B5*2が添付の英文説明書に従って調製、希釈されていることを確認する。mlマイクロチューブ(各自で用意)に入れる。μlを添加し、60°Cで3分間保温する。vortexで激しく撹拌し、パラフィンを完全に溶解する。室温に戻るまで、放置する。μlを添加し、vortexで激しく撹拌する。11,000×g、1分間遠心する*4。μlを直接下層(水層)に添加し、ピペッティングにより混合する(下層のみをピペッティングし、上層と下層が混じらないように注意する)。室温で3時間静置して、サンプルを溶解する*5。vortexで5秒間撹拌する。D-Linkと下層(水層)を混合する。11,000×g、30秒間遠心する。90°Cで正確に30分間保温する。vortexで5秒間撹拌した後、室温になるまで放置する(約2分間)蓋に水滴がついている場合は、スピンダウン(1,000×g、1秒間程度)を行う。μlを添加し、vortexで5秒間×2回混合する。軽くスピンダウン(1,000×g、1秒間程度)して*6、界面をクリアにする。ピペットで4の下層(水層)を全て吸い上げ*7、カラムに添加する。2,000×g、30秒間遠心する。カラムに液が残っている場合は、続いて11,000×g、30秒間遠心する。μlをカラムに添加し、11,000×gで30秒間遠心する。μlをカラムに添加し、11,000×gで2分間遠心してメンブレンを乾燥させる。カラムを新しいマイクロチューブ(各自で用意)にセットする。μl*5を直接カラムのメンブレンに加える。11,000×gで30秒間遠心する。エタノールの蒸発(オプション)溶出液に残存しているエタノールを蒸発させるため、マイクロチューブの蓋をあけて90°Cで8分間*8保温する。μlを加えて溶解する。K溶液は-20°Cで6ヵ月間安定である。B5(concentrate)に、4倍量のエタノール(96~100%)を添加する。B5は室温で1年間安定である。μm厚のホルマリン固定パラフィン切片の場合は7枚まで使用できる。