AbstractDNAの脱メチル化の機序として、DNA複製を伴う受動的脱メチル化と、DNA複製を伴わない能動的脱メチル化が知られている。植物では、DNAグリコシラーゼが能動的脱メチル化の中心的な役割を果たし、塩基除去修復と協調して脱メチル化が生じることが知られている。哺乳類では、能動的脱メチル化の分子機構を発見したという論文が散見されるものの、いずれもが決定力に欠き、能動的脱メチル化を担う分子機構は不明のまま残されている。おいて特異的に発現するタンパク質が、受精卵において雌性ゲノムを能動的DNA脱メチル化から保護することを明らかにしてきた。PGC7による脱メチル化の保護には、PGC7とヒストンH3の9番目のリジンのジメチル化(H3K9me2)の結合が重要であることも見出している。これまでの研究から、能動的DNA脱メチル化の分子機構には、DNA修復機構の関与が示唆されている。ES細胞にPGC7を過剰発現させ、DNAのアルキル化剤を用いてDNA損傷を誘導した。ES細胞では、DNA修復を阻害しないことが明らかとなった。PGC7によるDNA修復経路の阻害がH3K9me2を必要とすることから、受精卵における能動的DNA脱メチル化の阻害と同じ分子機構であることが示唆された。今後、受精卵では困難であった分子生物学的および生化学的な解析を行い、初期胚におけるDNA脱メチル化の分子機構を解明することを試みる。planned.Reason本研究では、23年度の交付申請書の研究計画に記載したすべての実験を実行することができた。ES細胞を用いて、PGC7が能動的DNA脱メチル化への関与が示唆されるDNA修復を阻害すること、またこの阻害にはH3K9me2が必要なこと、を見出した。これらの研究成果は、能動的DNA脱メチル化の分子機構の解析にES細胞を使用できることを示唆するものである。実験材料にES細胞を使えることの意義は大きく、受精卵では困難であった分子生物学的および生化学的な解析が可能となり、DNAメチル化制御の研究に新たな展開をもたらすことが期待できる。これらのことから、本研究は、「おおむね順調に進展している」と考えられる。1)の阻害剤(CRT0044876)により、受精卵の雄性ゲノムの能動的DNA脱メチル化が部分的に阻害されるという予備的な結果を得ている。repair)の経路に特異的なXPAの阻害剤(UCN-01)の存在下で体外受精を行い、前核形成後に抗メチル化シトシン抗体を用いた免疫染色をおこなう。卵細胞では二本鎖RNAやモルフォリーノオリゴヌクレオチドをマイクロインジェクションすることにより、効率よく遺伝子ノックダウンできることが知られているため、受精前の卵細胞においてBERやNERに関与する分子をノックダウンした後に体外受精を行い、前核形成後に抗メチル化シトシン抗体を用いた免疫染色をおこなうことにより、BERおよびNERのDNA脱メチル化における関与を明らかにする。DNA脱アミノ化が受精卵の雄性ゲノムの能動的DNA脱メチル化に関与するかどうかを、AIDノックアウトマウスを用いて解析する。Funding本研究では、40万円近くを次年度において使用することにしたが、これは、申請者が2011年4月より実験場所を変更したことにより、実験に若干の遅延が生じたことが原因である。マウス飼育装置などの研究設備が整っており、今年度は滞りなく研究を進めることが可能であると考えられる。マウスを用いた解析が中心となる。マウスの購入・飼育費に使用する予定である。