The apoptosis of TRAIL induce hepatoma BEL-7402 transfected with HBV and its mechanism
目的 研究肝癌细胞BEL-7402感染HBV前后,TRAIL诱导其凋亡的敏感度变化及作用机制. 方法构建含1.1倍HBV全基因组的真核表达载体pcDNA3/1.1HBV,转染人肝癌细胞BEL-7402,G418稳定筛选,建立HBV adr亚型体外转染的细胞模型.原位末端标记(TUNEL)检测 TRAIL诱导的凋亡反应,并通过设立TRAIL联合其可溶性受体sDR5(sDR5与TRAIL结合后,可特异性阻断TRAIL诱导凋亡),以证实该凋亡是由TRAIL特异性诱导的.琼脂糖凝胶电泳(DNA ladder)检测染色体DNA的断裂情况.流式细胞术、半定量逆转录聚合酶链反应检测HBV感染前后细胞表面TRAIL各受体的表达.双荧光素酶报告基因系统检测抑制凋亡的核转录因子NF-κB的活性. 结果成功构建了包含HBV全基因组的真核表达载体pcDNA3/1.1HBV,转染BEL-7402、经G418稳定筛选后得到HBV adr亚型转染的细胞模型BEL-7402/1.1HBV.TRAIL诱导BEL-7402、BEL-7402/pcDNA3及BEL-7402/1.1HBV的凋亡率分别为30.5%、29.8%和76%(P＜0.01);经sDR5特异性阻断后,凋亡率分别为0.9%、0.8%和0.9%,证明凋亡是由TRAIL特异性诱导的.TRAIL作用24 h后,琼脂糖凝胶电泳可见BEL-7402/1.1HBV较BEL-7402、BEL-7402/pcDNA3染色体DNA断裂的现象更为明显.无论RNA水平还是蛋白水平,TRAIL受体DR4、DR5、DCR1、DCR2的表达在BEL-7402、BEL-7402/pcDNA3和BEL-7402/1.1HBV差异无统计学意义(P＞0.05).BEL-7402/1.1HBV与BEL-7402、BEL-7402/pcDNA3相比,抑制凋亡基因表达的转录因子NF-κB的活性显著下调(P＜0.05). 结论 HBV 转染可以促进TRAIL诱导的细胞凋亡,其机制与受体表达水平无关,主要与NF-κB活性降低有关。