Outline:報告者は、ナノ粒子やナノシートに温度応答性の蛍光色素と標準用蛍光色素を利用したレシオ型ナノ温度計を開発し、細胞内エンドソームや筋組織の温度を蛍光顕微鏡報告者は、ナノ粒子やナノシートに温度応答性の蛍光色素と標準用蛍光色素を利用したレシオ型ナノ温度計を開発し、細胞内エンドソームや筋組織の温度を蛍光顕微鏡で計測することに成功している。この場合、蛍光色素はナノシート内部に封入され温度以外の因子の影響は受...報告者は、ナノ粒子やナノシートに温度応答性の蛍光色素と標準用蛍光色素を利用したレシオ型ナノ温度計を開発し、細胞内エンドソームや筋組織の温度を蛍光顕微鏡で計測することに成功している。この場合、蛍光色素はナノシート内部に封入され温度以外の因子の影響は受けず、ナノシートは表面密着性が高いため高い時空間分解能にて表面温度を計測できた。そのデモンストレーションとして、カブトムシの飛翔筋組織に温度応答ナノシートと温度非感受性ナノシートを重ね合わせることによって、レシオ型な組織の温度イメージング像をリアルタイムに捉えることに成功した。酸素応答性ポルフィリン誘導体を導入した薄膜型センサーをナノシート化した場合、酸素濃度の変化を感度良く捉えることもできている。この様に温度やガスのバイオイメージングでは、なるべく厚さが薄いナノシート程、時間分解能が高くなる。感度を上げるためにはより広い領域で強度を稼ぐ必要があるために、空間分解能を下げざるを得なくなる。法)させた後熱架橋によって水中での安定化を確保することでpHセンサー部の構築に成功した。そのデモストレーションとしては昆虫の様な動物の組織のpH変化は時間軸が複雑であるために難易度が高い。そこで、植物に着目し植物の葉の組織にpH非感受性ナノシートと共に密着させて貼付し、高い塩化物イオンの水溶液に葉を曝すとシンポ―トによって塩化物イオンと共にプロトンを細胞内に取り込むことによって起こる、アポプラストpH変化をイメージング像として感度高く捉えることを示した。膜厚はプロトン拡散に影響を及ぼすため薄膜化することで応答速度が速くなることを本研究で実証できた。リポソームは貪食細胞にエンドサイトーシスにて積極的に取り込まれる。リポソームは貪食細胞にエンドサイトーシスにて積極的に取り込まれる。報告者は、カチオン性アミノ酸型脂質のライブラリーを保有し、遺伝子やタンパク質の運搬体とした研究を推進してきた。リポソームは貪食細胞にエンドサイトーシスにて積極的に取り込まれる。報告者は、カチオン性アミノ酸型脂質のライブラリーを保有し、遺伝子やタンパク質の運搬体とした研究を推進してきた。異なることを示してきた。細胞の種類によってもそれらの条件が異なることも示してきた。ボン大学LIMESとの共同研究により、異なる構造のカチオン性アミノ酸型脂質からなるリポソームと免疫細胞との相互作用の分子機構を明らかにしてきた。その結果、ある特定の構造の脂質が特に自然免疫系の免疫細胞の賦活化ならびに獲得免疫系におけるアジュバント効果において、高い活性を示すことを初めて見出した。あるカチオン性アミノ酸型脂質のアルキル鎖長が炭素数で2個異なるだけで、通常のエンドサイトーシス経路から膜融合の経路でリポソームが取り込まれることを見出した。膜融合は、標的細胞に対して、短時間に高効率でリポソームに担持させた薬物を細胞側に移行させることができる。アニオン性アミノ酸型脂質リポソームにおいては、活性化された血小板との相互作用において、脂質の構造の相違がリポソームのζ電位の相違に繋がり、更に血小板凝集塊に取り込まれる効率が異なることも明らかにした。この様な脂質構造と細胞における生理活性との相違をより高い効率でスクリーニングするために、混合脂質のエタノール溶液と担持させたい生体高分子を溶解させた水溶液とをマイクロ流路中で混合して、複合体ナノ粒子を構築し、限外ろ過によってエタノールやナノ粒子未担持の生体高分子を除去した後に、細胞との相互作用を評価する方法を検討している。Outline:高濃度Hbをリン脂質二分子膜にて内包したヘモグロビン小胞体を人工赤血球として研究開発している。リン脂質としては、両イオン性のホスファチジルコリン型脂質高濃度Hbをリン脂質二分子膜にて内包したヘモグロビン小胞体を人工赤血球として研究開発している。リン脂質としては、両イオン性のホスファチジルコリン型脂質、アニオン性ホスファチジルグリセロール型脂質、ポリエチレングリコール(PEG)結合ホスファチジルエ...高濃度Hbをリン脂質二分子膜にて内包したヘモグロビン小胞体を人工赤血球として研究開発している。リン脂質としては、両イオン性のホスファチジルコリン型脂質、アニオン性ホスファチジルグリセロール型脂質、ポリエチレングリコール(PEG)結合ホスファチジルエタノールアミン型脂質の混合体を用いているが、特にアニオン性脂質による血小板や白血球の活性化が課題となっていた。L-グルタメートを基本骨格とし、これに無水コハク酸をアミド結合させたアニオン性グルタミン酸型脂質や、片末端をカルボン酸としたPEGを結合させたPEG結合グルタミン酸型脂質、更にはグルタミン酸をα位やγ位を選択的に結合させた両イオン性脂質を合成した。これらを混合してヘモグロビン小胞体を調製し、血液適合性を検討した結果、以下の知見を得た。グルタミン酸型脂質は簡便合成可能で、対応するリン脂質の置き換えが可能であった。アニオン性の新規グルタミン酸型脂質脂質は血小板の活性化を全く認めず、従来のホスファチジルグリセロール型脂質を使用による副作用を解決できた。従来のポリエチレングリコール(PEG)結合ホスファチジルエタノールアミン型脂質は、白血球、特に好中球の活性化を認めたが、新規のPEG結合グルタミン酸型脂質では白血球の活性化が認められなかった。両イオン性のグルタミン酸型脂質では、α位とγ位の結合で分子集合挙動には大きな相違が認められ、前者では単独で小胞体構造、後者では単独でリボン状構造が形成された。コレステロールとの混合により両者とも小胞体構造を形成するものの、前者の方が安定であった。前者の場合、白血球数の増減に影響が認めれられた。結論として、アニオン性脂質、PEG結合性脂質を新規のグルタミン酸型脂質に置換することに成功したが、両イオン性の脂質には更なる分子設計が必要と思われた。コレステロールとの配置を考慮してグルタミン酸とグルタミン酸との間に何らかのスペーサーが必要であると推測される。今回の研究成果により非常に安価なグルタミン酸型脂質により高価なリン脂質の代替と、それによる血液適合性の向上が実現でき、リポソーム製剤の安定度向上に対して大きな進展となった。リソグラフィー加工によって得られたナノスケールのパターンを利用した多様な形状の高分子ナノシート(ポリスチレンナノシート、アルブミンナノシート、多糖類電解質ナノシート)を大量に構築する技術を確立する。リソグラフィー加工によって得られたナノスケールのパターンを利用した多様な形状の高分子ナノシート(ポリスチレンナノシート、アルブミンナノシート、多糖類電解質ナノシート)を大量に構築する技術を確立する。vivo評価系と血管損傷モデルを用いて明らかにすることを目的としている。ODMS)からなる親-疎水マイクロパターン基板(ODMS-SiO2基板)上に、チオール基を複数導入させたrHSA(SH-rHSA)を吸着、架橋により2次元高分子体とし、rHSAナノシートの剥離体を構築した。シートの片面に蛍光標識ラテックスビーズ(LB)を結合させ、ヘテロな表裏を持つナノシートを共焦点顕微鏡にて観察した。g/mL)を蜜に吸着させ、未吸着SH-rHSAを除去後、銅(II)イオンを含む酢酸緩衝液中に静置した。界面活性剤(C12E10)処理により剥離させた分散系をフィルターに捕捉し、共焦点顕微鏡にて観察したところ、ほぼパターン通りの形状を維持したシート(膜厚約7nm)が鮮明に3次元観察できた。nm)として共焦点顕微鏡観察したところ、湾曲したシート全面が赤色に発光した。nm)に設定したところ、シート状に黄色発光したが湾曲部が消光(蛍光エネルギー移動)した様子が観察できた。これは、湾曲部の裏面にLBが存在しているためと考えられる。以上より、シートの片面のみを修飾できたことを共焦点顕微鏡観察によって初めて証明できた。(リポソーム)を用いたドラッグデリバリーシステムの研究と開発を行っている。(リポソーム)を用いたドラッグデリバリーシステムの研究と開発を行っている。リポソームに抗体を結合させたり、遺伝子を担持させる研究を進めてきた。(リポソーム)を用いたドラッグデリバリーシステムの研究と開発を行っている。リポソームに抗体を結合させたり、遺伝子を担持させる研究を進めてきた。医用高分子からなるナノシートの開発に成功し、ナノ絆創膏などとして医療応用を目指している。)水溶液をキャストし、さらにカチオン性脂質のナノシート(約5~10nm厚)を形成させて3層構造を形成する方法を検討した。これを基板ごと水槽に浸漬させることで、犠牲膜であるPVA層が水に溶解し、3層構造の薬物担持リピッドナノシートが遊離する。得られ、ずり応力を撹拌速度やホモジナイザー、超音波照射によって強くするとそれに応じてリポソームの粒子径が小さく制御される。本法の利点は、アニオン性のバイオ医薬品の担持効率を究極に高めることであり、若干の漏出は溶解したPVAを限外濾過にて除去する際に除去できる。検討の結果、この方法の最大の課題はバイオ医薬品(例えば成長因子)のキャスト後の状態であった。スピンコート法で形成されたリピッドナノシートに成長因子をキャストした場合、凝集や相分離など不均一な状態で乾燥するとその上に平滑なリピッドナノシートを構築することができない。成長因子をスピンコートすることで平滑なナノシートを構築することができるものの、スピンコート時に相当量の成長因子が損失してしまうことも明らかとなった。ダイコーターなどで成長因子をコートし、更にその上にリピッドナノシートを構築する方法が有効と思われた。そのためにはマイクログラビアなどの薄膜連続作成装置ならびに多量のリピッドとバイオ医薬品(例えば成長因子)を必要とするので、経済的な理由で進めることができなかった。この検討により、アニオン性バイオ医薬品をカチオン性多糖類とポリイオンコンプレックスを作らせてナノシートに担持させる手法の契機になり、次に繋がる展開となった。DiBenzoCycloOctyne)を分子設計し、有機合成した。DiBenzoCycloOctyne)を分子設計し、有機合成した。本プローブは蛍光分子であるフルオレセインの誘導体と無触媒クリック分子であるジベンゾシクロオクチンをカップリングした構造であり、細胞膜を自由に透過できる性質を持っている。従って、もし生細胞内にアジド基を有する標的分子があればそれと結合して蛍光標識するが、標的分子がない場合にはそのまま細胞を透過してしまい、培地の洗浄によりほぼ完全に細胞内から除去される。本実験条件では細胞毒性は認められなかった。ゴルジ体→細胞膜)を蛍光イメージングすることができ、生細胞内アジド基修飾分子の動態解析に対する本プローブの有用性を実証した。Outline:生細胞のミトコンドリア温度を測定するために、ミトコンドリアに局在するレシオ型温度応答性蛍光プローブを分子設計を行い、有機合成した。本プローブは温度応答生細胞のミトコンドリア温度を測定するために、ミトコンドリアに局在するレシオ型温度応答性蛍光プローブを分子設計を行い、有機合成した。本プローブは温度応答性を示すローダミンBと温度に不感応なローダミン101のスペーサーにて結合させた構造であり、ローダミ...生細胞のミトコンドリア温度を測定するために、ミトコンドリアに局在するレシオ型温度応答性蛍光プローブを分子設計を行い、有機合成した。本プローブは温度応答性を示すローダミンBと温度に不感応なローダミン101のスペーサーにて結合させた構造であり、ローダミンBの蛍光強度/ローダミン101の蛍光強度の比は、温度上昇に比例して減少するので、濃度変化や焦点ブレに関係なく温度変化のみを検出できる。試験管レベルで検量線を作成したところ、2.72%/°Cの温度感受性を有することが明らかとなった。本プローブは細胞に振り掛け約30分静置すると細胞膜を透過してミトコンドリアに集積する性質を持っているので、測定したいタイミングでミトコンドリアのみの温度を計測できる。測定条件では細胞毒性は認められなかった。脱共役剤(FCCP)をHeLa細胞の培地に添加したところ添加約5分後に有意な温度上昇が観測された。Outline:生細胞のミトコンドリアに集積して温度を計測するレシオ型蛍光プローブ(Mito-RTP)を開発した。本プローブは、温度感受性の無いNIR-rhodami生細胞のミトコンドリアに集積して温度を計測するレシオ型蛍光プローブ(Mito-RTP)を開発した。Bを共有結合させており、ミトコンドリア集積能を持...生細胞のミトコンドリアに集積して温度を計測するレシオ型蛍光プローブ(Mito-RTP)を開発した。Bを共有結合させており、ミトコンドリア集積能を持つと共に蛍光強度比によって絶対温度が計測できる。HeLa細胞にMito-RTPを添加すると30分以内にミトコンドリアに集積し、培地温度を上昇させた際の温度依存性は-2.72%/°Cであった。°Cの熱産生が引き起こされていた。Outline:当研究室にて保有しているカチオン性アミノ酸型脂質ライブラリーを用いて、カチオン性アミノ酸型脂質リポソームを調製し、これをTHP-1細胞やマクロファージ当研究室にて保有しているカチオン性アミノ酸型脂質ライブラリーを用いて、カチオン性アミノ酸型脂質リポソームを調製し、これをTHP-1細胞やマクロファージにアプライした。リポソームの粒子径やゼータ電位は殆ど相違しないにもかかわらず、脂質の分子構造が僅か...当研究室にて保有しているカチオン性アミノ酸型脂質ライブラリーを用いて、カチオン性アミノ酸型脂質リポソームを調製し、これをTHP-1細胞やマクロファージにアプライした。リポソームの粒子径やゼータ電位は殆ど相違しないにもかかわらず、脂質の分子構造が僅かに異なるだけで細胞との相互作用が大きく異なることが明らかとなった。主としてエンドサイトーシス機構で取り込まれるもの、膜融合機構で取り込まれるもの、殆ど細胞に取り込まれないものに分類された。膜融合機構で取り込まれるカチオン性リポソームはアニオン性のsiRNAやタンパク質など生理活性高分子を高い効率で運搬することが示唆され、従来にない生理活性高分子の細胞内運搬が見込まれる。Outline:医用高分子の薄膜(ナノシート)は、創傷被覆用”ナノ絆創膏“として注目されている。本計画では、生分解性ナノシートの分解特性を、外見観察による形態や大きさ医用高分子の薄膜(ナノシート)は、創傷被覆用”ナノ絆創膏“として注目されている。本計画では、生分解性ナノシートの分解特性を、外見観察による形態や大きさの変化、顕微鏡観察による表面のラフネスの増大や膜厚の変化、構成分子量の低下などから解析した。37°C...医用高分子の薄膜(ナノシート)は、創傷被覆用”ナノ絆創膏“として注目されている。本計画では、生分解性ナノシートの分解特性を、外見観察による形態や大きさの変化、顕微鏡観察による表面のラフネスの増大や膜厚の変化、構成分子量の低下などから解析した。37°Cの生理食塩水中に自己支持状態で震盪させたところ、PDLLAナノシートでは3週間ごろからこより状になったが破断は見られず、7週間でも膜厚は変化しなかった。PLGA5050ナノシートでは膜表面が粗くなり日数と共に小さな孔が大きくなって4週間で破断につながった。K溶液による分解試験では、多孔質化と共にナノシートの膜厚の減少が認められ、その程度はPLGA>PDLLA>ポリカプロラクトンの順であった。