Aベストアンサーまず、一本鎖と二重鎖の違いがあります。一本鎖では塩基対を作る部分で水素結合ができないので(分子内や分子間で部分的に対合ができることがあったとしても)チャージが裸のまま残ります。してはたらき、共有結合をアタックしたり、水分子からアタックを受けたりします。一本鎖DNAもRNAほどではないにしても、二重鎖にくらべ非常に不安定です。して働くからではないでしょうか。生体内や生体から抽出された核酸は分解酵素によって盛んに分解されます。なかでもRNaseは活性が高く失活もしにくいので、実験中のRNAの分解をさけるために、これをいかにして除くかということにとくに神経を使います。生体内ではDNAは遺伝情報を保持するものですから、そうそう簡単に分解されては困ります。それに対して、RNAは必要なときに存在して、用がなくなったらとっととなくなってくれないと困りますので、RNAは不安定な方が合目的的です。実際、原核生物ではRNAの寿命は非常に短く、転写のレベルでダイレクトに発現量を調節しています。tailでRNAの寿命が調節されているほか、転写後調節の仕組みがあるので、もうちょっと複雑ですね。一本鎖と二重鎖の違いがあります。一本鎖では塩基対を作る部分で水素結合ができないので(分子内や分子間で部分的に対合ができることがあったとしても)チャージが裸のまま残ります。してはたらき、共有結合をアタックしたり、水分子からアタックを受けたりします。一本鎖DNAもRNAほどではないにしても、二重鎖にくらべ非常に不安定です。ひとつは、おそらくデオキシリボースの-Hに対し、リボースの-OHはチャージを生じるので同じように求核試薬...続きを読む他の回答も見るQRNA抽出について私は長年タンパク質専門で研究を行ってきたため、分子生物学は学生時以来なので大変困っております。ラットの凍結組織(肝臓)からRNA抽出を行いましたが、うまくいきません。言え、同時に10本行ったらうち4~5本はOK、4本行ったら2本OK、と言った具合でいくつかは成功します。eliminatorカラムも使用しています。中に入っているプロトコル通りであることも確認しました。組織の保存状態は悪くないです。古いというわけでもありません。研究室の人間に聞いても満足な返事が返って来ないので、こちらで質問させていただきました。経験がある方、アドバイス宜しくお願い致します。質問者さんは組織の保存状態についてわざわざ言及されているので、その点は問題ないとして書き込ませていただきます。私の感覚ですが、RNA抽出の過程にはものすごく強いタンパク質変性剤を使用しますので、そのタンパク質変性剤の存在下では、まずRNAが分解されることはありません。最終的にはタンパク質変性剤が存在しない溶液にRNAは溶けている状態になるので、そのときに、それまでに取り除けなかったRNaseの活性復活、もしくはその最後の溶液にRNaseがコンタミしていると最悪の結果になります。それで私だったらまず疑うのは、最終的に溶かす水です。これには少量でもコンタミするとRNAは壊れてしまうと思います。電気泳動するとわかると思います。この方法で使われている試薬等をチェックすると犯人がわかるときがあります。タンパク質変性剤に含まれている場合はわからないかもしれません。次に疑うのは、組織の量です。確かにキット等では上限が記されているとは思いますが、試薬に少量コンタミしたRNaseより、最も多くのRNaseは組織由来のものであると私は思います。多すぎるRNaseは最終的に残る可能性を大きくしてしまうと思います。組織の量を控えめにしてみてはいかがでしょうか。回収がうまくいっていないためであると考えられます。回収については実際見ていないので何ともいません。初期の段階で分解されるというのならば、やはり試薬のRNaseのコンタミをチェックするのがはやいかもしれません。RNAがとれたりとれなかったりするのは、RNaseのコンタミが、なんと言うか、うまくいくかいかないかのギリギリのところをさまようようなコンタミ具合で、うまい人はいけるけどそうでない人は時々壊れるといったことなのかもしれません。後はもう1つは、うまくいっている人と質問者さんが同時に同じサンプルでやることですかねぇ・・・。質問者さんは組織の保存状態についてわざわざ言及されているので、その点は問題ないとして書き込ませていただきます。私の感覚ですが、RNA抽出の過程にはものすごく強いタンパク質変性剤を使用しますので、そのタンパク質変性剤の存在下では、まずRNAが分解されることはありません。違いを教えて下さいこんにちは。バイオ、生化学系の実験に従事しているものですが「水」について教えて下さい。水道水、脱イオン水、MilliQ、蒸留水(二段蒸留水)、超純水の違いを教えて下さい。お互いの関係などありましたら(○○を~すると△△になる等)教えていただけるとわかりやすいかもしれません。実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?よろしくお願いいたします。AベストアンサーpinokoBBさん、こんにちは。複数回組み合わせて生成します。プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は除けません。蒸留法は水を蒸留することで不純物を除く方法です。イオン交換法と組み合わせて2回蒸留することが一般的です。一般的な2次蒸留水の比抵抗は数MΩ・cmでバイオ・生化学関係には十分な純度です。動物培養細胞にも使用可能です。エンドトキシンも完全にフリーとまではいかないけれどもある程度の除去はできています。蒸留法は多くの不純物を除去可能ですが100度付近の沸点を持つ物質は除けません。逆浸透法は半透膜に圧力をかけて精製する方法です。限外濾過法は限外濾過膜を通す方法です。孔径は半透膜が数十nmに対し、限外濾過膜は数nmです。それゆえ、数kDa以上の分子であれば、限外濾過法で除けますので、エンドトキシンやRNaseなども除去できます。本当にエンドトキシンフリーな水が必要でしたら限外濾過法を行った水が必須です。普通のCOSとかHEKとかの動物細胞培養でしたら2次蒸留水でも十分です。蛍光検出用のマイクロアレイなんかは限外濾過水が必須なようです。超純水は十数MΩ・cmの水のことです。MilliQはミリポア社の超純水装置を用いて作った水で比抵抗は15MΩ・cm以上と高純度の水です。用いて精製しているようです。>また、実験内容によってはエンドトキシンを気にする実験もありますが、エンドトキシンフリーの水を使う場合はどれを選べばよいのでしょうか?これに関しては上で書いたように限外濾過膜で精製した水です。MilliQが当てはまるでしょう。(超純水も一般的には限外濾過をしているのでこれも当てはまりますかね。)>動物細胞培養用に使う場合はどの水を選べばよいのでしょうか?これは、2次蒸留水以上の純度があれば十分です。2次蒸留水、MilliQ水、超純水が使用できます。水関係の装置は日頃のメンテナンスが重要でイオン交換樹脂とか水を貯めるタンク、蛇口に汚染がないかは確認する必要があります。実験書には必ずはじめのほうに書いてあることですので、pinokoBBさん自身でなにか実験書をご参照ください。pinokoBBさん、こんにちは。複数回組み合わせて生成します。プレフィルターは鉄さびや大き目のゴミを取り除くに用います。イオン交換法は酸性・強アルカリ性の樹脂を通し、イオン化合物を除く方法でこれを行った水がイオン交換水(脱イオン水)です。水の純度の評価には比抵抗を用いますが、およそ数百kΩ・cmの水が得られます。この段階で除けるのはイオン化合物だけで有機物・微生物は...続きを読む他の回答も見るQエタノール沈殿での70%エタノールと100%エタノールの使い分けエタノール沈殿をする際に、「70%エタノール」と「100%エタノール」を使用しますが、どうしてこの2種類の違う濃度のエタノールを使用するのか単純に疑問に思っています。別に70%エタノールで洗浄して、もう一度70%エタノールで洗浄してもいいと思いますし、逆に両方とも100%エタノールでもいいのではないかと素人の私は思ってしまいます。70%エタノールと100%エタノールを使い分ける意味を知っている方がおられましたら、お暇な時で結構ですので教えて頂ければ幸いです。Aベストアンサーエタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。100%エタノールにも溶けません。エタノール沈殿における「洗浄」というのは、余計な塩を取り除くということです。塩は水に溶けますが、アルコールには溶けません。なんで、洗浄の時に100%エタノールを使っても塩を溶かし込んで覗けないということになります。70%エタノールの30%は水であるということが重要なのです。30%の水に塩を溶かして洗浄すると想像してください。簡単なエタノール沈殿ですが、それぞれに意味があり、かつよく考えれられてデザインさているのです。いうことをきちんと理解して実験することは重要だと思います。エタノール沈殿の原理は省いて簡単に書きます。DNAが塩析してくる最適なエタノール濃度が70%ほどであるのです。通常、100%エタノールをもとの液の2~2.5倍ほど加えると思います。すると最終的にエタノールの濃度は70%ほどになるはずです。このように最終的に70%ほどの濃度にする、ということが目的なので最初に加えるエタノールは100%じゃないとかなり面倒なことになると思いませんか?そして洗浄のときですが、70%エタノールではDNAは溶けません。STDEVとSTDEVPの違いエクセルの統計関数で標準偏差を求める時、STDEVとSTDEVPがあります。両者の違いが良くわかりません。宜しかったら、恐縮ですが、以下の具体例で、『噛み砕いて』教えて下さい。(例)セルA1~A13に1~13の数字を入力、平均値=7、STDEVでは3.89444、STDEVPでは3.741657となります。平均値7と各数字の差を取り、それを2乗し、総和を取る(182)、これをデータの個数13で割る(14)、この平方根を取ると3.741657となります。STDEVとSTDEVPの違いは何なのでしょうか?統計のことは疎く、お手数ですが、サルにもわかるようご教授頂きたく、お願い致します。Aベストアンサーデータが母集団そのものからとったか、標本データかで違います。母集団そのものだったとしても(例えばクラス全員というような)、その背景にさらならる母集団(例えば学年全体)を想定して比較するような時もありますので、その場合は標本となります。標本データの時はSTDEVを使って、母集団の時はSTDEVPをつかうことになります。公式の違いは分母がn-1(STDEV)かn(STDEVP)かの違いしかありません。感覚的に理解するなら、分母がn-1になるということはそれだけ結果が大きくなるわけで、つまりそれだけのりしろを多くもって推測に当たるというようなことになります。AとBの違いがあるかないかという推測をする時、通常は標本同士の検証になるわけですので、偏差を余裕をもってわざとちょっと大きめに見るということで、それだけ確証の度合いを上げるというわけです。他の回答も見るQRNAの電気泳動RNAの電気泳動についての質問です。vitroで作成し、できたRNAが目的の長さのものかどうか、スメアとなっていないか確かめるために行っています。マニュアルどおり(アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合)にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。(1)1レーンあたりサンプルRNAを2μg(吸光度より)流しているのですが、バンドが見えません。RNAだとDNAに比べてバンドが出にくいとかあるのでしょうか?5μg流したところでやっとバンドらしきものが見えました。(2)さらに市販のRNAマーカーもバンドが出ません。マニュアルどおり1レーンあたり2μl使ってもバンドがなく、10μl使っても同様に見えませんでした。なにが悪いのでしょうか?RNaseには気をつけているつもりなのですが・・。マーカーが出ず、サンプルのサイズが不明なままなのです。なにか良い方法はないでしょうか?DNAをメインに扱っていたもので疎い部分もありますが、よろしくお願い致します。Aベストアンサー>マニュアルどおり(アガロースホルムアミド、サンプルにエチブロを混合)にやっているのですが、なかなかバンドが出てくれません。いうマニュアルがあるのかしら。EtBrを泳動バッファーとゲルに入れておくという方法はありますが、サンプルに混合というのもあまりスタンダードではないです。ErBrは核酸と逆方向に流れますから、泳動しているうちにどんどん離れていってしまいます。二本鎖だとインターカレートしたEtBrが多少は核酸といっしょに移動するでしょうが、変性状態のRNAではそれもほとんどないでしょう。結論としては、泳動後のゲルをEtBr溶液中で染めるべきです。検出感度は二本鎖(1バンド1ng前後)に比べ、RNAのような一本鎖では10倍くらい低いです。それもホルムアルデヒド存在下だとさらに低くなるので、場合によっては、ゲルを蒸留水などで何度か洗ってホルムアルデヒドを抜いてやる必要があります。他の回答も見るQエタ沈後のペレットを確実に溶解させるにはプラスミドのTE(pH8)に対する溶解度は高いんですか?エタ沈後、エタノールを除去するとプラスミドの沈殿が残りますが、これをTEに溶かすことがあるんですが、どのようにして溶かしたらいいんですか?溶解度が高いんならほっとけばいいと思いますが。エタ沈はWAKOのエタ沈メイトというキットを使っています。大量のエタノールを入れて精製した場合、チューブの壁面に沈殿が付くと思いますが、沈殿後に加えるTEの液料が少ない場合は液に接しない壁面の沈殿はどうやって溶かせばいいですか?ピペットで落とすしかないんでしょうか?また、完全に溶解したかどうかはどうやったら確認できますか?透明になっていれば溶解したということになるんでしょうが。沈殿自体が見えにくいのでなかなか苦労しています。Aベストアンサープラスミド自体の溶解度は悪くありません。大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。操作によって非常に溶けにくくなることがあります。1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。実際、アイソトープラベルしたDNAを真空乾燥させると、溶液中に回収できずチューブに残る放射活性が非常に高いことがわかります。室温で放置、または37度くらいで穏やかに温めて乾燥させるのがいいです。2.Mg++が存在するとDNAが非常に溶けにくい塩を作って溶けにくくなります(逆にこれを利用してEtOH沈殿の回収率を高める方法もあります)。これは純水に溶かそうとするときには難儀ですが、TEに溶かすのであればキレートされるのでそれほど問題ではありません。沈殿を少量の溶媒に溶かすときには、タッピング(チューブの底をはじく)で、溶媒が十分な範囲をなめるようにすると良いでしょう。チューブの性質にもよりますが、沈殿が付いているところは、水はじきが悪くて液が残ります。壁に付いた液が軽くはじいただけできれいに取れるようになったら、溶けていると溶けたと思っていいでしょう。kb以下の小さなプラスミドならVortexを使ってもかまいません。プラスミド自体の溶解度は悪くありません。大量でなければ、沈殿は透明でほとんど見えません。見えているとしたら不純物のためです。溶けない沈殿が残ることがありますが、プラスミド自体は上清にちゃんと溶けていています。操作によって非常に溶けにくくなることがあります。1.むかしは真空乾燥をするのが普通でしたが、これはDNAを溶けにくくさせるうえ、変性させるという報告もあるので、やめたほうが良いといわれています。精製度によると思います。簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4°Cで分解なく保存できます。私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4°Cで保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。長期保存する場合、注意する点は、溶媒をTEにしておくこと(純水だとpHが酸性に偏るなどが原因で分解が起きやすくなる)、DNA濃度をあまり低くしないことです(たとえば数十ng/uL以上にする、水分子によるアタックを抑えるため)。-20°C、-80°Cなどで凍結保存すれば、粗精製のDNAでも半永久的に保存できます。凍結融解で物理的にせん断されてくるので、バックアップとして長期保存する場合はともかく、日常使うサンプルとしては避けたほうがいいでしょう。凍結を防ぐためにエタノールを加えてフリーザーに保存し、使うときになったらエタノール沈殿で回収するというのもいいでしょう。乾燥沈殿で保存するのは、確かに安定ですがゲノムDNAの場合再溶解が困難になるのでやめたほうがいいですね。精製度によると思います。簡易な方法で粗精製したものだと数週間から数ヶ月で明らかな分解が認められることがありますが(それでもPCRには使えるかもしれませんが)、超遠心法、フェノール抽出を慎重に行う、イオン交換カラムで精製などでnucleaseのコンタミを排除しておけば、数年単位の長期間にわたり4°Cで分解なく保存できます。私は最近、3年以上前にQiagenのDNaesyで精製してそのまま4°Cで保存したゲノムDNAを使いましたが、電気泳動像に分解は認められずPCRの増幅も良好でした。長期保存する場合、注...続きを読む他の回答も見るQnanodropの測定精度についていつも御世話になってます。nanodropでDNA濃度を測定しているのですが、電気泳動での濃度と著しく一致しません。nanodropでは1μg/μl以上の数値が出るのに、泳動してみると数百ngしか出てこないんです。何度もやっているので、泳動の技術的な問題ではない気がするのですが。nanodropは核酸を測るものなので、RNAが多いのかとも思ったのですが、泳動ではRNAはでてこないし、RNaseも添加しているためそうとは考えにくいのです。通常DNAの260/280比は1.8くらいらしいのですが、私の場合では1.9代がほとんどで、260/230比も2.3付近と高い数値が出てしまいます。どなたかご助言いただけたら幸いです。Aベストアンサーいろいろと考えられますが、ゲノムDNAなど分子量の大きなもののコンタミがないものとして、nanodropでの測定で時間がかかってませんか?1μlを乗せてsample名などを入力して。濃度がかなり上昇します。水分の蒸発が主な原因です。2ulほど乗せて数回すばやく計測してみて変化が無ければ、蒸発ではないと思います。あとよくあるのはATPやdNTPなどゲルに流してもわからない低分子量の核酸のコンタミです。「保存」16ウエスタンブロットのメンブレ...17冷凍アカムシっていきているの...18メダカを冷凍して、解凍する。Inc.Q質問する(無料)Q&A検索goo検索gooIDで新規登録・ログイン新規登録する(無料)会員の方はこちら外部サービスのアカウントで新規登録・ログインYahoo!で新規登録・ログインGoogleで新規登録・ログインTwitterで新規登録・ログインFacebookで新規登録・ログインdアカウントで新規登録・ログイン※各種外部サービスのアカウントをお持ちの方はこちらから簡単に登録できます。お客様の許可なしに外部サービスに投稿することはございませんのでご安心ください。会員でない方、会員になるとあなたも質問や回答ができるようになります!!親切・丁寧な回答が集まる場30分以内に回答がもらえ回答数は平均3件!匿名(ニックネーム)での投稿なので。