LinkPCR法は、これまで多大な時間と労力を要した遺伝子クローニングにとって代わる手法となり、RT-PCRやリアルタイムPCR、DNAシークエンシングなどのさまざまな手法として応用されています。今回は、そのようなPCR法の原理と概要について解説しています。Reaction(ポリメラーゼ連鎖反応)の略で、DNA配列上の特定の領域(目的のDNA領域)を1対のプライマーと耐熱性DNAポリメラーゼを用いて増幅させる方法のことです。プライマーの設計は自由に行うことができますので、PCR法を用いることで、微量のDNAから特定のDNA領域のみを迅速かつ簡便に増幅させることができます。PCR法では「1熱変性→2アニーリング→3伸長反応」という3段階の温度変化による反応を繰り返すことによって、理論的にはDNA量を指数関数的(2n倍:2倍、4倍、8倍...)に増幅させることができます。このため、約20サイクル後には理論的に100万倍にまで目的DNAを増幅させることができます。PCR法での温度変化は専用の装置(サーマルサイクラー)を用いて行いますので、操作自体は簡単です。PCRに必要な物質PCRは、反応チューブの中に、1鋳型DNA、2プライマー、3耐熱性DNAポリメラーゼ、4dNTP、5Mg2+を含む緩衝液が含まれている必要があります。以下にそれぞれの用語を解説しておきます。1鋳型DNA増幅させたい配列を含むDNA断片を用います。DNAやRNAのことで、増幅したいDNA領域を挟むように2か所に設計します。生体内のプライマーはRNAですが、PCR法ではDNAのプライマーを用います。通常のプライマー長は、20塩基程度で設計することが多いです。3耐熱性DNAポリメラーゼPCR法では、反応溶液の高温加熱と冷却を繰り返すため、多くの生物がもつDNAポリメラーゼでは失活してしまい、PCRの反応を連続的に行うことはできません。そこで、100°C近くまでを生育至適温度とする好熱菌がもつ耐熱性DNAポリメラーゼがPCRに用いられています。dTTPの4種類の基質のことです。ポリメラーゼが働くために必要です。PCRの原理PCR法では、以下の3つの段階を繰り返すことによりDNAを増幅します。下図に示したように、まず、92〜95°CでDNAを1熱変性させ一本鎖とし、次に、任意の温度でプライマーを2アニーリングさせます。最後に、72°CでDNAの3伸長反応を行います。PCRでは、これを1サイクルとして、サイクルが1回行われるごとにDNA量を2倍に増幅させます。PCR法の長所と短所それでは、従来の遺伝子クローニングと比較しながら、PCR法の長所と短所について解説していきます。PCR法の長所PCR法の長所としては1クローニングと比べて、簡便かつ迅速に特定のDNA配列を増幅させることができること。2一度に多量のサンプルをPCRに用いることができること。3ごく少量の鋳型DNAでPCRを行うことができること。4実験の再現性が高いこと。PCR法の短所としては1プライマーが絶対的に必要であり、一般的には1対のプライマーで挟まれた領域のDNA以外を増幅させることはできないこと。(PCRでは、プライマーを設計するためのDNA配列が既知であることが大前提となります。)2PCRに用いる耐熱性DNAポリメラーゼは、通常のDNAポリメラーゼとは違い、校正機能(3’→5’エキソヌクレアーゼ活性)がないこと。そのため、PCRサイクル数や増幅させるDNAの長さが長くなるにつれて塩基の取り込みミス(PCRエラー)が増えて、目的DNA配列とは塩基配列の異なる産物が増幅してしまうことがあります。→PCR後の4)アガロースゲル電気泳動によって、目的DNA配列が増幅されたかどうかを確認できます。3PCRでは初期DNA量に関して定量性はないこと。(数十回のPCRサイクルを行なった後にDNAが十分に増幅されたかどうかは確認できますが、初期のDNA濃度に数倍の差があったとしても、数十回のPCRサイクル後にはプラトー現象によって増幅産物の量に差が見られなくなります。)→初期DNA量を定量したい場合、3)リアルタイムPCRによる定量PCRで定量することができます。(リアルタイムPCRを用いると遺伝子発現解析などを行うことができます。)4コンタミしたDNAに1対のプライマーが結合できる領域があると、そのDNAまで増幅してしまうことがあること。PCRの原理と概要についてはこれで以上です。次は「2)RT-PCRによるRNAの検出」について学んで行きましょう。Linkプロフィール管理人:AZARASHI「大学で学ぶような生命科学関連の情報を分かりやすくまとめたサイトがあればなぁ...」「専門用語の意味がよく分からない...」といった悩みを解決することを目指して更新中。Customify.。