を添加しておきます。この上で大腸菌が育つと、塊(コロニー)を形成するはずです。寒天培地に抗生物質を撒いておくと、ベクターを持たない大腸菌は抗生物質によって死滅します。ベクターを持つ大腸菌は耐性遺伝子を持っているため、生き延びる事ができます。よって、この寒天培地上でコロニーを形成した大腸菌は形質転換されたものであると判断することができます。いえ、注意しなければならないのが「サテライトコロニー」です。培養してから時間が経ってしまうと、抗生物質の効果が薄れてきます。するとベクターを持たない大腸菌でも生き延びる事ができてしまいます。これがサテライトコロニーです。形質転換を行ったあと、1晩経ったらインキュベータから取り出すのがベターです。選別した大腸菌の培養・精製コロニーを抗生物質入りの液体培地で培養して増殖させます。抗生物質のおかげで、ベクターを持った大腸菌のみが増殖することができます。ある程度増殖したら、大腸菌を集めて破砕・精製を行えば、無事DNAを獲得することができます。破砕・精製に関しては別の記事でまとめたいと思います。最後に今回はほしいDNAを得るまでの流れをまとめました。して書くと遺伝子組換えは簡単な技術に見えるが、やはりそこは生物(なまもの)です。それぞれのステップには実験を成功させるために、気をつけるべきポイントがあります。原理を理解し、実験操作の意味を理解することが重要であると考えます。塩基にはACGTUがあるが、もし現実的に目の前にDNA溶液があったとする。やってその配列(並び方)を知ることができたのだろうか?当然肉眼では見えないので、色々と工夫をする必要がある。今回は塩基配列決定法の元となったジデオキシ法について解説する。2019.05.06生化学ノートワトソンとクリックによるDNAの二重らせんDNAは基本的に二本鎖である。それぞれの鎖は塩基間の水素結合でつながっている。塩基同士といっても、どれでも良いわけではなく、相手が決まっている。A・・・Tのペアである必要がある。これを経験的に導いた科学者の名から「シャルガフの法則」とよぶ。2019.05.06生化学ノート遺伝情報からタンパク質をつくる:セントラルドグマいわゆる「分子生物学のセントラルドグマ」の概要についてまとめていく。DNAは次世代に遺伝情報を渡すために、自らのコピーを作る必要がある。これが「複製」である。遺伝子DNAからRNA鎖を作るステップが転写である。RNAの情報を基にタンパク質を合成するステップは翻訳とよぶ。2019.05.06生化学ノートタンパク質の構成要素:20種類のアミノ酸タンパク質はアミノ酸が数珠状につながったものである。個々のアミノ酸の性質がタンパク質の機能に重要であることは間違いない。タンパク質を構成するアミノ酸は20種類ある。アミノ酸としての性質は炭素に結合している側鎖が何かによって決定される。今回はタンパク質を構成するアミノ酸の性質について、細かく見ていく。2019.06.02生化学ノートアミノ酸は20種類だけではない:アミノ酸誘導体タンパク質は20種類のアミノ酸の組み合わせでできている。この20種類は「標準アミノ酸」とよばれる。今回は20種類以外のいわゆる「非標準アミノ酸」がある。タンパク質として合成された後に、化学的修飾を受けたり、アミノ酸それ自体が機能を果たすものもある。2019.06.08生化学ノート典型的コイルドコイルタンパク質:ケラチン二次構造以上の三次元的な構造に入っていく。二次構造といえば、αヘリックスとβシートの主に2種類あることはご存知だろう。それらは二次構造内外で水素結合を多くつくることによって、非常に安定な構造を取る。多くのタンパク質で見られるが、ここでは代表的なものとしてケラチンについて見ていく。コメントをキャンセルメールアドレスが公開されることはありません。コメントデータの処理方法の詳細はこちらをご覧ください。:生物物理化学、タンパク質化学ブログでは、専門領域を中心に経験・知識をまとめていきます。専門外の領域に関しても勉強した内容を共有できるようにしたいと思います。学問の面白さが広がってほしいと願っています。内なる好奇心に向き合い、色々なことに興味を持ちながら自分を磨いていきたいです。:生物物理化学、タンパク質化学ブログでは、専門領域を中心に経験・知識をまとめていきます。専門外の領域に関しても勉強した内容を共有できるようにしたいと思います。学問の面白さが広がってほしいと願っています。内なる好奇心に向き合い、色々なことに興味を持ちながら自分を磨いていきたいです。最終更新日:2019年6月8日。