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一、 前言
纳米抗体首先在骆驼体内被发现，这些抗体属于重链抗体类别，其尺寸比包括人类在内的许多其他生物体内发现的抗体要小得多，同时也更便于进行编程[1]。相较于传统抗体，纳米抗体作为一种具有高度可塑性且相对新颖的抗原识别与调控工具，具有尺寸小、易于表达、筛选及改造、高亲和性和稳定性等优良特性。这使得纳米抗体能够识别传统抗体难以识别的较为隐蔽的抗原表位，从而在诊断和治疗各类疾病及检测方面取得了深入的应用[2]。
在生物信息学和计算生物学领域，蛋白质的三级结构预测是一个研究重点，因为这可以揭示纳米抗体结构与功能之间的关系，为蛋白质工程和药物设计等领域提供理论基础。过去几十年，蛋白质三级结构预测方法不断改进。传统预测方法主要包括同源建模、线性模型、支持向量机等，但这些方法在预测精度和速度方面存在很大的局限性[4]。近年来，随着深度学习技术的迅猛发展，基于深度学习的蛋白质预测方法被认为是蛋白质结构预测的未来发展方向[5]，已经在该领域取得了显著的进展[6]。
深度学习是机器学习的一个分支，通过多层神经网络模型学习数据的高层次表征。在图像识别、自然语言处理、语音识别等领域取得了巨大的成功，其强大的表示学习能力使其在处理复杂数据时具有优势[7]。蛋白质序列和结构数据的复杂性促使了深度学习成为解决此类问题的理想方法。
AlphaFold项目是最引人注目的一个例子。该项目由DeepMind开发，在2018年的第13届蛋白质结构预测技术评估测试（CASP13）中表现出色。AlphaFold在自由建模（FM）类别中名列第一，这一类别专门针对评估预测新蛋白质折叠能力的方法[8]。AlphaFold在43个自由建模领域为24个领域创建了高精度结构[9]。
与AlphaFold类似，近年来还有许多新的蛋白质通用预测软件被相继研发。例如，RosettaFold是一种蛋白质结构预测软件，它利用了Rosetta蛋白质分子建模软件，可以通过计算机模拟来预测蛋白质的结构[10]。而trRosettaFold与之类似，也是一种基于Rosetta的蛋白质结构预测软件，但它采用了一种名为“template-free”的方法，在无需已知结构的情况下进行蛋白质结构预测[11][12]。另外，针对纳米抗体结构预测的软件如NanoNet，该深度学习模型可实现快速、准确的纳米体建模[13]，它可以直接从序列中生成VH域的主链和Cβ原子的三维坐标，且相对于通用预测软件而言，更小、更快。
本文旨在探究各预测软件在纳米抗体三级结构预测方面的效果，以了解哪些软件具有最高的预测精度。为此，本文将采用TM-score作为预测效果的评估指标。TM-score是一种评估蛋白质结构拓扑相似性的指标，主要关注整体折叠相似性而非局部结构相似性[14]。
二、 文献综述
2.1 蛋白质结构预测工具
蛋白质结构预测是计算生物学和生物信息学领域的重要课题。准确地预测蛋白质的结构对于理解生物过程、揭示蛋白质功能及研发新药具有重要意义。随着近年来深度学习技术的兴起，大量蛋白质结构预测工具不断涌现。本综述将重点探讨以下四种基于深度学习的蛋白质结构预测工具：AlphaFold、RosettaFold、trRosetta和NanoNet。
2.1.1 AlphaFold
 
图 1 AlphaFold工具在样例蛋白质上的预测效果
AlphaFold是一种由DeepMind开发的基于神经网络的蛋白质结构预测方法。通过多层次的神经网络模型以及卷积神经网络（CNN）和残差网络（ResNet）等模块，AlphaFold尝试模拟氨基酸序列与蛋白质结构之间的关系。在2018年的第13届蛋白质结构预测技术评估测试 (CASP13)中，AlphaFold表现出色，尤其在自由建模（FM）类别中，该类别用于评估方法在预测新蛋白质折叠方面的能力[8]。
AlphaFold采用距离概率矩阵进行蛋白质结构预测。首先，计算给定氨基酸序列下所有残基之间在固定子空间内的距离概率分布。接着，将距离概率矩阵与氨基酸序列通过神经网络进行融合，并以最小化配对损失为目标进行最优化。最后，AlphaFold通过梯度下降算法迭代更新网络参数，不断提高距离概率矩阵的精度[15]。
2.1.2 RosettaFold
 
图 2 RosettaFold论文封面
RosettaFold是一种蛋白质结构预测软件，基于Rosetta蛋白质分子建模软件。RosettaFold通过深度学习技术，尤其是卷积神经网络（CNN），对氨基酸序列进行编码和解码，以预测蛋白质的三维构象[16]。
RosettaFold使用了一个深度神经网络模型，输入包括氨基酸序列以及二级结构、网络接触和残基接触的预测信息。将这些输入信息通过神经网络处理后，RosettaFold可以输出蛋白质的主要构象。在测试任务中，RosettaFold表现出较高的预测精度。
2.1.3 trRosetta
 
图 3 trRosetta图标
trRosetta是一个基于Rosetta的蛋白质结构预测方法，采用一种称为“template-free”的方法。这意味着，无需依赖已知的蛋白质结构，trRosetta也可以进行预测。trRosetta的关键技术包括残基网络接触图生成、残差网络以及图卷积算法[11][12]。
首先，根据氨基酸序列生成残基网络接触图。接着，将序列编码为一个维度固定的向量，传递给残差网络和图卷积算法。通过迭代训练，学习到的网络参数可以帮助trRosetta高度精确地预测蛋白质的三维结构。
2.1.4 NanoNet
NanoNet 是一种专门为纳米蛋白设计的深度学习模型。纳米蛋白具有独特的物理和化学性质，因而需要特定的预测方法。NanoNet 是一个基于卷积神经网络（CNN）的模型，能够直接从氨基酸序列中生成整个VH域的主链和Cβ原子的三维坐标[13]。
与其他通用蛋白质结构预测软件相比，NanoNet更加高效和准确。在对特定靶点纳米抗体结构的预测任务中，NanoNet能够能快速生成极具参考价值的预测结果。
2.2 评估方法
为了衡量蛋白质结构预测工具的精度和性能，研究者们设计了多种评估指标。这些评估指标用于量化预测结构与实际结构的差异。本综述将介绍以下四种评估方法：RMSD、TM-score、GDT-TS和QMEAN。
2.2.1 RMSD
 
图 4 RMSD的公式
Rooth Mean Square Deviation (RMSD) 是预测结构与实际蛋白质三维坐标之间偏差的平均平方根。RMSD反映了预测结构与真实结构之间的相似程度。RMSD值越低，表示预测结构与实际结构越接近[17]。
2.2.2 TM-score
 
图 5 TM-score的公式
TM-score是一种基于正态分布的指标，用于评估蛋白质拓扑结构的相似性。它主要关注整体折叠情况的相似性，而非局部结构的相似性。TM-score值介于0到1之间，值越接近1时表示预测结构与实际结构越相似[14]。
2.2.3 GDT-TS
GDT-TS（Global Distance Test Total Score）是一种基于拓扑相似性的评价指标，综合了四个精确度尺度的评分。GDT-TS考察了预测结构中与真实结构距离相近的一对原子之间实际距离[18]。
2.2.4 DaliLite
 
图 6 DaliLite原理示意图
DaliLite是一种常用的蛋白质结构比对工具，可以用于识别和比较三维空间结构相似或相关的蛋白质[19]。它基于DALI（Distance-matrix ALIgnment）算法，通过计算两个蛋白质之间的残基距离矩阵，并应用动态编程算法来寻找最佳的结构对齐方式。
与其他蛋白质结构比对工具不同，DaliLite不仅能够识别序列相似的蛋白质，还能够发现拓扑结构相似的蛋白质，即使它们的序列差异很大。这使得DaliLite成为识别功能相似性蛋白质、预测蛋白质功能和研究蛋白质演化的重要工具。
总之，在蛋白质结构预测领域，AlphaFold、RosettaFold、trRosetta和NanoNet等基于深度学习的工具已经取得了显著的进展。结构预测方法的评估通过RMSD、TM-score、GDT-TS和QMEAN等指标定量地衡量模型预测精度。本文将主要使用TM-score作为评价指标，来测试AlphaFold、RosettaFold、trRosetta和NanoNet对于纳米抗体的结构预测精度。
三、 研究设计
3.1 实验数据准备
为了测试AlphaFold、RosettaFold、trRosetta和NanoNet在纳米抗体结构预测方面的有效性，首先需要准备实验数据。本文实验使用的数据主要是从蛋白质数据库PDB中获得的。筛选出尽可能多样化且具有代表性的纳米抗体，并收集其氨基酸序列和三维结构信息。
一下是本文使用的纳米抗体数据（因为AlphaFold实验速度很慢，所以本文只使用了5条数据）：
表 1 实验用纳米抗体相关信息
PDB-id	Chain	序列长度
2X1O	1	122
2X1P	1	127
2X1Q	1	127
2X6M	1	126
2X89	1	128

表中，PDB-id为该纳米抗体在PDB数据库中的id号；Chain属性表示纳米抗体在数据库复合物中的第几条链，因为纳米抗体很多情况下是和抗原结合在一起被进行
结构扫描的，所以数据库中只有复合物的结构，纳米抗体是这种复合物结构中的其中一条链；序列长度表示该纳米抗体的氨基酸序列有多长。
3.2 相关工具准备
3.2.1 AlphaFold工具准备
 
图 7 AlphaFold Notebook截图
本文主要使用的是DeepMind团队为AlphaFold编写的colab notebook进行实验。Colab是一个谷歌旗下的一个代码在线运行平台，提供CPU、GPU和TPU设备支持。本文主要使用的是CPU和GPU来运行该笔记本。

3.2.2 RosettaFold工具准备
 
图 8 Robetta服务器
本文主要使用的是Robetta蛋白质结构预测服务，该服务由Baker Lab提供。只需注册账号即可创建任务。

3.2.3 trRosetta工具准备
 
图 9 trRosetta服务器
本文主要使用的是Yang Lab提供的trRosetta在线服务器[20]。直接输入序列提交即可。

3.2.4 NanoNet工具准备
 
图 10 NanoNet项目源码

本文直接安装了本地的NanoNet软件，因为NanoNet很小很快。上图为NanoNet的项目源码，注意需要安装numpy、tensorflow (2.4.0或更高版本)、Bio以及modeller(可选)。
3.3 实验过程
3.3.1 AlphaFold
 
图 11 输入测试序列

在方框内输入序列，接下来运行笔记本所有代码，笔记本将会在MSA数据库中搜索与目标序列相似的序列进行输入，并进行预测。

 
图 12 在MSA数据库中进行搜索

注意进行预测时需要取消勾选run_relax，因为很多情况下该选项会报错。

3.3.2 RosettaFold
 
图 13 任务提交页面
输入项目名，氨基酸序列，并勾选RosettaFold，输入验证码后提交即完成人物创建。任务完成后会以邮件形式提示，并且登录Robetta网站也可查看。
3.3.3 trRosetta
 
图 14 任务提交页面
在官网选择文件，输入邮箱并提交即可（使用国内邮箱，海外邮箱可能受限），任务创建时和任务完成时都会发送邮件到邮箱，任务完成后保留7天有效时间。
3.3.4 NanoNet
 
图 15 命令行截图
在命令行将工作路径切换到NanoNet安装路径，使用python NanoNet.py <fasta file path>命令即可，结果将保存到NanoNet安装路径下的NanoNetResults文件夹内。
四、 结果与说明
4.1 各软件运行结果展示
4.1.1 AlphaFold运行结果
预测完成后，AlphaFold会给出对于每一块预测效果的执行度评估。
 
图 16 AlphaFold运行结果
预测完成后，AlphaFold会主动给出对于预测结果各部分的预测置信度评估（即pLDDT值），并且给出了对于置信度的可视图。
 
图 17 对于AlphaFold预测结果置信度绘制的曲线图

4.1.2 RosettaFold运行结果
 
图 18 RosettaFold运行结果
运行完成后，RosettaFold会展示预测结果的蛋白质结构，以及对于各部位的预估预测准度。
4.1.3 trRosetta运行结果
 
图 19 trRosetta运行结果
如图，trRosetta运行完成后会显示预测结果的结构，同时告知各部分的预测置信度。并且trRosetta还给出了预估的TM-score以及对于预测结果的总结(Summary of the modeling results部分)。
4.1.4 NanoNet运行结果
 
图 20 NanoNet运行完成后结果
NanoNet运行完成后会显示相关的运行信息以及花费时间。
4.2 预测结果一览
表 2 预测结果一览表
PDB-id

预测软件	2X1O	2X1P	2X1Q	2X6M	2X89
AlphaFold	0.9052	0.8788	0.9102		
RosettaFold	0.9140	0.8566	0.8664	0.5335	0.8888
trRosetta	0.954	0.938	0.949	0.951	0.961
NanoNet	0.9516	0.8913	0.9176	0.5295	0.9594
PS：表中得分均为TM-score得分；trRosetta因为服务器出现问题，无法下载预测后pdb文件，本文使用的是服务器预估的TM-score分数，仅供参考，结论中不纳入讨论

从表中数据可以看到，对于大部分的纳米抗体，所有的预测软件均达到了很高的精度（TM-score在0.9左右甚至更高）。并且针对论文选择的5组数据，NanoNet表现最好，在各个蛋白质的预测效果上都超越了其他组。同时注意到2X6M号蛋白表现异常，所有预测软件的预测效果均较差。
五、 结论
本文综述了目前主流的可用于纳米抗体结构预测的各种蛋白质结构预测软件，并对预测效果进行了评估。具体而言，我们比较了AlphaFold、RosettaFold、trRosetta以及NanoNet在纳米抗体结构预测方面的表现。研究结果表明，NanoNet的预测效果最优，但所有软件均在预测2X6M蛋白质的结构时出现异常结果。
值得注意的是，本文未对软件的运行速度进行评价，因为RosettaFold和trRosetta是在服务器上运行的，无法测量其运行时间。然而，在实际生产中，运行速度同样重要，它决定了生产效率。应进行更多相关实验来评估这些软件的预测速度。
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上述为我的论文，请为其编写一篇摘要，并给出论文的关键词