複雑なタンパク質混合物の精製はプロテオミクスにおいて重要な課題の一つです。Kit(以下、PEK)です。哺乳類細胞の全プロテーム及びプロテオーム画分の解析、あるいは哺乳類細胞の正常状態と疾患状態または疾患誘発状態の比較を行うディファレンシャル・プロテオミクス研究などに使用可能です。PEKは用途に応じてC-PEK、S-PEK、M-PEK、TM-PEKの4種類があります。Kit(以下、TM-PEK)について紹介します。いずれも超遠心が不要なため操作が簡便で、穏やかな環境で活性を保ったままタンパク質を抽出できる手法です。M-PEKの特長M-PEKは、哺乳類の細胞や組織から膜タンパク質を変性させることなく3〜5倍に濃縮し、選択的に抽出できるキットです。膜タンパク質に固有の疎水性によって分離するのではなく、細胞膜とタンパク質との実際の結合に基づいて抽出します。mg)から2時間以内に膜タンパク質画分を分離することが可能です。超遠心不要で時間とコストを節約できるため、複数サンプルの同時処理に最適です。タンパク質の変性の恐れがある超音波処理や長時間のボルテックスも不要で、極めて穏やかな条件を使用するため、タンパク質を活性・機能を保持したまま非変性状態で抽出できます。得られたタンパク質は、酵素活性アッセイ、非変性ゲル電気泳動、ウエスタンブロット解析、ELISA、膜タンパク質の翻訳後修飾を調べるためのアッセイ、膜内在性および膜結合タンパク質のSELDIプロファイリング、色素またはビオチンによるアレイ検出のための膜タンパク質のNHSエステル標識など、様々なアッセイに使用可能です。次の図はM-PEKを用いて膜タンパク質を抽出した例です。HEK293細胞をM-PEKを用いて抽出し、得られた可溶性画分と膜画分を用いています。2つの独立した実験から得られた画分を、同量ずつ、内在性アルカリホスファターゼ活性によってアッセイしました。左のグラフが可溶性画分、右のグラフが膜画分です。この結果は、GPIアンカー型膜結合酵素が選択的に分離され、活性状態で抽出されていることを示しています。膜タンパク質の活性保持抽出また、以下の図は、M-PEKにより細胞や組織から選択的に抽出した膜タンパク質を、膜結合および膜内在性タンパク質マーカーを使用し、イムノブロッティングで分析した結果です。M-PEK抽出が膜タンパク質を選択的に抽出していることがわかります。2327.TM-PEKの特長TM-PEKは哺乳類細胞および組織から膜貫通型タンパク質を穏やかかつ効率的に抽出でき、界面活性剤を使用しない画期的な試薬です。GPCR(G-タンパク質共役型受容体)または7-TM(7回膜貫通型タンパク質)は最大の膜タンパク質ファミリーであることが知られており、細胞間伝達から生理的なセンシング機構に至るまでの刺激反応経路に関与しています。vitroで機能解析できるユニークなツールといえます。低分子量のタンパク質からきわめて高分子量のタンパク質まで、また、1回膜貫通型から複数回膜貫通型、さらに、大きなタンパク質複合体まで様々なタンパク質を抽出・濃縮可能です。得られたタンパク質は酵素活性測定や電気泳動、ウェスタンブロットなど様々なアッセイに使用できます。TM-PEKの抽出プロトコール本抽出法は、2ステップの操作で膜および膜結合タンパク質を濃縮します。1を加えて膜透過処理をし、遠心分離により細胞質画分と膜(沈殿)画分とに分けます。AまたはBを混ぜたものを加え、膜タンパク質を可溶化します。Bのどちらかを選択することができます。Aはマイルドな可溶化剤で、壊れやすいタンパク質抽出に適しています。Bは抽出しにくい複数回膜貫通型タンパク質の抽出に適しています。使用する際には、両方のバッファーで抽出効率を試してみると良いでしょう。以下の図は、TM-PEKを用いて膜画分に抽出されたアルカリフォスファターゼの活性を測定したものです。この結果から、活性を保持したまま抽出可能であることがわかります。468細胞から抽出された膜貫通タンパク質によるウェスタンブロットの結果です。X-100で処理しました。SDS-PAGEゲルで泳動し、ニトロセルロースメンブレンに転写。これらをブロッキングし、抗EGFR抗体、抗Frizzled-4抗体、抗CELSR-3抗体でインキュベートした後、HRP標識された二次抗体と化学発光基質によって現像しました。2Aで処理した膜画分です。このようにTM-PEKでは一般的に可溶化が困難な膜タンパク質を、完全長で抽出可能です。以上、M-PEKとTM-PEKを用いたタンパク質の抽出とその特長について紹介しました。キットを活用することで、困難な抽出を簡便に行うことができ、時間やコストの節約にも繋がります。プロテオミクスにおいて重要な課題の一つは複雑なタンパク質混合物の精製です。大腸菌の菌体内は動物細胞などと大きく環境が異なります。アガロースは海藻から得られるポリサッカライド(多糖類)です。アルドリッチジャパン合同会社はメルクのグループ会社です。