Mit jelent az, hogy NMR spektroszkópia ? Mit jelent az, hogy NMR ? N uclear M magnetic R resonance Mit jelent az, hogy spektroszkópia ? http://tonga.usp.edu/gmoyna Spektrum = színkép ? Az anyag (minta, vizsgált molekula) és az elektromágneses sugárzás kölcsönhatását vizsgáljuk. Kölcsönhatás leggyakoribb formája : abszorpció Az elektromágneses sugárzás tipusai : 10 -10 10 -8 10 -6 10 -4 10 -2 10 0 10 2 hullámhossz (  cm)  -sugár Röntgen UV VIS IR  -hullám radio
A molekulák (elemi részecskék) nem vehetnek fel tetszőleges energiaállapotot. (Kvantumelmélet) Magasabb frekvencia – nagyobb energia Hullámhossz-energia : fordított arányú összefüggés. A hullámhossz/frekvencia függvényében minőségileg más – más tipusú kölcsönhatások jönnek létre, más jellegű belső energiák változnak meg. : „Kvantumlétra.”  /Röntgen-sugárzás – belső héj elektronjai, magenergiák UV/VIS – vegyérték(kötő)elektronok IR – rezgési energiák(kötéshossz/kötésszög) NMR – Magspin energiák  E = h E
Az NMR spektroszkópia jelentősége Szerkezeti kémia Szerves kémia: Minőségi analízis. Új vegyületek szerkezetvizsgálata. Enantiomer tisztaság vizsgálata. Természetes vegyületek szerkezetvizsgálata.. Metabolitok vizsgálata Fizikai-kémiai vizsgálatok Gazda-vendég kölcsönhatások. Reakciókinetika Makromolekulák háromdimenziós szerkezete Peptidek, fehérjék, enzimek DNS/RNS, DNS/RNS komplexek Poliszaharidok Gyógyszerkutatás Receptor kötődési vizsgálatok Orvostudomány: diagnosztika Magnetic Resonance Imaging (MRI)
Az atommagok egy makroszkópikusan nehezen értelmezhető sajátsággal, un. spinnel rendelkeznek Az NMR spektroszkópia számára csak azok az atommagok érdekesek, ahol a spinkvantumszám ( I )  0 Az atommagok csoportositása : Páros tömegszám és rendszám  I = 0 ( 12 C, 16 O) Páros tömegszám és páratlan rendszám  I = egész szám ( 14 N, 2 H, 10 B) Páratlan tömegszám  I = 1/2, 3/2, 5/2…stb ( 1 H, 13 C, 15 N, 31 P) Másik lehetséges csoportositás NMR szempontból: természetes előfordulás szerint Egy mag lehetséges spinállapotai ( m ) m neve: mágneses kvantumszám m = I, ( I - 1), ( I - 2), …, - I
A legfontosabb (és általunk tárgyalt ) magok ( 1 H, 13 C, 15 N, 31 P) esetén I = 1 / 2, tehát Ennek eredményeképpen csak két energiaszintet kell figyelembe vennünk Az atommagok további fontos paramétere az un. mágneses momentum (  ), amelyet kifejezhetünk: Ez egy vektormennyiség, amely megadja a mag által reprezentált „elemi mágnes” irányát és nagyságát, ahol h a Planck konstans  a giromágneses állandó, amely függ a mag anyagi minőségétől. Minden egyes mag mágneses momentuma (és természetesen giromágneses állandója) különböző. m = 1 / 2, - 1 / 2  =  I h / 2 
Egy spin energiája egy polarizáló külső mágneses térben ( B o, ) a tér nagyságától és a mágneses momentumtól (  függ. A külső B o tér bekapcsolásakor a spinek energiája felhasad. Két energiaszint lép fel, a külső térrel paralell és antiparallel állapot. Az energia a két vektor szorzataként írható le a követ- kezőképpen Az energiakülönbség a két nívó,  és , között Az energiakülönbség a polarizáló B o, tértől függ. A nivók. benépesítettsége  E függvénye, amit egy Boltzmann tipusú eloszlásból kiszámíthatunk  A  E 1 H esetén 400 MHz-en (B o = 9.4 T) 4 x 10 -5 Kcal / mol. BoBo  BoBo  E = -    B o E  = -  h B o / 4  E  =  h B o / 4   E =  h B o / 2  N  / N  = e  E / RT Az N  / N  arány csak 1.000064.
NMR mérés érzékenysége Érzékenységet befolyásoló tényezők Giromágneses tényezőr  3.(   N  / N   a tekercs mágneses fluxusa) Természetes előfordulás 13 C mérés 64-szer érzéketlenebb a giromágneses tényező értéke miatt Amennyiben a temészetes előfordulást 13 C (~1%) is számbavesszük, 6400 –szer kevésbé érzékeny A rezonancia-frekvencia az energiakülönbség értékéből számítható:   E = h o  E =  h B o / 2  1 H magokra a jelenleg ismeretes mágnesek (2.35 – 22.31T) esetén a rezonanciafrekvencia 100 és 950 MHz között van  13 C = 6,728 rad / G  1 H = 26,753 rad / G  o =  B o / 2 
o értékéből adható meg a precesszó sebessége, az un. Larmor frekvencia  o, i   o  =  2  o    o  =  B o (radian) A precesszió magyarázata : minden mag (mágneses és nem-mágneses) rendelkezik szögmomentummal (( L) A magokat mint kis mágneseket képzeljük el, melyek tengelyük körül forognak A spinekre két erő hat a polarizáló mágneses tér bekapcsolása után: B o, kényszeríti a térirányba történő beállást igyekeznek megtartani a szögmomentumot BoBo oo  L  L
Eredő mágnesezettség A mintát alkotó elemi mágneses momentumok a B 0 bekapcsolása után rendezettséget mutatnak. Ennek eredménye az eredő mágnesezettség megjelenése, melyet egy koordinátarendszerben ábrázolva érthetünk meg Ha felbontjuk a  vektort a z and,komponensekre MoMo y x z x y z BoBo BoBo A mágneses térrel parallel és antiparallel beállású vektorok aránya N  / N . x y = = “0” z z Az eredő mágnesezettség a B o irányába mutat, ezt hasznosítjuk az NMR -benl
NMR jel észlelése NMR jel észlelése A B 0 tér bekapcsolása (illetve a minta mágneses térbe való helyezése) még nem eredményez NMR jelet, csak a nívók (egyébként nem észlelhető) felhasadását A mintának energiát kell abszorbeálni. Az energiát egy oszcilláló elektromágneses sugárzással tudjuk biztosítani. ( B 1 tér bekapcsolása) MoMo z x i B 1 = C * cos (  o t) B1B1 adótekercs (y) y BoBo B 1 kikapcsolva MoMo z x B1B1 z x M xy yy oo oo BoBo BoBo
mágnesezettség észlelése M xy mágnesezettség észlelése A B 1 oszcilláló mágneses tér kikapcsolása után az M xy vektor vissza fog térni a z tengely irányába ( egyensúlyi M o,) és visszaáll az eredeti spineloszlás (N  / N  ) relaxáció M xy vektor visszatérése z tengely irányába: precesszió az sikban Az M xy vektor oszcillációja egy változó mágneses teret jelent, amely egy tekercsben áramot indukál: z x M xy y z x y Vevőtekercs (x) MoMo  NMR jel egyensúly. oo z x M xy y oo BoBo
Kémiai eltolódás Ha minden magnak egy jellemző  o Larmor freknciája van egy adott mágneses térben, mire jó az NMR spektroszkópia? Minden egyes mag megérzi azt a kémiai környezetet, amely befolyásolja a körülötte kialakuló effektív mágneses teret, mely a polarizáló és a helyi mágneses tér együttes hatására alakul ki körülötte B eff = B o - B loc --- B eff = B o ( 1 -  )  neve : mágneses árnyékolás. A mágneses árnyékolást befolyásolja a szomszédos magok, csoportok jelenléte, az elektronfelhő, azaz a molekulában levő kötések, hibridállapot stb. Ennek alapján az etanol spektrumának így kellene kinézni: H O-C H 2 -C H 3 oo low field high field
Kémiai eltolódás skála ( , ppm) Lehetne frekvencia skálát is alkalmazni. Nehézkes, mivel B loc isokkal kisebb, mint B o, a számláló viszonylag kicsil (néhány száz Hz), míg a nevező nagy (száz MHz). Egy relatiív skálát használunk, minden jelet egy belső standard vegyület bizonyos jeléhez vonatkoztatva,. A skála előnye, hogy minden műszeren mért eredmény összehasonlítható. Általános belső standard a tetrametilszilán (TMS), mivel oldható a legtöbb oldószerben, semleges, könnyen eltávolítható és 12 ekvivalens 1 H és 4 ekvivalens 13 C atomot tartalmaz H 3 C Si CH 3 CH 3 CH 3  -  ref  = ppm (parts per million)  ref
Kémiai eltolódás skálák 1 H, ~ 15 ppm: 13 C, ~ 220 ppm: 0 TMS ppm 2107515 Alifás H Alkoholok, ketonok  protonjai Olefinek Aromás H Amidok Sav OH Aldehidek ppm 5015010080210 Alifás CH 3, CH 2, CH Heteroatomhoz kapcsolódó C Olefinek Aromás C, konjugált alkének C=O savak, aldehidek, észterek 0 TMS C=O ketonok
Csatolási állandók Egy mag spinállapotait befolyásolhatja a szomszédos spinek energiaállapota, mely kölcsönös. Ez a jelenség a csatolás. A csatolás legtipikusabb esete a molekula elektronfelhőjének közvetítésével jön létre – a kötésen keresztül. Energiaszintek: Mindegyik spin nivóján további felhasadás észlelhető A felhasadás nagysága a csatolási állandó, (J) melyet Hz.- ben mérünk. Nem függ a mágneses térerőtől! A csatolási kép és a csatolási állandó a kémiai szerkezet meghatározásának alapvető eszköze. 13 C 1 H 1 H 1 H Egy kötés Három kötés ISIS ISIS ISIS ISIS I S S S I I J (Hz)
NMR spektrométer Az NMR spektrométer alapvetően egy nagy és drága FM rádió. Mágnes- Ma döntően szupravezető mágnesek. Frekvenciagenerátor – Előállítja az  o frekvenciát, amely a B 1 teret indukálja. CW és pulzustechnika. Detektor - érzékeli a mágnesezettséget az síkban Recorder - XY plotter, oszcilloszkók, számítógép, stb É D BoBo B1B1 Detektor Frekvencia generátor Rekorder Mágnes
Fourier Transzformáció - Pulzusgerjesztés Ma szinte minden NMR spektrométer ezen az elven működik. Egy hangszer „sajátfrekvenciájának” meghatározása. a) rezonanciapartner frekvenciájának lépetése (CW) b) szélessávú gerjesztés és a jel időfüggésének vizsgálata RF pulzus : az összes lehetséges frekvenciát tartalmazza Az NMR detektor jele: intenzitás-idő függvény. Mi intenzitás- frekvencia függvényt tudunk értékelni, számunkra ez hordozza a hasznos információt. Az időfüggvényből a kívánt frekvencia- függvényt a Fourier transzformáció segítségével nyerjük. Frekvenciafüggvényből időfüggvényt inverz Fourier transz- formáció segítségével kaphatunk. Pulzustechnika + Fourier transzformáció az NMR mérés- technika forradalmi megújítása – Ernst, 1965 S (  ) = ∫ S (t) e -i  t dt S (t) = 1 / 2  ∫ S (  ) e i  t d  --  -- 
Jean Baptiste Joseph Fourier Richard Ernst Bay Zoltán
Szabad indukció lecsengés (FID) Szabad indukció lecsengés (FID) A hasznos NMR jel az síkban elhelyezett vevőtekercsben megjelenő, a precesszáló mágnesezettség által indukált áram. Az eredő mágnesezettség relaxáció által visszatér az egyensúlyi állapotba. A vevőtekercs egy csillapított koszinuszfüggvényt detektál. (amennyiben egyetlen rezonan- ciafrekvencia van - a spktrum egy jelből áll)  = o = o M xy  -  o > 0 M xy idő
Pulzusszekvenciák Pulzusszekvenciák Az NMR kisérletek épitőelemei. Egy kisérlet a szekvencia többszöri (sokszori) ismétléséből épül fel. A legegyszerübb 1-pulzusos kisérlet Vektorábrán Sematikusan jelölve A pulzusnak „iránya” is van, használhatunk 90 x vagy 90 y pulzusokat. A gyakorlatban az több adó-, illetve vevő- tekercset helyeznek el 90 o -onkét, ezeket felváltva használják (kereszttekercses elrendezés) 90 y n z x y z x M xy y MoMo 90 y adatgyűjtés pulzus
Adatfeldolgozás, szorzófüggvények Adatfeldolgozás, szorzófüggvények A jel digitalizált formában a számítógépben tárolható.. A FID információtartalma az adatgyüjtés folyamán csökken. Ahogy M xy mágnesezettség csökken, egyre több és több zajt detektálunk. A zaj nagyfrekvenciájú, véletlenszerű jelenség. Az FID FT előtti alkalmas függvényekkel való szorzásával a spektrum zajos alapvonala „simítható” Jel + zaj…zaj 1
Legalkalmasabb egy exponenciális szorzófüggvény, melynek matematikai alakja: Eredmény: a frekvenciafüggő adatfüggvény konvoluciója az időben csökkenő exponenciális függvény Fourier-transzfor- máltjával. A szorzófüggvény Fourier-transzformáltja egy un. Lorentz függvény. Az LB paraméter értékének (előjelének) változtatásával a jel-zaj viszony, illetve a felbontás változtatható az adott célnak megfelelően. LB F(t) = 1 * e - ( LB * t ) - or - F(t) = 1 * e - ( t /  )
Jel/zaj viszony vagy felbontás javítás Az exponenciális szorzófüggvény kitevőjétől függően jel/zaj viszony vagy felbontás javítás érhető el ( a másik paraméter némi romlása árán) FT LB = -1.0 HzLB = 5.0 Hz
Inverzió visszaállás Spin-rács relaxációs idő (T 1 ) Értéke a molelulán belüli lokális mozgékonyságra jellemző. Közvetlenül a FID-ből, illetve a spektrumból nem határozható meg. A következő pulzusszekvenciával határozható meg : I A  pulzus után Megkezdődik az egyensúly visszállása, a (T 1 ) relaxágiós idő által meghatározott sebességgel. Különböző t D várakozási idő után egy újabb 90 o -os pulzussal tudjuk „kiolvasni” a mágnese- zettség aktuális értékét 180 y (or x) 90 y tDtD z x y z x y 180 y (or x) tDtD
Inverzió visszaállás z x y t D = 0 z x y t D > 0 z x y t D >> 0 z x y z x y z x y 90 y FT
Ennek linearizálásával T 1 kiszámítható. Inverzió visszaállás Az intenzitás-idő (t d ), összefüggés 40 o C time Intensity ( ) I(t) = I  * ( 1 - 2 * e - t / T 1 )
1 pulzus8 pulzus 80 pulzus16 pulzus 800 pulzus S/N viszony számítása
térdkalács gerincoszlop koponya metszet
NévSpinTermészetes előfordulás (%) Relatív érzékenység Larmor frekvencia 11.7 T térerő esetén (MHz) 1H1H1/299.981500.13 13 C1/21.079.65E-3125.75 2H2H10.0111.59E-276.77 31 P1/21006.65E-2161.97 23 Na3/21009.27E-2132.29
HO-CH 2 -CH 2 D (I) HO-CHD-CH 3 (II) DO-CH 2 -CH 3 (III) R = 3 * II / I C = (I + II) / (S *  )
Nátrium koncentráció viszonyok változása sejtekben és környezetükben PPP DOTP TTHA