Protocol)組織固定、包埋時の注意事項PCRの成否は固定、包埋された組織の状態に直接影響される。一般的な組織固定、包埋時の注意事項を以下に述べる。固定液は10%ホルマリン液が浸透性がよく、推奨されている。mmとされ、小さな生検材料はそのまま浸漬する。大きい摘出材料では割を入れ固定液の浸透を高め、固定時間は3日以内にすることをお勧めする。佐藤ら2)はAMeX固定を推奨しているので参考にする。通常の方法でエタノール脱水、クロロホルム置換後、融点56~58°Cのパラフィンに包埋する。ウイルス等の外来性遺伝子をターゲットとするときは新鮮な試薬を使用する。mlマイクロチューブ(オートクレーブ処理済み)に滅菌ピンセットで移す。切片量が多すぎると、抽出がうまくいかないので、多い場合はDEXPATを増量する。以下の操作も含め、実験用手袋を着用し、ヌクレアーゼの混入によるDNAの分解を予防する。ついでエタノールで拭いておく。換刃メス、ピンセット等の器具は同様の処置を行った後、UV照射を10分以上行い、DNAの残存によるクロスコンタミを避けるようにする。DEXPATボトルを回転させ、試薬を均一に懸濁させる。mlずつ添加する(約20滴)。1チューブごとにボトル中の試薬を均一に懸濁する。静置しておくとPCR阻害物質吸着樹脂が沈殿するので注意する。マイクロチューブの蓋をし、100°Cで10分間加熱処理する。ヒートブロックを使用すると便利である。23G等)で穴をあけておくと内圧上昇による試料の飛散を防げる。この場合、アルミホイルで軽くマイクロチューブの上部をカバーしておくと水分蒸発を防げる。rpm、4°Cで10分間遠心分離する(図1)。マイクロピペットで上層にできたパラフィン薄膜を避けて、樹脂並びに組織残渣を吸い取らないように水層を分取する(図2)。μlをPCR反応のテンプレートとしてそのまま使用する。使用が標準だが、切片の大きさ、状態で変動する(PCRに用いるサンプル量が多すぎると、PCR反応が阻害されることがあるので注意する)。