Ridotto in fin di vita e abbandonato sul ciglio della strada - Riviera Oggi\nRidotto in fin di vita e abbandonato sul ciglio della strada\ndi Daniele Mauro — 18 febbraio 2005 @ 10:05 Stampa articolo\nIl corpo di un uomo riverso a terra, con il cranio fracassato, è stato trovato in una strada di contrada Monterenzo da un passante. Ora la vittima della brutale aggressione, la cui identità è ancora sconosciuta, è ricoverata in condizioni gravissime al Torrette di Ancona\nSAN BENEDETTO DEL TRONTO – Era riverso a terra, ridotto in fin di vita con il cranio fracassato. La macabra scoperta è stata fatta mercoledì sera, intorno alle 22.30, da un passante che stava attraversando una stradina in contrada Monterenzo, zona collinare del quartiere Ragnola. L’uomo è con ogni probabilità un extracomunitario: le sue generalità non sono note poichè al momento del suo ritrovamento non aveva con sè documenti.\nSul fatto sono scattate le indagini dei carabinieri di S.Benedetto. Secondo una prima ricostruzione, l’uomo sarebbe stato aggredito, colpito ripetutamente con un corpo contundente e poi abbandonato in fin di vita sul ciglio della strada.\nLa vittima ora è ricoverata in condizioni gravissime all’ospedale Torrette di Ancona: nell’aggressione ha riportato lo sfondamento del cranio.\n(Letto 786 volte, 1 oggi)


La connessione ottica offre una banda di 10 Gbit/s. Collegherà tutte le periferiche su un unico cavo e potrebbe sostituire Usb 3.0\nForse c'è un altro motivo per cui Intel non ha tanta fretta di far debuttare Usb 3.0, e questo motivo si chiama Light Peak.\nÈ questa una tecnologia pensata per sfruttare le fibre ottiche al fine di collegare una vastissima serie di dispositivi su un unico cavo: la banda passante è di 10 Gbit/s (e aumenterà in futuro, mentre per ora Usb 3.0 si ferma a 4,8 Gbit/s) ed è possibile gestire diversi protocolli simultaneamente.\nIntel delinea un futuro in cui la miriade di cavi che generalmente si affastella dietro a un Pc viene sostituita da un solo cavo Light Peak, al quale sono collegate in cascata tutte le periferiche, dai dischi esterni al monitor fino alle attrezzature di rete (modem e router).\nPotremmo dire addio ai vari standard Ethernet, Usb, Sata, Firewire e DisplayPort, possibilità che diventerà più concreta a mano a mano che crescerà la disponibilità di banda, che Intel già vede arrivare ai 100 Gbit/s.\nNonostante stia lavorando a quello che dovrebbe essere il "cavo universale" che sarà "un successore di Usb 3.0" (come sostiene Kevin Kahn, di Intel), l'azienda non crede che la nuova versione di Usb sarà in conflitto con Light Peak.\n"Ci spettiamo che entrambe coesistano sul mercato, forse sulla stessa piattaforma e contemporaneamente" ha spiegato ancora Kahn che ha dato una dimostrazione di Light Peak trasmettendo su un singolo cavo (che collegava un notebook a una docking station e a un monitor) un film in Blu Ray, il segnale di una videocamera in HD e quello che clonava il display del portatile sul monitor esterno.\nPer il collegamento è stata utilizzata una porta Usb 3.0 modificata, un'interfaccia che potrebbe essere adottata in via definitiva grazie alla sua diffusione ma che potrebbe anche essere sostituita da connettori molto più piccoli, visto che la tecnologia lo permette (opzione utile per i dispositivi portatili e gli smartphone).\nL'anno prossimo dovrebbe costituirsi un gruppo industriale per la promozione di Light Peak, tecnologia che ha già incassato l'approvazione di Apple, così da realizzare quello che Kahn definisce "l'ultimo cavo di cui avrete bisogno".\nMolto probabile e poi non possiamo escludere una guerra di standard che complicherà le cose solo per i produttori finali di hardware e soprattutto a noi utenti :roll: Leggi tutto\nper lo stesso motivo per cui si rallenta, anzi si blocca l'uscita dei display OLED. prima vogliono sfruttare ben bene gli standard precedenti, POI, ci venderanno quelli nuovi (ormai già "vecchi") :evil:\nConflitto... di parole! Leggi tutto


Neymar Jr. Limited Edition | GaGà Milano Italia\nDA APPASSIONATO A TESTIMONIAL: NEYMAR JR. PER GAGÀ MILANO\nCon un contratto fino al 2020, il fuoriclasse brasiliano, attaccante del Paris Saint-Germain è diventato ambasciatore del brand.\nUna scelta che nasce da un vero apprezzamento e da un’affinità di gusti e stile tra Neymar Jr. e GaGà Milano.\nLa passione di Neymar per gli orologi GaGà Milano, nata nel 2016 quando all’improvviso, tra lo stupore di tutti, si è presentato nella Boutique a Tokyo, si è ora trasformata in una collaborazione a tutti gli effetti. Spesso le cose più straordinarie sono inaspettate!\nGaGà Milano ha presentato una capsule collection a lui dedicata. Modelli d’eccezione, rigorosamente in edizione limitata, riportano sul fondello la firma dell’attaccante del Paris Saint-Germain.\nI primi tre modelli della collezione sono realizzati sulla base del MANUALE 48MM, orologio emblematico per GaGà Milano e proposti nelle versioni acciaio e kevlar, pvd nero con lunetta in carbonio e acciaio placcato oro sempre con lunetta in carbonio. Tutti e tre sono impreziositi da diamanti e logo NJR sul contatore dei piccoli secondi.\nIl CHRONO 48MM NEYMAR JR con cassa in pvd nero, si distingue per gli oblò laterali con pietre naturali fluttuanti all’interno e il quadrante spazzolato con logo, numeri e indici impreziositi da pietre naturali taglio diamante.\nCompletano la capsule collection tre SLIM 46MM, proposti in versione placcato oro rosa o oro giallo tutti accomunati dal logo NJR ai piccoli secondi e dal cinturino in maglia milanese.


PUNTA GIALLA LITORALE NORD-BC SOLESINO PD 78/77 – LITORALE NORD BASKETBALL\nPUNTA GIALLA LITORALE NORD-BC SOLESINO PD 78/77\nMilazzo, Silvestrini 9, Toffolo 8, Buratto, Senigaglia, Vendramini 5, Gusso 11, Costantini, Montino 24, Bianco 11, Gerotto, Agostinetto 10.\nRossi 5, Rizzo, Bortolami, Donizzetti, Braggion 10, Quaggio, De Marco 6, De Martini 6, Augusti 13, Pavan 6, Capuzzo, Doati 31.\nGastaldon di Volpago Tv\nLongato di Monastier Tv\n1 quarto 19/17 19/17\n2 quarto 23/17 42/34\n3 quarto 18/22 60/56\n4 quarto 18/21 78/77\nusciti 5 falli: Bortolami, Braggion, Doati\ntiri da 3 punti: Litorale ( Vendramini 1, Montino 1, Bianco 2), Solesino (Rossi 1, Braggion 2, Augusti 1, Doati 6).\nfallo tecnico a Pezzini (all. Litorale), Agostinetto, Braggion.\nancora una vittoria al cardiopalmo da parte della nostra squadra, che è riuscita ad avere la meglio su un’ottima squadra venuta a Ca’Savio per vincere e mantenere la sua posizione in vista dei playoff. Da parte nostra invece una vittoria, la terza consecutiva, che ci porta nelle posizioni alte in vista dei playout.\nPartita iniziata con canestri in alternanza, al 7′ un tiro pesante di Bianco 13/9 ci porta avanti di quattro lunghezze, subito ripreso anche per un fallo tecnico fischiato ad Agostinetto per proteste a seguito di un fallo non fischiato ai suoi danni.\nNel secondo quarto, al 2′ fallo tecnico anche a Braggion (il suo è il quarto fallo); al 4′ tap in di Gusso (ottima prestazione) 29/23, al 7′ tiro da tre di Vendramini 36/28, seguito da Silvestrini con un canestro da due più libero 39/28.\nDopo l’intervallo, la partita (bella nel complesso) ci porta sul massimo vantaggio nostro 54/38; una reazione da parte dei padovani però con due tiri da tre di Braggion e Rossi riduce per loro lo svantaggio a soli quattro punti.\nUltimo quarto con molte azioni confuse da parte di entrambe le squadre. Al 4′ il primo vantaggio ospite 62/63; al 4′ fallo tecnico a Pezzini. Pronta reazione dei nostri che con Silvestrini e Toffolo ci riportano avanti di un punto. Al 8′ dopo un time out ospite, Montino con un canestro più libero realizzato ci riporta in vantaggio 73/67.\nA 1’44” tiro pesante di Augusti 73/70; a 1’33” Montino in lunetta con 1/2 74/70. A 58″ due punti di Doati (sicuramente il migliore tra i suoi) 76/73. A 40″ ancora Augusti 76/75.\nRimessa nostra, palla a Silvestrini che in palleggio a metà campo la perde per opera di Doati che in contropiede subisce fallo dallo stesso Silvestrini a 14″. In questa azione però oltre al danno anche la beffa: Matteo Silvestrini si infortuna al ginocchio destro e deve uscire definitivamente dalla partita. A lui gli auguri di pronta guarigione, sperando sia la più breve possibile. In lunetta Doati con 2/2 dai liberi e vantaggio ospite 76/77.\nTime out Litorale, rimessa nostra in attacco, palla a Montino che realizza il canestro della vittoria. Partita finita.\nOttima vittoria come detto sopra, in vista della partita per noi più importante di tutto il campionato, quella di domenica prossima a Isola della Scala a Verona.


Elezioni Comunità e Ucei: tutti al voto - Mosaico\nn° 6 – Giugno 2012\ncade quest’anno l’anniversario della morte di Primo Levi, il grande scrittore italiano che fu anche tra le prime voci testimoniali della Shoà. “L’alba ci colse come un tradimento”, scriveva Levi in Se questo è un uomo, nel capitolo dedicato al campo di Fossoli; e la frase trafigge per la forza espressiva; e anche perché quell’alba prelude al viaggio verso il lager, e al tradimento della Storia. Una frase bellissima, dagli echi manzoniani e piena della forza letteraria di una formazione che ebbe nella tradizione del Liceo Italiano degli anni Trenta il suo fondamento. Lo ricorda Alberto Cavaglion, professore e docente universitario, nel corso dell’incontro-evento avvenuto a Milano al Teatro Franco Parenti, una memorabile serata in ricordo del grande scrittore torinese, scomparso a soli 68 anni, 25 anni fa (vedi articolo pag. 32).\nLevi e la sua enigmatica personalità, schivo e complesso, “un uomo con molte radici e molte identità e sopra a tutte una profondissima etica, virtù rarissima, mi azzardo a dire un’etica ebraica”, spiega Stefano Jesurum che ha introdotto la serata. E così, curiosamente, mi rendo conto che la figura di Levi appartiene a quell’orizzonte familiare di chi è sempre stato lì ma che non abbiamo mai guardato veramente. E mi accorgo che ci farebbe davvero bene osservarlo meglio e ristudiarlo. In questa Italia di oggi così piagnona e dolorista, così prona e noiosamente afflitta, ci sarebbe davvero da prendere spunto da figure esemplari. Da Levi appunto, da quell’essere schivo e defilato, dalla sua severa mitezza, dalla sua totale lontananza dal vittimismo e dalla lamentela, quel suo essere testimone senza mai aver voluto considerarsi una vittima anche che se lo era, eccome se lo era, visto che ci è morto.\nLeggo i quotidiani italiani, -così pieni di tetraggine autoconsolatoria, di mugugno malmostoso, di pessimismo rinunciatario rispetto ai quotidiani inglesi, francesi, israeliani, persino spagnoli-, ascolto la gente che bussa qui, alla porta del Bollettino ogni giorno, lamentandosi della crisi. E sono sempre più colpita dal piagnisteo generale, da questa paralisi della volontà, dall’assenza di comportamenti reattivi, questo non saper più combattere, immobili a tal punto da non riuscire ad attivare quel colpo di reni che, a denti stretti, sa farci andare avanti; e che ci obbliga a rimboccarci le maniche e, in testardo silenzio, a farlo a volte solo per il piacere e l’orgoglio di un lavoro fatto bene, anche se mal pagato, anche se pochissimo riconosciuto, aspettando tempi migliori, aspettando che finisca questo tempo del flat is up, il poco che si ha è già tanto. Primo Levi fa l’elogio del lavoro ben fatto, anche nel lager, anche allo stremo delle forze. Sono le mani che ci salvano, è il fare che ci aiuta davvero, scriveva. Questo mi insegna oggi Primo Levi. Affinché l’alba non mi colga più come un tradimento.\n17 Maggio 2019 17 Maggio 2019 10 Giugno 2016


Servizio Ready dopo disdetta Vodafone: si paga? | Notizie per risparmiare di ComparaSemplice.it\nHome > Notizie per risparmiare > Internet Casa > Servizio Ready dopo disdetta Vodafone: si paga?\nServizio Ready dopo disdetta Vodafone: si paga?\ndi Silvio Spina | 17-11-2021 | News Internet Casa, News Vodafone\nDalla fine del 2020 Vodafone ha cambiato strategia commerciale per quanto riguarda la linea fissa: sono scomparsi i vincoli di permanenza e il modem in vendita abbinata, lasciando spazio all’attivazione gratuita e alla Vodafone Station in comodato d’uso, da restituire solo in caso di disdetta. Ma che cosa accade ai contratti precedenti che sceglieranno di cambiare provider o disdire? Il servizio Ready dovrà essere pagato?\nI nuovi contratti Vodafone casa sono senza dubbio tra i più convenienti sul mercato: zero costi di attivazione, nessun vincolo di permanenza, canone attorno ai 25-27€ al mese (a seconda della promozione) e un modem Wifi 6 in comodato d’uso gratuito, da restituire in caso di migrazione o dismissione del servizio.\nPrima del dicembre 2020 il provider prevedeva due principali vincoli:\nl’attivazione azzerata solo in caso di permanenza per almeno 24 mesi;\nIl modem in vendita abbinata, con rata azzerata solo restando in Vodafone per 48 mesi.\nIl recesso anticipato, quindi, poteva costare davvero caro: al contributo di disattivazione, infatti, si affiancavano le eventuali rate residue dell’attivazione e del modem, facendo lievitare non poco i costi di chiusura del contratto. Per ogni mese mancante ai 24 mesi di attivazione si sarebbero dovuti pagare 1-2€ al mese (in base alla promozione attiva in quel periodo), mentre per il servizio Ready (da attivare obbligatoriamente per ottenere il modem) il costo da sostenere era di ben 6€ al mese, fino al raggiungimento delle 48 rate.\nIn pratica il servizio Vodafone Ready, che prevedeva alcuni vantaggi “minori” in termini di assistenza e connessione su rete mobile quando la linea fissa non era presente, non era altro con un contributo per la vendita del modem, non particolarmente conveniente: in 48 mesi, infatti, il costo totale da sostenere era di ben 288€.\nSono ancora numerosi gli abbonamenti Vodafone casa ancora attivi con le condizioni precedenti al dicembre 2020 e i dubbi su quanto pagare in caso di disdetta non mancano. Il servizio Ready dovrà essere pagato comunque, anche oggi che il provider lo ha eliminato definitivamente? E che cosa succede in caso di modifica unilaterale del contratto?\nNonostante le controversie nate a causa del servizio, che hanno portato anche a delle sanzioni alla compagnia da parte dell’AGCOM (ricordiamo, ad esempio, la delibera n. 682/20/CONS), i vecchi contratti che prevedono ancora Vodafone Ready devono attenersi alle condizioni siglate precedentemente e, quindi, i clienti sono tenuti a pagare le rate residue, sia in caso di migrazione verso altro gestore, sia con la richiesta di dismissione del servizio.\nSe, ad esempio, avete sotto scritto un contratto a dicembre 2019 e siete decisi a disdirlo a novembre 2021, i costi da pagare saranno i seguenti:\nContributo di disattivazione di 29€ una tantum;\nRate di attivazione residue pari a 1 o 2€ per il mese restante ai 24 mesi;\nRate residue di Vodafone Ready, pari a 6€ per i 25 mesi restanti di vincolo (150€).\nL’addio a Vodafone anticipato, quindi, potrebbe costare addirittura 180€.\nServizio Ready dopo modifica unilaterale del contratto: si deve pagare?\nDopo aver constatato che il provider applica ancora l’addebito di Vodafone Ready sui vecchi contratti, l’ultimo dubbio rimasto è il seguente: in caso di modifica unilaterale del contratto da parte del provider, ad esempio una rimodulazione del canone, la disdetta è completamente gratuita?\nLe testimonianze che siamo riusciti a raccogliere confermano che, anche in questa particolare situazione, il servizio Ready viene richiesto insieme ad eventuali rate residue dell’attivazione. Viene cancellato, invece, il contributo di disattivazione di 29€.\nSu questo aspetto si è scatenata una diatriba tra gestore, vecchi clienti e associazioni di consumatori, con tantissime richieste di rimborso, reclami e aperture di procedimenti di conciliazione: le conclusioni di tali controversie hanno così tante sfaccettature che è difficile poter dire con certezza se i costi sostenuti per Vodafone Ready possano effettivamente rientrare.\nQuel che è appare certo invece, è che il provider chiederà il pagamento delle rate residue del servizio in caso di disdetta anticipata (prima dei 48 mesi): il nostro consiglio, quindi, è di contattare prima l’assistenza Vodafone per avere maggiori delucidazioni in merito, ad esempio chiamando il numero gratuito 190.\nSe siete comunque decisi a cambiare compagnia, ad esempio perché non siete soddisfatti del servizio, potreste ammortizzare i costi di addio del vostro ex provider con un abbonamento più conveniente: per scoprire le migliori promozioni del periodo fate subito un confronto delle offerte internet casa, ADSL e fibra ottica oppure scriveteci sulla chat del sito per avere una consulenza senza impegno da parte di un esperto.\n« Fastweb fibra ufficio: l’offerta per Partite IVA Fastweb regala cloud illimitato con un’offerta Casa fino al 23 novembre »


Dimensione del mercato Application Specific IC (ASIC) 2021: panoramica del settore, informazioni sulla crescita, tecnologie emergenti, produzione, entrate e tasso di crescita entro il 2024 – Lucca Notizie di GabbianoNews.tv\nIl rapporto sul mercato globale Application Specific IC (ASIC) offre uno studio di ricerca completo che include stime accurate del tasso di crescita e delle dimensioni del mercato per il periodo di previsione 2021-2024. Offre un’ampia analisi della concorrenza di mercato, dell’espansione regionale e della segmentazione del mercato per tipo, applicazione e area geografica supportata da dati di mercato esatti. Il rapporto di ricerca di mercato all-inclusive offre anche l’analisi delle cinque forze di Porter e profila alcuni dei principali attori del mercato globale Application Specific IC (ASIC). Fa luce sulle mutevoli dinamiche di mercato e discute in dettaglio i diversi driver di crescita, le sfide e le restrizioni del mercato, le tendenze e le opportunità.\nSi prevede che le dimensioni del mercato globale Application Specific IC (ASIC) cresceranno al CAGR di 4 con entrate USD USD 4.58 mld bn durante il periodo di previsione 2021-2024.\nOttieni una copia di esempio del rapporto su – www.absolutereports.com/enquiry/request-sample/15689316\nInformazioni sul mercato Application Specific IC (ASIC):\nLa nostra azienda ha monitorato il mercato globale Application Specific IC (ASIC) ed è destinato a crescere di USD USD 4.58 mld bn durante il 2021-2024, progredendo a un CAGR di 4 durante il periodo di previsione. I nostri rapporti sul mercato globale Application Specific IC (ASIC) forniscono un’analisi olistica, dimensioni e previsioni del mercato, tendenze, driver di crescita e sfide, nonché analisi dei fornitori che coprono circa 25 fornitori.\nDinamiche del mercato Application Specific IC (ASIC):\nI driver di mercato: trasformazione digitale.\nTendenze di mercato: Emersione dell’internet degli oggetti\nPer capire come l’impatto di Covid-19 è coperto in questo rapporto – www.absolutereports.com/enquiry/request-covid19/15689316\nLe aziende leader che operano nel mercato Application Specific IC (ASIC) sono:\nIl rapporto di mercato Application Specific IC (ASIC) fornisce informazioni approfondite e complete in vista dei diversi sviluppatori del settore, inclusi i dettagli delle entrate, i progressi tecnologici, le innovazioni, gli sviluppi chiave, l’analisi SWOT, le fusioni e le applicazioni, le strategie future e l’impronta del mercato. Sulla base della segmentazione, il mercato è stato classificato in base al tipo di prodotto, alle tecnologie utilizzate, all’utente finale, al settore verticale e alla geografia.\nPunti chiave del rapporto sul mercato Application Specific IC (ASIC):\nAcquista questo report (prezzo $2500 (Two Thousand Five Hundred USD) USD per una licenza per utente singolo) – www.absolutereports.com/purchase/15689316\nIl mercato Application Specific IC (ASIC) è stato creato sulla base di un’analisi di mercato approfondita con input di esperti del settore. Il rapporto copre le prospettive di crescita del mercato Application Specific IC (ASIC) nei prossimi anni e la discussione dei principali fornitori.\n Mercato globale Application Specific IC (ASIC) per prodotto\n Mercato globale Application Specific IC (ASIC) per canale di distribuzione\n Mercato globale Application Specific IC (ASIC) per canale di distribuzione offline\n Mercato globale Application Specific IC (ASIC) per canale di distribuzione online\n Mercato globale Application Specific IC (ASIC) per utente finale\nPer un sommario dettagliato: www.absolutereports.com/TOC/15689316,TOC


Enhanced Crosslinking Immunoprecipitation (eCLIP) Method for Efficient Identification of Protein-bound RNA in Mouse Testis | Protocol (Translated to Italian)\nQui, presentiamo un protocollo eCLIP per determinare i principali obiettivi di RNA dei candidati RBP in testis.\nLa spermatogenesi definisce un processo altamente ordinato di differenziazione delle cellule germinate maschili nei mammiferi. In testis, la trascrizione e la traduzione sono disaccoppiate, sottolineando l'importanza della regolazione post-trascrizionale dell'espressione genica orchestrata dagli RPB. Per chiarire i ruoli meccanicistici di un RBP, la metodologia di immunoprecipitazione reticolazione (clip) può essere utilizzata per catturare i suoi bersagli endogeni diretti dell'RNA e definire i siti di interazione effettivi. Il CLIP migliorato (eCLIP) è un metodo appena sviluppato che offre diversi vantaggi rispetto alle clip convenzionali. Tuttavia, l'uso di eCLIP è stato finora limitato alle linee cellulari, chiedendo applicazioni espanse. Qui, abbiamo impiegato eCLIP per studiare MOV10 e MOV10L1, due helicasi di legame RNA noto, in testis del topo. Come previsto, troviamo che MOV10 si lega prevalentemente a 3' regioni non tradotte (UTR) di mRNA e MOV10L1 si lega selettivamente alle trascrizioni precursori di RNA (piRNA) che interagiscono con PIWI. Il nostro metodo eCLIP permette la determinazione rapida delle principali specie di RNA legate da vari RPB attraverso il sequenziamento su piccola scala di subcloni e quindi la disponibilità di biblioteche qualificate, come un mandato per procedere con sequenziamento profondo. Questo studio stabilisce una base applicabile per eCLIP nei testicoli per mammiferi.\nIl testicolo dei mammiferi rappresenta un ottimo modello evolutivo in cui un intricato programma di differenziazione cellulare corre ciclicamente per produrre numerosi spermatozoi. Un valore unico di questo modello risiede nell'emergere dell'inattivazione trascrizionale in certe fasi della spermatogenesi, tipicamente quando l'inattivazione del cromosoma del sesso meiotico (MSCI) si verifica1,2 e quando i spermatidi rotondi subiscono drastica compattazione nucleare durante lo spermiogenesi3. Questi eventi trascrizionali inconsecutivi richiedono una regolazione genica post-trascrizionale, in cui le proteine leganti l'RNA (RBPs) svolgono un ruolo cruciale, modellando il trascrittoma e mantenendo la fertilità maschile.\nPer identificare gli obiettivi di RNA in buona fede di un singolo RBP in vivo, è stato sviluppato il metodo reticolazione immunoprecipitazione (clip)4,5, basato ma oltre l'immunoprecipitazione dell'RNA regolare (RIP)6,7 , per incorporazione di passaggi chiave tra cui cross-linking ultravioletti (UV), lavaggio rigoroso e trasferimento di gel per migliorare la specificità del segnale. L'applicazione avanzata della CLIP combinata con il sequenziamento ad alto rendimento ha suscitato grande interesse nella profilazione dell'interazione proteina-RNA a livelli di genoma8. Oltre agli studi genetici sulla funzione RBP, tali metodi biochimici che identificano l'interazione diretta di proteina e RNA endogeni sono stati indispensabili per chiarire accuratamente i ruoli normativi dell'RNA nei RPB. Ad esempio, MOV10L1 è una elicasi di RNA specifica per i testicoli necessaria per la fertilità maschile e la biogenesi9dell'RNA che interagisce con PIWI (Pirna). Il suo paralogo MOV10 è conosciuto come un onnipresente e multifunzionale RNA elicasi con ruoli in molteplici aspetti della biologia dell'RNA10,11,12,13,14 , 15 anni di , 16 anni di , 17 anni di , 18. impiegando le clip-Seq convenzionali, abbiamo scoperto che MOV10L1 lega e regola i precursori Pirna primari per avviare l'elaborazione iniziale di Pirna19,20, e che MOV10 lega le UTR di mRNA 3' e così come RNA non codificante specie nelle cellule germinate testicolari (dati non mostrati).\nTuttavia, CLIP è in origine una laboriosa, procedura radioattiva seguita da sequenza di preparazione della libreria con una notevole perdita di tag CLIP. Nella CLIP convenzionale, una libreria cDNA viene preparata utilizzando adattatori ligati ad entrambe le estremità dell'RNA. Dopo la digestione delle proteine, i polipeptidi corti reticolati restano attaccati ai frammenti di RNA. Questo segno di reticolazione blocca parzialmente la progressione della trascrittasi inversa (RTase) durante la sintesi di cDNA, risultando in cDNA troncati che rappresentano circa il 80% della libreria cDNA21,22. Pertanto, vengono sequenziati solo i frammenti cDNA risultanti da RTase che bypassano il sito di reticolazione (read-through). Recentemente, diversi approcci di CLIP, come PAR-CLIP, iCLIP, eCLIP e uvCLAP, sono stati impiegati per identificare i siti Crosslink di RBPs nelle cellule viventi. PAR-CLIP prevede l'applicazione di 365 nm di radiazione UV e analoghi nucleotidici fotoattivabili ed è quindi esclusivo per le cellule viventi in-coltura, e l'incorporazione di analoghi nucleosidici in trascrizioni di nuova sintesi è incline a produrre pregiudizi dove RNA interagisce fisicamente con la proteina23,24. In iCLIP, solo un singolo adattatore è legato all'estremità 3' di frammenti di RNA reticolati. Dopo la trascrizione inversa (RT), i cDNA troncati e read-through sono ottenuti mediante circolarizzazione intramoleularmente e re-linearizzazione seguita dall'amplificazione della reazione a catena della polimerasi (PCR)25,26. Tuttavia, l'efficienza della circolarizzazione intramolecolare è relativamente bassa. Sebbene i vecchi protocolli clip debbano etichettare l'RNA reticolato con un radioisotopo, il reticolazione ultravioletta e la purificazione dell'affinità (uvclap), con un processo di rigorosa purificazione dell'affinità di tandem, non si basano sulla radioattività27. Tuttavia, uvCLAP è limitato alle cellule coltivate che devono essere trasfected con il vettore di espressione portando il 3x FLAG-HBH tag per la purificazione di affinità tandem.\nIn eCLIP, gli adattatori sono stati legati prima all'estremità 3' dell'RNA seguita da RT, e successivamente all'estremità 3' dei cDNA in modalità intermolecolare. ECLIP è quindi in grado di catturare tutti i cDNA28troncati e read-through. Inoltre, non è limitato all'etichettatura radioattiva, né all'utilizzo di linee cellulari basate sul suo principio, pur mantenendo la risoluzione a singolo nucleotide.\nQui, forniamo una descrizione passo-passo di un protocollo eCLIP adattato per testis del mouse. Brevemente, questo protocollo eCLIP inizia con reticolazione UV dei tubuli testicolari, seguita da digestione parziale della RNAsi e immunoprecipitazioni utilizzando un anticorpo specifico per le proteine. Successivamente, l'RNA legato alla proteina è defosforilato e l'adattatore è legato alla sua estremità 3'. Dopo l'elettroforesi del gel proteico e il trasferimento da gel a membrana, l'RNA è isolato tagliando l'area della membrana di una gamma di dimensioni attese. Dopo RT, l'adattatore DNA è legato all'estremità 3' del cDNA seguita dall'amplificazione della PCR. Lo screening dei subcloni prima del sequenziamento ad alto throughput è considerato un controllo di qualità della libreria. Questo protocollo è efficace nell'identificare le principali specie di RNA legato alle proteine di RBPs, esemplificato dai due RNA che esprimono i testicoli MOV10L1 e MOV10.\nTutti gli esperimenti condotti sugli animali sono stati approvati dal comitato universitario di medicina di Nanjing. I topi maschi topi C57BL/6 sono stati mantenuti in condizioni di fotoperiodo controllato e sono stati forniti con cibo e acqua.\n1. raccolta dei tessuti e crosslinking UV\nEuthanize 2 topi adulti che utilizzano anidride carbonica (CO2) per 1-2 min o fino a quando la respirazione si arresta. Successivamente, eseguire la dislocazione cervicale su ogni mouse.\nRaccogli circa 100 mg di testicoli da topi di età appropriata (un testone adulto in questo studio) per ogni esperimento di immunoprecipitazione e posiziona i tessuti in soluzione salina tampone di fosfato ghiacciato (PBS).\nRimuovere la tunica albuginea delicatamente con un paio di pinzette a punta fine.\nAggiungere 3 ml di PBS ghiacciato in un tritacarne e triturati il tessuto con una leggera forza meccanica utilizzando un pestolo di vetro sciolto (tipo a pestello di vetro).\nNota: Lo scopo di questo passaggio non è quello di lisare le cellule, ma di separare il tessuto. È importante preservare la vitalità e l'integrità delle cellule.\nTrasferire la sospensione tissutale in un piatto di coltura cellulare (10 cm di diametro) e aggiungere un PBS ghiacciato fino a 6 mL.\nAgitare rapidamente il piatto in modo che il liquido copra uniformemente il fondo del piatto. Se il tessuto è macinato correttamente, i tubuli seminiferi distribuiti uniformemente saranno visibili, mentre la presenza di grumi di tessuto indica che la dispersione tissutale è non ottimale.\nCrosslink la sospensione tre volte con 400 mJ/cm2 a 254 nm su ghiaccio. Mescolare la sospensione tra ogni irraggiamento.\nNota: Per ogni nuovo esperimento, il reticolazione deve essere ottimizzato.\nRaccogliere la sospensione in un tubo conico da 15 mL e pellet a 1.200 x g per 5 min a 4 ° c. Rimuovere il surnatante, risospendere il pellet in 1 mL di PBS e poi trasferire la sospensione in una provetta da centrifuga da 1,5 mL. Girare a 4 ° c e 1.000 x g per 2 min, e rimuovere supernatant.\nA questo punto, procedere immediatamente con il resto del protocollo, o bloccare a scatto i pellet in azoto liquido e conservare a-80 ° c fino all'uso.\n2. preparazione delle perle\nAggiungere 125 μL di proteine A perle magnetiche per campione (pellet) a una provetta centrifuga fresca.\nNota: Utilizzare perle magnetiche G proteine per gli anticorpi del topo.\nPosizionare il tubo sul magnete per separare le perle dalla soluzione. Dopo 10 s, rimuovere il supernatante. Lavare le perle due volte con 1 mL di tampone di lisi ghiacciata.\nNota: Successiva separazione della proteina le perle magnetiche seguono questo passo. La composizione del tampone di Lisi è 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM di NaCl; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% di desossicolato di sodio; 1/50 acido etilendiamminetetraacetico (EDTA)-libero inibitore della proteasi cocktail (aggiungere fresco).\nRisospendere le perle in 100 μL di tampone di Lisi a freddo con anticorpo eCLIP da 10 μg. Ruotare i tubi a temperatura ambiente per 45 min.\nNota: La concentrazione finale di anticorpi per l'immunoprecipitazione è di 10 μg/mL. Se la concentrazione di anticorpi è sconosciuta, la quantità di anticorpo deve essere ottimizzata.\nLavare le perle due volte con 1 mL di tampone di lisi ghiacciata.\n3. Lisi tissutale e digestione a RNA parziale\nRisospendere i pellet di tessuto in 1 mL di tampone di Lisi a freddo (aggiungere 22 μL di cocktail di inibitore proteico esente da 50 x (EDTA) e 11 μL di inibitore della RNAsi a 1 mL di tampone di lisi).\nRisospendere due pellet a reticolato UV e due pellet non reticolati per gruppo di esperimenti: pellet UV-reticolato-1 per libreria eCLIP (UV-1); UV-crosslinked-2 pellet per libreria eCLIP (UV-2); pellet non reticolato-1 per libreria eCLIP come controllo (non UV); pellet non reticolato-2 per IgG IP per dimostrare la specificità degli anticorpi.\nNota: il controllo ideale per la libreria eclip dei testicoli Wide-Cross-Linked UV è quello dei testicoli Knockout UV-crosslinked dai topi della stessa lettiera.\nTenere lising i campioni su ghiaccio per 15 min (per prevenire la degradazione di proteine e RNA).\nSonicare in un sonicatore digitale al 10% di ampiezza per 5 min, a 30 s on/30 s off. Collocare sempre il campione sul ghiaccio e pulire la sonda con acqua priva di nucleasi tra ciascun campione.\nAggiungere 4 μL di DNase a ciascun tubo e mescolare bene. Incubare per 10 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min.\nAggiungere 10 μL di RNasi I diluito (4 U/μL di RNasi I in PBS) e mescolare bene. Incubare per 5 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min.\nEliminare il lisato mediante centrifugazione a 15.000 x g per 20 min (a 4 ° c).\nRaccogliere con cautela il supernatante. Lasciare 50 μL di lisato e gettare il pellet con esso.\nSalvare i campioni di input come RWB (Run per Western blot) e RRI (eseguire per l'isolamento dell'RNA). Risparmia 20 μL (2%) dei campioni UV-1, UV-2, non UV e IgG come input per il caricamento del gel RWB. Risparmia 20 μL (2%) di campioni UV-1 o UV-2 come input per il caricamento del gel RRI.\nAggiungere 1 mL di lisato (dal passaggio 3,7) alle perle (preparate nel paragrafo 2) e ruotare i campioni a 4 ° c per 2 ore o durante la notte.\nRaccogli le perle con un supporto magnetico e scartare il surnatante. Lavare le perle due volte con 900 μL di tampone ad alto sale (50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 1 M NaCl; 1 mM EDTA; 1% NP-40; 0,1% SDS; 0,5% sodio desossicolato), quindi lavare le perle due volte con 900 μL di tampone di lavaggio (20 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2; 0,2% Tween-20).\nNota: Per il campione IgG, sospendere la procedura qui e conservare sul ghiaccio nel tampone di lavaggio.\nLavare le perle una volta con 500 μL di tampone di defosforilazione 1x (Tris-HCl da 10 mM, pH 7,5; 5 mM MgCl2; 100 mm kcl; 0,02% Triton X-100).\n5. defosforilazione di RNA 3' estremità\nRaccogli le perle con un supporto magnetico e scartare il surnatante. Rimuovere il liquido residuo utilizzando puntali per pipette sottili. Aggiungere 100 μL di miscela Master di defosforilazione (10 μL di tampone di defosforilazione 10x [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM MgCl2; 1 M kcl; 0,2% Triton X-100; 1 mg/ml di albumina sierica bovina (BSA)]; 78 μl di acqua priva di nucleasi; 2 μl di inibitore della RNAsi; 2 μl di dnasi; 8 μl di al per ogni campione, e incubare per 15 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 rpm.\nAggiungere 300 μL di miscela di polinucleotide chinasi (PNK) Master (60 μL di 5x PNK pH 6,5 buffer [350 mM Tris-HCl, pH 6,5; 50 mM MgCl2]; 223 μl di acqua priva di nucleasi; 5 μl di inibitore della RNAsi; 2 μl di dnasi; 7 μl di enzima PNK; 3 μl di 0,1 M di dithiothreitol) ad ogni campione , incubare per 20 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 rpm.\nRaccogli le perle con un supporto magnetico e scartare il surnatante. Lavare le perle una volta con 500 μL di tampone di lavaggio a freddo. Quindi lavare le perle una volta con 500 μL di tampone ad alto sale freddo. Ripetere questi Lavini ancora una volta in questo ordine.\nLavare le perle una volta con 500 μL di tampone di lavaggio a freddo e poi due volte con 300 μL di tampone di legazione 1x freddo (no dithiothreitol, 50 mM Tris-HCl, pH 7,5; 10 mM MgCl2).\n6. RNA adattatore legazione a RNA 3' estremità\nEliminare il surnatante e rimuovere il liquido residuo con puntali per pipette sottili. Aggiungere 25 μL di miscela Master di legatura da 3' a ciascun campione. Mescolare accuratamente con il pipettaggio. Questo passo è incline alla produzione di bolle.\nNota: La miscela Master di legazione contiene 3 μL di tampone di legazione 10x [500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl2]; 9 μL di acqua priva di nucleasi; 0,4 μL di inibitore della RNAsi; 0,3 μL di 0,1 M di ATP; 0,8 μL di dimetilsolfossido (DMSO); 9 μL di 50% polietilenglicole (PEG) 8000; 2,5 μL di RNA ligasi [30 U/μL].\nAggiungere 2,5 μL di adattatore RNA X1A (tabella 1) e 2,5 μl di adattatore RNA X1B (tabella 1) a ciascun campione. Miscelare accuratamente con pipettaggio o sfogliando, e incubare per 75 min a 25 ° c, per miscelare ogni 10 min.\nLavare le perle una volta con 500 μL di tampone di lavaggio a freddo (riprendere il campione IgG qui).\nLavare le perle una volta con 500 μL di tampone ad alto sale freddo e poi con 500 μL di tampone di lavaggio a freddo. Ripeti questi Lavini ancora una volta.\nSeparare magneticamente le perle e rimuovere il liquido residuo con puntali per pipette sottili.\nRisospendere le perle in 100 μL di tampone di lavaggio a freddo (mettere in pausa il campione di IgG qui e conservare sul ghiaccio nel tampone di lavaggio). Spostare 20 μL in nuovi tubi come campioni di RWB. Separare magneticamente i restanti 80 μL come campioni RRI. Rimuovere il supernatante dei campioni RRI e risospendere le perle in 20 μL di tampone di lavaggio.\nAggiungere 37,5 μL di tampone di campionamento 4x di dodecilsolfato (LDS) al litio e 15 μL di 10 volte l'agente riducente al campione IgG. Aggiungere 7,5 μL di tampone campione di 4x LDS e 3 μL di 10 volte l'agente riducente ai campioni (rimanenti). (Non miscelare con il pipettaggio). Incubare per 10 min a 70 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min. Raffreddare su ghiaccio per 1 min, e centrifugare a 1.000 x g per 1 min a 4 ° c.\n7. SDS-PAGE e trasferimento a membrana\nCaricare i gel.\nPer il gel RRI (gel proteico 4-12% bis-tris, 10-Well, 1,5 mm) Posizionare i tubi su un magnete e separare le proteine dalle perle. Caricare 30 μL di campione per pozzetto. I campioni sono distanziati da marker di dimensione proteica pre-macchiato.\nPer il gel RWB (gel proteico 4-12% bis-tris, 10-Well, 1,5 mm) Posizionare i tubi su un magnete e separare le proteine dalle perle. Caricare 15 μL di campione per pozzetto. Salvare i campioni rimanenti a-20 ° c come backup.\nAggiungere 500 μL di antiossidante a 500 mL di 1x tampone SDS in esecuzione. Eseguire a 200 V nel buffer 1x SDS in esecuzione per 50 min o fino a quando il colorante anteriore è in basso.\nNota: Antiossidante contiene N, N-dimetilformamide, bisulfite di sodio, che migra con proteine ridotte per prevenire la reossidazione di aminoacidi sensibili come la metionina e il triptofano.\nTrasferire i complessi di proteina-RNA dal gel a una membrana nitrocellulosa a 10 V per 70 min nel buffer 1xtransfer con il 10% di metanolo (vol/vol). Sciacquare la membrana RRI in PBS freddo, avvolgerla in involucro di plastica e conservare a-80 ° c.\nBloccare la membrana RWB nel 5% di latte in TBST a temperatura ambiente per 1 h. Sciacquare la membrana in TBST. Incubare con l'anticorpo primario in TBST a 4 ° c durante la notte. Lavare due volte con TBST per 5 min. Incubare con anticorpo secondario (1:5000 IgG anti-coniglio di capra HRP) in TBST a temperatura ambiente per 1 h. lavare tre volte con TBST per 5 min, 10 min e 15 min, rispettivamente.\nMescolare i volumi uguali di elettrochemiluminescenza (ECL) buffer A e tampone B, aggiungere alla membrana e incubare per 1 min. coprire la membrana con involucro di plastica, e esporla a un film a raggi X a temperatura ambiente per 2-3 min. Poi sviluppare il film.\nNota: Il film con sovraesposizione mostrerà chiaramente la forma dei bordi della membrana, con cui il film può essere allineato di nuovo alla membrana RWB. Quindi, allineare le membrane RWB e RRI in base alle posizioni dei marcatori in esso. Strati in ordine dal basso verso l'alto sono il film, la membrana RWB e la membrana RRI in sequenza.\n8. isolamento dell'RNA\nTagliare la regione dalla banda proteica a 75 kDa (circa 220 NT di RNA) sopra di esso, utilizzando la membrana RWB e pellicola come guide.\nNota: Poiché una molecola di RNA protetta da proteine può avere una lunghezza massima di 225 basi, con circa 340 da per base, è ragionevole tagliare la regione circa 75 kDa sopra la banda RBP per recuperare tutti i complessi di proteina-RNA.\nTagliare il pezzo di membrana asportato in diverse piccole fette e metterli in una nuova provetta da centrifuga da 1,5 mL. Aggiungere 200 μL di tampone di proteinasi K (PK) (100 mM Tris-HCl pH 7,5; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA) con 40 μL di PK ai pezzi di membrana. Mescolare e incubare per 20 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min.\nAggiungere 200 μL di tampone di urea PK (100 mM Tris-HCl pH 7,4; 50 mM NaCl; 10 mM EDTA; 7 M urea) ad ogni campione. Incubare per 20 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min.\nAggiungere 400 μL di acido fenolo/cloroformio/alcool isoamilico (25:24:1), mescolare bene e incubare per 5 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 rpm.\nPosizionare 2 mL di gel di blocco di fase (PLG) nella centrifuga e girare a 15.000 x g per 25 s.\nTrasferire tutti i contenuti eccetto le fette di membrana al tubo pesante PLG. Incubare per 5 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min.\nGirare a temperatura ambiente e 15.000 x g per 15 min. trasferire lo strato acquoso in un nuovo tubo conico da 15 ml.\nUtilizzare le colonne di purificazione e concentrazione dell'RNA per estrarre RNA.\nAggiungere 2 volumi (800 μL) di tampone di binding RNA a ciascun campione (dal passaggio 8,7) e mescolare. Aggiungere un volume uguale (1200 μL) di etanolo 100% e mescolare.\nTrasferire 750 μL di campione (da Step 8.8.1) alle colonne di purificazione e concentrazione dell'RNA in un tubo di raccolta e centrifugare a 15.000 x g per 30 s. eliminare il flusso passante.\nRipetere il passaggio 8.8.2 fino a quando tutti i campioni vengono passati attraverso la colonna. Aggiungere 400 μL di tampone di preparazione RNA alla colonna e centrifugare a 15.000 x g per 30 s. eliminare il flusso passante, applicare 700 μl di tampone di lavaggio RNA e centrifugare la colonna a 15.000 x g per 30 s. eliminare il flusso passante.\nAggiungere 400 μL di tampone di lavaggio RNA alla colonna e centrifugare a 15.000 x g per 2 min. trasferire accuratamente la colonna in un nuovo tubo da 1,5 ml. Aggiungere 10 μL di acqua priva di nucleasi alla matrice di colonna, lasciare riposare per 2 minuti e centrifugare a 15.000 x g per 30 s. conservare i campioni eclip a-80 ° c fino a RT (passo 11,1).\n9. defosforilazione dell'RNA di ingresso 3' estremità\nAggiungere 15 μL di miscela Master di defosforilazione (2,5 μL di tampone di defosforilazione 10x [100 mM Tris-HCl, pH 8,0; 50 mM MgCl2; 1 M kcl; 0,2% Triton X-100; 1 mg/ml BSA]; 9,5 μl di acqua priva di nucleasi; 0,5 μl di inibitore della RNAsi; 2,5 μl di fosfatasi alcalina) a 10 μl di campioni di ingresso (dal passo 8.8.4). Incubare per 15 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min.\nAggiungere 75 μL di PNK Master Mix (20 μL di 5x PNK PH 6,5 buffer [350 mM Tris-HCl, pH 6,5; 50 mM MgCl2]; 44 μl di acqua priva di nucleasi; 1 μl di inibitore della RNAsi; 2 μl di dnasi; 7 μl di enzima PNK; 1 μl di 0,1 M di dithiothreitol) ai campioni. Incubare per 20 min a 37 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min.\nPulizia dell'RNA di ingresso\nRisospendere gli acidi thenucleici estrazione magnetica beadsin il flaconcino (vortice per più di 30 s). Aggiungere 20 μL di acidi nucleici di estrazione di perle magnetiche per ogni campione di nuovi tubi. Raccogli le perle con un supporto magnetico e scartare il surnatante.\nLavare le perle una volta con 1 mL di tampone di lisi di purificazione dell'RNA (tampone RLT). Posizionare il tubo su un magnete per 30 s e scartare il surnatante.\nNota: Successiva separazione di acidi nucleici perle magnetiche estrazione ha seguito questo passo.\nRisospendere i grani con 300 μL di tampone RLT e aggiungerlo al campione. Aggiungere 10 μL di NaCl da 5 M e 615 μL di alcool etilico al 100% (EtOH) e miscelare mediante pipettaggio. Ruotare a temperatura ambiente per 15 minuti. Separare magneticamente le perle e rimuovere il surnatante.\nRisospendere le perle in 1 mL di 75% EtOH e trasferirla in un nuovo tubo. Dopo 30 s, Raccogli le perle con un supporto magnetico e scartare il surnatante. Lavare due volte con 75% EtOH, separare magneticamente le perle e scartare il liquido residuo con puntali per pipette sottili. Asciugare all'aria per 5 minuti (evitare l'essiccazione eccessiva).\nRisospendere le perle con 10 μL di acqua priva di nucleasi e incubare per 5 min. perline magneticamente separate e spostare 5 μL di supernatante in un nuovo tubo (per la legatura dell'adattatore 3' sotto). Il rimanente RNA può essere conservato a-80 ° c come backup.\n10. RNA adattatore legazione all'ingresso RNA 3' estremità\nAggiungere 1,5 μL di DMSO e 0,5 μL di adattatore RiL19 (tabella 1) a 5 ΜL di RNA di ingresso (dal passo 9.3.5), incubare per 2 minuti a 65 ° c e posizionarlo su ghiaccio per più di 1 minuto. aggiungere 13,5 μl di miscela Master di legatura 3' per ogni campione , mescolare per pipettaggio e incubare per 75 min a 25 ° c, con la miscelazione per mescolare ogni 15 min.\nNota: La legazione Master Mix contiene 2 μL di tampone di legazione 10x [500 mM Tris-HCl, pH 7,5; 100 mM MgCl2; 10 mm dithiothreitol]; 1,5 μL di acqua priva di nucleasi; 0,2 μL di inibitore della RNAsi; 0,2 μL di 0,1 M di ATP; 0,3 μL di DMSO; 8 μL di 50% PEG8000; 1,3 μL di RNA ligasi [30 U/μL].\nPulizia dell'RNA di ingresso Ligato\nSeparare magneticamente 20 μL di acidi nucleici di estrazione di perle magnetiche per ogni campione, e rimuovere il surnatante. Lavare le perle una volta con 1 mL di tampone RLT.\nRisospendere le perle in 61,6 μL di tampone RLT e sospensione di trasferimento ad ogni campione. Aggiungere 61,6 μL di 100% di EtOH. Usare la pipetta per mescolare per 15 min ogni 5 min. perline magneticamente separate, e rimuovere supernatant.\nRipetere il passaggio 9.3.4.\nRisospendere le perle con 10 μL di acqua priva di nucleasi e lasciarlo riposare per 5 minuti. Separare magneticamente le perle e trasferire 10 μL di supernatante in un nuovo tubo.\nNota: Questo è un possibile punto di arresto (i campioni di ingresso possono essere conservati a-80 ° c fino al giorno successivo).\n11. trascrizione inversa, DNA adattatore legazione a cDNA 3' estremità\nAggiungere 0,5 μL di primer RT (tabella 1) a 10 ΜL di RNA di ingresso (da Step 10.2.4) e 10 ΜL di RNA clip (dal passo 8.8.4) rispettivamente, incubare per 2 minuti in un blocco PCR preriscaldato a 65 ° c, posizionarlo su ghiaccio per più di 1 minuto.\nAggiungere 10 μL di Master Mix RT (2 μL di tampone RT [500 mM Tris-HCl, pH 8,3; 750 mM KCl; 30 mM MgCl2]; 4 μl di acqua priva di nucleasi; 0,3 μL di inibitore della RNAsi; 2 μl di 0,1 m di dithiothreitol; 0,2 μl di 0,1 m di dATP; 0,2 μl di 0,1 m dCTP; 0,2 μl di 0,1 M dGTP; 0,2 μL di 0,1 M di dTTP; 0,9 μL di trascrittasi inversa) ad ogni campione, miscelare, incubare a 55 ° c per 45 min su un blocco PCR preriscaldato.\nMiscelare 20 μL di prodotto di reazione RT con 3,5 μL di reagente per la pulizia del prodotto PCR. Incubare per 15 minuti a 37 ° c.\nAggiungere 1 μL di 0,5 M EDTA, miscelare mediante pipettaggio. Aggiungere 3 μL di NaOH di 1 M, miscelare per pipettaggio e incubare per 12 minuti a 70 ° c su un blocco PCR per idroidinare il modello RNA.\nAggiungere 3 μL di HCl 1 M, miscela di pipette per neutralizzare il tampone.\nPulizia di cDNA\nSeparare magneticamente 10 μL di perle magnetiche di estrazione dell'acido nucleico per ogni campione, rimuovere il surnatante. Lavare una volta con 500 μL di tampone RLT.\nRisospendere le perle in 93 μL di tampone RLT e sospendere il trasferimento al campione. Aggiungere 111,6 μL di 100% di EtOH, incubare per 5 minuti e miscelare la pipetta ogni 2 min. Raccogli le perle con un supporto magnetico e scartare il surnatante. Risospendere le perle con 1 mL di 80% EtOH e passare ad un nuovo tubo.\nDopo 30 s, Raccogli le perle con un supporto magnetico e scartare il surnatante. Lavare due volte con 80% EtOH. Separare magneticamente e smaltire il liquido residuo con una punta fine. Asciugare all'aria per 5 minuti (evitare l'essiccazione eccessiva). Risospendere le perle in 5 μL di Tris-HCl da 5 mM e incubare per 5 min.\nAggiungere 0,8 μL di adattatore di DNA (tabella 1) e 1 ΜL di DMSO alle perle, incubare per 2 min a 75 ° c. Mettere sul ghiaccio per più di 1 min.\nPreparare 12,8 μL di miscela Master di legatura (2 μL di tampone di legazione 10x [500 mM Tris-HCl; 100 mM MgCl2; 10 mm dithiothreitol]; 1,1 μl di acqua priva di nucleasi; 0,2 μl di 0,1 M ATP; 9 μl di 50% PEG8000; 0,5 ΜL di RNA ligasi [30 U/μl]) , Flick per mescolare, girare brevemente in una centrifuga, e aggiungerlo a ogni campione, mescolare il campione con la punta della pipetta lentamente.\nAggiungere un altro 1 μL di RNA ligasi [30 U/μL] a ciascun campione e scorrere per miscelare. Incubare per 30 s a 25 ° c, scuotendo a 1.200 giri/min. Incubare a 25 ° c durante la notte. Flick per mescolare leggermente 5 a 6 volte, una volta all'ora.\nPulizia della cDNA ligata\nSeparare magneticamente 5 μL di acidi nucleici di estrazione di perle magnetiche per ogni campione, e rimuovere surnatante.\nLavare una volta con 500 μL di tampone RLT.\nRisospendere le perle in 60 μL di tampone RLT su perline e trasferire la sospensione ad ogni campione. Aggiungere 60 μL di 100% di EtOH, incubare per 5 minuti e miscelare la pipetta ogni 2 min. Separare magneticamente, scartare surnatante.\nRisospendere le perle con 27 μL di Tris-HCl da 10 mM, incubare per 5 min. Separare magneticamente e spostare 25 μL di campione in un nuovo tubo. Diluire i 1 μL di cDNA ligata con 9 μL di acqua priva di nucleasi in un nuovo tubo. Conservare i campioni rimanenti a-20 ° c fino al passaggio 13,1.\n12. quantificazione della cDNA mediante PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)\nAggiungere 9 μL di miscela Master qPCR (5 μL di mix master 2x; 3,6 μL di acqua priva di nucleasi; 0,4 μL di miscela di primer [10 μM PCR-F-D50X e 10 μM PCR-R-D70X]) su una piastra qPCR da 96 pozzetti. Aggiungere 1 μL di 1:10 diluito (in H2O) cDNA (da Step 11.10.5), sigillare e miscelare.\nEseguire il programma qPCR in un termociclatore: 2 min a 50 ° c; 2 min a 95 ° c; 3 s a 95 ° c seguita da 30 s a 68 ° c per 40 cicli; 15 s a 95 ° c seguita da 60 s a 68 ° c seguita da 15 s a 95 ° c per 1 ciclo. Nota CT (soglia ciclo) valore.\n13. amplificazione della PCR di cDNA\nErogare 35 μL di miscela Master PCR (25 μL di miscela Master 2x PCR; 5 μL di acqua priva di nucleasi; 5 μL di miscela di primer [20 μM PCR-F-D50X e 20 μM PCR-R-D70X]) in strisce da 8 pozzetti. Per il gruppo CLIP, aggiungere 12,5 μL di campione CLIP + 2,5 μL di H2O; per il gruppo di ingressi, aggiungere 10 μL di ingressi + 5 μL di H2O. mescolare bene e ruotare brevemente in centrifugazione.\nEseguire il programma PCR: 30 s a 98 ° c; 15 s a 98 ° c seguita da 30 s a 68 ° c seguita da 40 s a 72 ° c per 6 cicli; 15 s a 98 ° c seguita da 60 s a 72 ° c per N cicli = (valori qPCR CT-3)-6; 60 s a 72 ° c; 4 ° c tenere premuto.\nNota: È preferibile eseguire da 1 a 2 cicli PCR aggiuntivi per il primo paio di clip.\n14. purificazione del gel\nCaricare campioni su un gel di agarosio ad alta risoluzione del 3%. Lasciando 1 pozzo vuoto tra i campioni, e utilizzare una scala su entrambi i lati del gel. Eseguire a 100 V per 75 min in 1x tampone Tris-Borato-EDTA (TBE).\nSotto l'illuminazione di luce blu, tagliare le fette di gel 175-350 BP utilizzando lame di rasoio fresco per ogni campione. Metterli in 15 mL di tubi conici.\nPesare la fetta di gel e eluire il gel utilizzando un kit di estrazione del gel.\nAggiungere 6x volumi di tampone di dissoluzione del gel per fondere il gel (100 mg di gel = 600 μL di tampone di dissoluzione del gel). Sciogliere il gel a temperatura ambiente. (Agitare per mescolare ogni 15 minuti fino a quando la fetta di gel è completamente disciolta). Aggiungere 1 volume di gel di 100% isopropanolo e mescolare bene.\nTrasferire 750 μL di campione (da Step 14.2.2) alla colonna in un tubo di raccolta e centrifugare a 17.900 x g per 1 min. eliminare il flusso passante.\nRipetere il passo 14.2.3 fino a quando tutti i campioni sono passati attraverso la colonna, lavare una volta con 500 μL di tampone di dissoluzione del gel.\nAggiungere 750 μL di tampone di lavaggio (dal kit di estrazione del gel) alla colonna e centrifugare a 17.900 x g per 1 min. eliminare il flusso passante, girare a 17.900 x g per 2 min. Posizionare la colonna su un nuovo tubo da 1,5 ml.\nRimuovere tutto il tampone di lavaggio rimanente dal bordo viola di plastica della colonna. Asciugare l'aria per 2 min. aggiungere 12,5 μL di acqua priva di nucleasi al centro della membrana. Lasciate riposare la colonna per 2 minuti a temperatura ambiente e ruotate a 17.900 x g per 1 min (per una resa migliorata, ripetete la fase di eluizione).\n15. TOPO Clone di prodotto PCR\nPreparare il mix di reazione di clonazione TOPO (1 μL di prodotto PCR dal passo 14.2.6; 1 μL di miscela di clonazione; 3 μL di acqua sterile). Mescolare delicatamente e incubare per 5 min a 20-37 ° c. Raffreddare sul ghiaccio.\nScongelare i batteri E. coli chimicamente competenti sul ghiaccio. Aggiungere 5 μL del prodotto di clonazione TOPO a 100 μL di batteri competenti29. Mescolare delicatamente bene. Incubare su ghiaccio per 30 min.\nShock termico per 60 s a 42 ° c. Poi raffreddare su ghiaccio per 2 min. aggiungere 900 μl di brodo di lisogenia (lb) medio, incubare a 37 ° c per 1 h, scuotendo a 225 rpm. Girare a 1.000 x g per 1 minuto, quindi rimuovere 900 μl di supernatante. Risospendere il resto della soluzione.\nPiastra i batteri trasformati su 1,5% LB piastre agar contenenti ampicillina (100 μg/mL), e incubare durante la notte a 37 ° c.\nPreparare almeno 20 1,5 mL di provette centrifughe per ogni costrutto. Riempire un set con 500 μL di mezzo LB contenente 100 μg/mL di ampicillina. Utilizzare una punta di pipetta sterile per graffiare una colonia batterica in modo casuale e mescolare (pipettando) con 500 μL di mezzo LB. Incubare a 37 ° c per 5 ore, scuotendo a 225 giri/min.\nSequenza del frammento di inserto utilizzando il fondo di inversione M13: CAGGAAACAGCTATGAC di Sanger sequenziamento30.\nLa procedura eclip e i risultati sono illustrati nella figura 1, figura 2, Figura 3, figura 4. I topi sono stati eutanizzati con anidride carbonica e una piccola incisione è stata fatta nel basso addome utilizzando forbici chirurgiche (Figura 2a,B). Testicoli del mouse sono stati rimossi, detunicated e poi UV-crosslinked dopo la macinazione (Figura 2C-I). I risultati di eCLIP rappresentativi dell'uso di due helicasi leganti RNA conosciute nei tessuti testali sono rappresentati nelle figure 3 e 4. Abbiamo eseguito MOV10 eCLIP in testicoli da topi wild-type adulti, con concentrazione comune di 40 U/mL di RNase I trattamento del lisato reticolato. Il pannello superiore della Figura 3A Mostra che la proteina bersaglio di dimensioni circa 114 kDa è stata arricchita con successo. Western blot delle proteine MOV10L1 immunoprecipitate è stata eseguita con due concentrazioni (5 o 40 U/mL) di RNasi I durante il processo eCLIP (Figura 3A). La Figura 3B Mostra qPCR utilizzando 1:10 cDNA diluito (già legati con adattatore DNA) da MOV10 e MOV10L1 UV-crosslinked, non reticolato, e il campione di input abbinato dimensione corrispondente (sminput). I campioni non reticolati mostrano una riduzione del recupero dell'RNA. Abbiamo osservato che, i valori di CT del gruppo non reticolato era generalmente 5 volte più di UV-crosslinked gruppo. La Figura 4a Visualizza l'amplificazione della PCR e la selezione delle dimensioni tramite elettroforesi con gel di agarosio (Cut 175-350 BP). Primer-dimer prodotto appare a circa 140 BP. Figura 4B Mostra la vista del browser del genoma UCSC di due sequenze subclone rappresentative. I tag eCLIP MOV10-Bound si trovano all'interno del 3' UTR del gene FTO; Il tasso approssimativo di 3' obiettivi UTR conti per 75% (Figura 4c), coerente con la maggior parte dei bersagli MOV10 in HEK293 celle10 e nei testicoli (dati non mostrati). Al contrario, i tag eCLIP con associazione a MOV10L1 si trovano all'interno di un cluster piRNA che indica MOV10L1 bersagli piRNA precursori. Il tasso approssimativo di bersagli precursori di piRNA rappresenta il 42% (Figura 4E), che riflette una tendenza rispetto al nostro precedente esperimento clip20convenzionale. MOV10L1 eCLIP con 40 U/mL la digestione di RNasi I produce relativamente più sequenze con meno di 20 BP (Figura 4D).\nFigura 1 : Rappresentazione schematica di eCLIP. I tubuli seminiferi con puntatore UV-crosslinked (fase 1) sono lisati nel tampone di lisi eCLIP e sonicato (fase 2). Il lisato viene trattato con RNasi I a frammento di RNA, dopo di che i complessi di proteina-RNA sono immunoprecipitati utilizzando l'anticorpo anti-RBP (passaggio 3-4). Vengono eseguite defosforilazione di frammenti di RNA e Legazione di 3 ′ RNA Adapter (passo 5-6). I complessi di proteina-RNA vengono eseguiti su un gel SDS-PAGE e trasferiti alle membrane di nitrocellulosa (fase 7). RNA viene recuperato dalla membrana digerendo la proteina con proteinasi K e urea che lascia un breve polipeptide rimanente nel sito di collegamento incrociato. Viene eseguita la defosforilazione dei frammenti di RNA dei campioni di input e la legatura dell'adattatore di 3 ′ RNA (fase 8). Eseguire RT di RNA e Legazione di 3 ′ adattatore di DNA (passo 9-10). Eseguire l'amplificazione della PCR della libreria cDNA, l'estrazione del gel e la clonazione di PCR smussata per il controllo preliminare della qualità della libreria (passaggio 11). Infine, eseguire il sequenziamento ad alta velocità (passaggio 12). Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.\nFigura 2 : Raccolta tissutale testis e reticolazione UV. (A) l'esposizione dell'addome del topo. B) un'incisione di 0,5 cm nella parete addominale che espone il peritoneo. (C) una coppia di testicoli viene tolto tirando fuori i tamponi di grasso. D) il tessuto testicolare viene rimosso e collocato in un piccolo piatto contenente PBS ghiacciato. (E) rimuovere delicatamente la tunica albuginea. (F) Premere il pestolo sciolto per triturati il tessuto in una smerigliatrice tessuto Dounce. G) tubuli seminiferi distribuiti in una placca da 10 cm. H) reticolazione UV con 400 MJ/cm2 di energia. I) i campioni reticolati sono raccolti in provette da centrifuga da 1,5 ml. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.\nFigura 3 : Risultati rappresentativi di MOV10 e MOV10L1 eCLIP. (A) convalida Western Blot di immunoprecipitates MOV10 e MOV10L1. (B) qpcr su 1:10 librerie eclip diluite di MOV10 e MOV10L1, con repliche per i campioni UV, non UV e sminput accoppiati. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.\nFigura 4 : preparazione della libreria eclip e valutazione della qualità. (A) vengono mostrate le immagini in gel dell'amplificazione PCR. Asterisco indica il dimero del primer. La linea rossa punteggiata indica le regioni asportate per il prodotto PCR di cDNA, da qualche parte tra 175 e 350 BP. (B) vista del browser del genoma UCSC di due sequenze di subclone rappresentative31. (C) analisi del sequenziamento del subclone su piccola scala di MOV10. (D) i tag con associazione a MOV10L1 visualizzano modelli distinti di distribuzione della lunghezza quando elaborati da due diverse concentrazioni di RNAsi. (E) analisi del sequenziamento del subclone su piccola scala di MOV10L1. Si prega di cliccare qui per visualizzare una versione più grande di questa cifra.\nNome sequenza Informazioni sulla sequenza descrizione\nRNA X1A /5Phos/AUAUAGGNNNNNAGAUCGGAAGAGCGUCGUGUAG/3SpC3/ stock a 200 μM; lavorare a 20 μM\nRNA X1B /5Phos/AAUAGCANNNNNAGAUCGGAAGAGCGUCGUGUAG/3SpC3/ stock a 200 μM; lavorare a 20 μM\nRiL19 /5phos/AGAUCGGAAGAGCGUCGUG/3SpC3/ stock a 200 μM; lavorare a 40 μM\nRand103tr3 /5Phos/NNNNNNNNNNAGATCGGAAGAGCACACGTCTG/3SpC3/ stock a 200 μM; lavorare a 80 μM\nAR17 Di ACACGACGCTCTTCCGA stock a 200 μM; lavorare a 20 μM\nPCR-F-D 501 L'AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTATAGCCTACACTCTTTCCCTACACGACRCTCTTCCGATCT stock a 100 μM; lavorare a 20 μM\nPCR-R-D 701 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAGTAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATC stock a 100 μM; lavorare a 20 μM\n(Vedere la lettera di assistenza clienti illumina per D502-508, D702-712)\nTabella 1: sequenze di adattatori e primer. L'adapter contiene un in-line Random-Mer (N5 o N10) per determinare se due letture sequenziate identiche indicano due frammenti di RNA univoci o duplicati PCR dello stesso frammento di RNA. "5 Phos" sta per 5' fosforilazione, che è necessaria se un oligo è usato come substrato per DNA/RNA ligasi. "3SpC3" sta per 3' C3 distanziatore, che può impedire la legazione tra gli adattatori.\nCon la crescente comprensione del ruolo universale degli RBPS in contesti sia biologici che patologici, i metodi di ritaglio sono stati ampiamente utilizzati per rivelare la funzione molecolare di RBPS20,32,33, 34,35. Il protocollo qui descritto rappresenta un'applicazione adattata del metodo eCLIP ai testis del mouse.\nUna sfida nell'esecuzione di eclip in testicolo è mantenere la vitalità e l'integrità delle cellule testicolari fresche, che è anche importante per l'efficace reticolazione. Cesellare il testicolo con forza meccanica lieve utilizzando il pestello sciolto può prevenire la lisi cellulare32,36. Una corretta digestione dell'RNA è fondamentale anche per i saggi eCLIP di successo. I frammenti di RNA potrebbero essere più convergenti dopo la digestione, ma la lunghezza inferiore a 20 BP può essere rimossa tramite la pre-elaborazione delle letture della libreria. Al fine di adottare un dosaggio ideale di RNAsi per un candidato RBP, suggeriamo un test preliminare basato sui risultati del sequenziamento del subclone di librerie eCLIP che possono essere preparati dal trattamento RNase con concentrazioni che vanno da 0 a 40 U (per millilitro di lisato). L'analisi del sequenziamento del subclone su piccola scala è un passo consigliato per un esame affidabile della qualità della libreria nel nostro metodo eCLIP. In primo luogo, la percentuale di inserti inferiori a 20 BP non dovrebbe essere troppo alta, oppure, la successiva pre-elaborazione della libreria eCLIP causerà una costosa perdita di letture. In secondo luogo, deve essere verificata l'efficienza della corretta legazione di entrambi gli adattatori. I campioni substandard possono essere eliminati senza sequenziamento profondo per garantire un sequenziamento profondo di successo, i cui risultati generalmente ci vogliono molto più tempo per l'analisi.\nAnche se la fattibilità di eclip nei testicolo del topo è ancora limitata dalla specificità dell'anticorpo per la fase di immunoprecipitazione, eclip è vantaggioso rispetto ai metodi tradizionali di clip in diversi aspetti. In primo luogo, è un metodo non radioattivo. Con eCLIP, gli obiettivi RNA di RBPs sono direttamente catturati in vivo senza dover ricorrere a tecniche intensive di manodopera che utilizzano materiali radioattivi. In secondo luogo, il metodo è meno intensivo di tempo. L'intera procedura richiede solo 4 giorni attraverso la preparazione della libreria eCLIP. Terzo, la diversità di sequenza. Confrontato con il ciclo di amplificazione unificato convenzionale di 25-35 cicli, eclip si riferisce ai valori CT di qPCR per impostare il numero di cicli PCR specificamente. Infine, fornisce un rapporto segnale/rumore più forte. L'input corrispondente alle dimensioni funge da sfondo appropriato per gli obiettivi autentici.\nIn sintesi, i nostri risultati eCLIP consolidano le conclusioni che MOV10 e MOV10L1 hanno una preferenza vincolante per i precursori di mRNA 3' UTR e piRNA, rispettivamente. Il protocollo che abbiamo descritto qui rappresenta il primo impiego del metodo eCLIP nella riproduzione, un'area in cui la conoscenza dell'interazione RNA-RBP è piuttosto insufficiente, anche se gli studi genetici hanno fornito ampie informazioni sui ruoli biologici di RBPs. la visualizzazione di questo protocollo eCLIP può aiutare a guidare le sue applicazioni diffuse in aree più ampie.\nRingraziamo Eric L Van Nostrand e gene W Yeo per una guida utile con il protocollo originale. K.Z. è stato supportato da National Key R & D programma della Cina (2016YFA0500902, 2018YFC1003500), e la Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (31771653). L.Y. è stato sostenuto dalla Fondazione nazionale di scienze naturali della Cina (81471502, 31871503) e dal programma innovativo e imprenditoriale della provincia di Jiangsu.


Palermo/ Programma “Rinascimento”. La Fincantieri impegnata con “MSC Armonia” | Rassegna Stampa Militare\nPalermo/ Programma “Rinascimento”. La Fincantieri impegnata con “MSC Armonia”\nPalermo – Si era svolta il 19 Maggio scorso presso lo stabilimento Fincantieri di Palermo l’impostazione del primo blocco di “MSC Armonia”, cha aveva dato inizio al programma Rinascimento, l’imponente piano da quasi 200 milioni di euro a cui saranno sottoposte tutte e quattro le navi della classe Lirica di MSC Crociere.\nLa sezione posata sullo scalo pesa circa 350 tonnellate. Nei successivi tre mesi si sono aggiunte tre ulteriori sezioni, il cui taglio delle lamiere era in corso presso le officine del cantiere palermitano. Il troncone, così composto, era stato varato alla fine del mese di luglio, per essere “inserito” al centro dello scafo della nave, arrivata in cantiere il 31 agosto. Si otterranno in questo modo circa 200 nuove cabine, nuovi spazi dedicati all’intrattenimento, nonché il rinnovamento, negli spazi e nel decor, delle boutique di bordo e l’adozione di soluzioni tecnologiche d’avanguardia per l’intera unità.\nIl programma Rinascimento, annunciato lo scorso dicembre da MSC Crociere e Fincantieri, interesserà anche MSC Lirica, MSC Sinfonia e MSC Opera e sarà completato entro il 2015.\n« Bari/ Unuci. Presentazione del libro “L’Ultima bozza” di Michele Scaranello\nLibano/ CIMIC. I Caschi blu italiani realizzano un pozzo per la municipalità di Al Qulaylah »


illustrazioni Archivi - IDEESTORTEPAPER\nLibri per bambini e illustrazioni Ideestortepaper dal 3 al 5 settembre a La via dei Librai e dal 16 al 19 a Una Marina di LibriContinue reading Le fiere editoriali di settembre: dove trovare libri e illustrazioni Ideestortepaper →\nLe illustrazioni della serie Botanica Fantastica e Balene, formato 30x40cm direttamente a casa tua con un click. Spedizioni in Italia e all’estero. Scopri come acquistarle!Continue reading Illustrazioni botaniche con un click a casa tua! →\nLe illustrazioni tratte dagli albi illustrati Ideestortepaper adesso sono anche on line. Acquistale sul nostro shop, nella sezione ILLUSTRAZIONI del sito.Continue reading Acquista on line le illustrazioni Ideestortepaper →\n11 Novembre 2020 1 Febbraio 2021


Hotel di lusso Porec - Hotelmix.it\nHotel di lusso Porec\nHotel Laguna Molindrio che vanta una posizione vicina a Dvigrad Castle, Aquapark Istralandia e Porec Old Town offre 265 camere e una piscina esterna, un centro wellness e una terrazza solarium. L'hotel splendido rappresenta l'architettura in stile francese a Porec. Maggiori dettagli\nIve Lole Ribara 8, Porec, Croazia, 52440, Mappa\nL'Albergo ha subito lavori di modernizzazione nel 2013. La struttura ha un totale di 8 camere. Maggiori dettagli\nL'hotel a 4 stelle Hotel Mauro vanta una posizione vicina a Aquacolors Water Park Poreč, Dvigrad Castle e Byblos Club Porec a solo 2.9 km. Maggiori dettagli\nRade Koncara 4, Porec, Croazia, 52440, Mappa\nHotel Flores Porec è una struttura a 4 stelle situata a solo 2.3 km da Aquapark Istralandia, Byblos Club Porec e Dvigrad Castle. Maggiori dettagli\nOtok Sv. Nikola ;, Porec, Croazia, 52440, Mappa\nValamar Isabella Island Resort è situato nell'area marina di Porec in prossimità di Pazin Castle, Aquapark Istralandia e Dvigrad Castle. Il centro città è a 10 minuti a piedi dalla struttura. Maggiori dettagli\nLanterna 8, 52465, Tar, Croatia, Porec, Croazia, 52465, Mappa\nL'hotel lussuoso Valamar Tamaris Villas offre camere lussuose vicino a Porec Old Town, Istrian Assembly Hall e Round Tower. La struttura è posizionata accanto alle spiagge con ciottoli. Maggiori dettagli\nLanterna 6, Porec, Croazia, 52465, Mappa\nL'hotel tranquillo Valamar Tamaris Villas è situato nei pressi delle spiagge. Questo hotel è situato in una zona verde, a 7. Maggiori dettagli\nOffrendo una terrazza solarium, una piscina esterna e una sauna, Casa Palma Hotel è situato nella zona marina di Porec, vicino a Istrian Assembly Hall, Byblos Club Porec e Poreč Main Square. Una basilica e chiese nonché un porto e giardini sono a breve distanza dalla struttura. Maggiori dettagli\nOffrendo stanze confortevoli, Laguna Galijot si trova nella zona di svago di Porec permettendo un facile accesso a Porec Old Town, Marafor Square e Aquacolors Water Park Poreč. Maggiori dettagli\nLanterna 1, Porec, Croazia, 52440, Mappa\nCasa Agava è un hotel a 4 stelle che offre tiro con l'arco, snorkeling e canottaggio nonché una Jacuzzi e una sauna. L'hotel è situato nell'area sul mare e a 6. Maggiori dettagli\nByblos Club Porec (19)\nPorec Old Town (20)\nPorec Marina (20)\nThe Euphrasian Basilica (20)\nPoreč Main Square (20)\nMarafor Square (20)\nAquacolors Water Park Poreč (14)\nHotel Brtonigla, Istria - 16 km


Kataweb.it - Blog - si,sono io » Blog Archive » poco anzi niente\n« Ricordi 2009\npoco anzi niente\ntorno a distanza di mesi tra le mie pagine, ed i miei scritti .\nil tempo passa e poco c’e’ da stare allegri quando si ha un presente di inattivita’. noia. pochezza.\nnon scrivo per il semplice fatto che quando non si vive, si hanno solo pensieri negativi ed errori da riportare.\nsi. sto scrivendo a me, ad una donna che ne ha fatti molti di passi sbagliati, che e’ salita in alto e che poi si e’ trovata in quella che viene definita “la grande crisi”.\nmi ritrovo al mattino , in una camera in penombra cercando di capire cosa devo fare. parole su pensieri scorrono, pensieri su parole che non servono a cambiare lo stato delle cose.\nmi ritrovo a ricordare un passato dove avevo un quotidiano da scrivere tutti i giorni. ed ora non piu’. ora mi aggiro per casa tutti i giorni , esco ma senza meta vera. si e’ interrotto il flusso di dignita’ , di liberta’, di essere .\nnon mi perdono.\nho fatto scelte sbagliate e ne pago a caro prezzo le conseguenze. finiti gli anni in cui me ne strafottevo di tutti e la mia mente viaggiava . ed anche il mio corpo. ora sono qui che dovrei cercare, cerco ma non trovo.\nnon e’ il tempo per essere si vede. il buio prende anche in questa giornata di sole, e poca voglia ho nelle vene.\nnulla, il mio cervello e’ in stand by. il reset al momento non lo trovo.\nsigaretta la prima e acqua.\nScritto giovedì, 25 luglio 2013 alle 09:34 nella categoria Senza categoria. Puoi seguire i commenti a questo post attraverso il feed RSS 2.0. Puoi lasciare un commento, o fare un trackback dal tuo sito.\nUn commento a “poco anzi niente”\nOgni crisi porta in se la possibilita’ del suo superamento, l’importante e’ rimanere vigili, indifferenti alle lagne del proprio ego, pronti a cogliere l’uno nel frammento…\nPostato domenica, 4 agosto 2013 alle 12:11 da uno


La saluto con fraterno affetto nel Signore, ed esprimo i migliori oranti auguri per la Sua salute ed il Suo ministero. Sono riconoscente per l�opportunit� di visitare questa Chiesa Cattedrale di San Giacomo nel cuore dell�antico quartiere Armeno di Gerusalemme, e di incontrare il distinto clero del Patriarcato, insieme con i membri della comunit� Armena della Citt� Santa.\nIl nostro odierno incontro, caratterizzato da una atmosfera di cordialit� ed amicizia, � un ulteriore passo nel cammino verso l�unit� che il Signore desidera per tutti i suoi discepoli. Negli ultimi decenni, abbiamo sperimentato, per grazia di Dio, una significativa crescita nelle relazioni tra la Chiesa Cattolica e la Chiesa Apostolica Armena. Considero una grande benedizione l�essermi incontrato l�anno scorso con il Supremo Patriarca e Catholicos di Tutti gli Armeni Karekin II e con il Catholicos di Cilicia Aram I. La loro visita alla Santa Sede, ed i momenti di preghiera che abbiamo condiviso, ci hanno rafforzati nell�amicizia ed hanno confermato il nostro impegno per la sacra causa della promozione dell�unit� dei Cristiani.\nIn spirito di gratitudine al Signore, desidero anche esprimere il mio apprezzamento per il deciso impegno della Chiesa Apostolica Armena a proseguire nel dialogo teologico fra la Chiesa Cattolica e le Chiese Ortodosse Orientali. Questo dialogo, sostenuto dalla preghiera, ha fatto progressi nel superare il fardello di malintesi passati ed offre molte promesse per il futuro. Un particolare segno di speranza � il recente documento sulla natura e la missione della Chiesa preparato dalla Commissione Mista e presentato alle Chiese per essere studiato e valutato. Affidiamo insieme il lavoro della Commissione Mista ancora una volta allo Spirito di sapienza e verit�, perch� possa portare frutti abbondanti per la crescita dell�unit� dei Cristiani e far progredire l�espansione del Vangelo fra gli uomini e le donne del nostro tempo.\nFin dai primi secoli cristiani, la comunit� Armena di Gerusalemme ha avuto una illustre storia, segnata come non ultima cosa da uno straordinario fiorire di vita e cultura monastica collegate con i luoghi santi e con le tradizioni liturgiche che si sono sviluppate attorno ad essi. Questa venerabile Chiesa cattedrale, assieme al Patriarcato e alle varie istituzioni educative e culturali ad esso connesse, rendono testimonianza di questa lunga e distinta storia. Prego affinch� la vostra comunit� possa costantemente trarre nuova vita da queste ricche tradizioni ed essere confermata nella fedele testimonianza a Ges� Cristo e alla potenza della sua risurrezione (cfr Fil 3,10) in questa Citt� Santa. Ugualmente assicuro le famiglie presenti, e in particolare i bambini e i giovani, di uno speciale ricordo nelle mie preghiere. Cari amici, a mia volta chiedo a voi di pregare con me affinch� tutti i Cristiani della Terra Santa lavorino assieme con generosit� e zelo annunciando il Vangelo della nostra riconciliazione in Cristo, e l�avvento del suo Regno di santit�, di giustizia e di pace.\nBeatitudine, La ringrazio una volta ancora per il gentile benvenuto e cordialmente invoco le pi� ricche benedizioni di Dio su di Lei e su tutto il clero e i fedeli della Chiesa Apostolica Armena nella Terra Santa. Che la gioia e la pace del Cristo Risorto siano sempre con voi.


Europa Archivi - Sviluppo Economico\nDall’esercito dei selfie all’esercito dei neet\nDall’esercito dei selfie all’esercito dei neet il passo è davvero breve. Il fenomeno sociale in cui l’Italia può vantare il suo primato a livello Europeo non è benaugurante per un Paese che, oltre a essere vecchio, risulta essere anche inattivo dal punto di vista giovanile. Si comincia a parlare di Neet in Inghilterra alla fine […]\nLavoro digitale: i robot non soppianteranno l’uomo, ma creeranno più occupazione\n«La digitalizzazione non ridurrà i posti di lavoro, li trasformerà, e anzi, porterà più occupazione di quella di oggi». Ne è convinto Jonas Prising, Global Chairman & Ceo di ManpowerGroup, uno dei leader mondiali delle agenzie per il lavoro. E smentisce quelle visioni apocalittiche di un futuro solo robot e senza più uomini al lavoro. […]\nSondaggi europee, Lega al 33,2%. Vantaggio M5S sul Pd, ecco tutti i partiti\nROMA – Se le Elezioni Europee si tenessero oggi, tra chi esprime una preferenza la Lega è il primo partito in Italia, con il 33,2% seguito da M5S con il 22,3%. Segue il Pd, che si attesta nelle intenzioni di voto al 21,1%, poi Forza Italia, che secondo il sondaggio arriverebbe al 9,9%, Fdi al […]


Umanesimo e realtà virtuale, UniUrb vince progetto MUR da 100.000 euro | il Ducato\nUmanesimo e realtà virtuale, UniUrb vince progetto MUR da 100.000 euro\nARGOMENTI:miurpalazzo ducaleuniversità di urbino\nURBINO, 06 SET – Il Ministero dell’università e della ricerca finanzia un progetto del centro di Studi Urbino e la Prospettiva dell’Università degli Studi di Urbino Carlo Bo assieme all’Ente Olivieri – Biblioteca e Musei Oliveriani di Pesaro e l’Istituto Tecnico Industriale Statale ITIS Enrico Mattei di Urbino.\nIl progetto da centomila euro, “Alle radici dell’umanesimo scientifico: valorizzazione con le tecnologie della realtà virtuale e aumentata delle macchine rappresentate nelle formelle del Palazzo Ducale di Urbino” intende unire tecnologia e cultura, considerando l’applicazione di strumenti informatici per la realtà virtuale, la realizzazione di un portale web, di una APP e la produzione di un libretto divulgativo dedicato a far conoscere in modo approfondito le 72 formelle rappresentanti macchine da guerra e di pace che un tempo erano poste al basamento del cortile del Palazzo Ducale ed oggi posizionate nei locali della allora Biblioteca Ducale.\nAttraverso questi strumenti informatici sarà possibile non solo avere un rendering 3D delle macchine rappresentate sui bassorilievi ma interrogarle sui particolari e metterle in funzione virtualmente. Già da anni il Centro Urbino e la Prospettiva, capofila del progetto, si occupa di studiare l’umanesimo scientifico urbinate e le implicazioni che quest’ultimo ha avuto nei secoli a seguire valorizzandone il patrimonio umano, scientifico e culturale. Questo progetto dedicato alle formelle intende, attraverso il loro studio, esplorare le radici dell’umanesimo scientifico, come appunto recita il titolo del progetto. Il progetto si è classificato ai primissimi posti tra tutti i progetti italiani presentati ed ha ottenuto il massimo finanziamento disponibile.\n“Il finanziamento rappresenta un importante riconoscimento per l’Università di Urbino, l’Ente Olivieri e l’Istituto tecnico industriale statale Enrico Mattei di Urbino” riferisce il professor Laerte Sorini, responsabile scientifico del progetto, “e uno stimolo per comprendere le radici dell’umanesimo scientifico urbinate che ha rappresentato un punto di partenza per quella rivoluzione scientifica che sarebbe arrivata successivamente”.\nIl professor Laerte Sorni ha pubblicamente ringraziato il professore Pierluigi Graziani dell’Università di Urbino, Davide Pietrini del centro Urbino e la prospettiva, Brunella Paolini dell’Ente Olivieri e Francesco Serafini dell’Itis Mattei.\nUniversità di Urbino, mercoledì 19 l’inaugurazione delle nuove segreterie studenti\nAggressione omofoba a studente Uniurb, iniziato il processo a Pesaro\nA casa di Carlo Bo tra bastoni, sigari e libri. A Urbino la mostra per i vent’anni dalla sua morte\nUniversità e scuola: Matematica e le altre discipline. Il 13 dicembre l’Architettura


Governo, passi avanti M5S-Lega. Petitti perplessa da PD; Rufo Spina: FI partito serio • newsrimini.it\ngio 10 mag 2018 18:05 ~ ultimo agg. 19:11\nDopo il via libera di Berlusconi al tentativo di Governo Lega – Movimento 5 Stelle, Salvini e Di Maio hanno chiesto al Capo dello Stato Mattarella qualche giorno di tempo per verificarne la fattibilità. Il leader del Carroccio si dice ottimista e parla di “sostanziali passi avanti“. “Sono momenti importanti non per il Movimento ma per la Repubblica italiana ” commenta invece Di Maio in un video su Facebook dove ammette che il tempo è comunque poco e c’è l’obbligo di “fare un lavoro fatto bene” per “ottenere risultati significativi per i cittadini“.\nDalle indiscrezioni emerse, sembra che il nome del nuovo premier non sarà però quello di nessuno dei due leader. Si parla di una figura di alto profilo che potrebbe essere indifferentemente un tecnico od un politico. L’identikit c’è, ma il nome non sarà svelato prima dell”intesa sui punti del programma che M5S e Lega stanno definendo.\nAlla finestra resta il PD. Sulla sua pagina facebook l’assessore regionale Emma Petitti, membro della direzione nazionale Pd, non lesina critiche ai colleghi di partito. “Ciò che mi lascia perplessa (per non dire basìta) – scrive – è l’atteggiamento che c’è in parte del gruppo dirigente del Partito Democratico, volto a gridare “al lupo al lupo” per il varo del nuovo esecutivo, agitando lo spauracchio del governo di destra, populista, antieuropeista, degli irresponsabili e chi più ne ha più ne metta, senza però avere l’onestà intellettuale di ammettere che questa è la soluzione voluta anche da una parte rilevante del Pd”.\nLa Petitti ammette di non aver mai visto addirittura “esultare per la formazione di un Governo ‘avversario’” forse “con la speranza di vedere le cose andare male (è facile che succeda) e dire “l’avevo detto!””.\n“Non ci si rende conto”, rileva l’assessore regionale, “che se le cose andranno male (come qualcuno auspica) ad andare male sarà l’Italia, che per me viene prima dell’interesse di bottega di una forza politica. Si è scelto di aspettare il cadavere sulla riva del fiume ma il pericolo è che quel cadavere sia quello del Paese”.\nLa Petitti ribadisce poi che il Pd avrebbe dovuto dare la propria disponibilità ad una verifica con il M5S anche se “probabilmente non c’erano le condizioni per un accordo” perché “avrebbe reso più difficile questo epilogo e si sarebbe comunque provato a far emergere da un lato le contraddizioni (tante) grilline, dall’altro quella che definirei la parte più di sinistra del movimento stesso”.\nSecondo la Petitti il PD è ancora fermo al 5 marzo e ha “deliberatamente deciso di non analizzare le cause del risultato disastroso per correggere profondamente la ”linea” e provare a ripartire, ma ci si è presentati senza nessun seppur minimo segno di autocritica, ma con battute e addirittura una certa aria di sfida verso gli italiani che non avevano capito nulla del nostro operato e della nostra proposta”.\n“Sarà utile – conclude – che, oltre a godersi (coi pop corn ha detto qualcuno) lo ‘spettacolo’ offerto dal nuovo esecutivo, ci si organizzi per ricostruire un partito che sia percepito per davvero come un’alternativa valida ma soprattutto credibile; che si rivolga a chi è rimasto indietro e non ce la fa più, a chi deve essere incluso nella società secondo i metri di misura valoriali che ci hanno sempre guidato: giustizia sociale e solidarietà. Evitiamo di perdere tempo a mangiare i pop corn, perché possono anche andare di traverso, rimanerci indigesti e farci molto ma molto male”.\nSul via libera arrivato invece da Forza Italia con l’intenzione però di non votare la fiducia arriva il commento del coordinatore comunale del partito a Rimini, Carlo Rufo Spina. “Forza Italia – scrive – si conferma l’unico partito serio e responsabile del panorama politico, non mette intralci ma non sosterrà mai governi improbabili e distanti dai nostri valori del liberalismo conservatore“. E ancora. “Voteremo, come sempre, i provvedimenti che riterremo giusto appoggiare, ma dall’opposizione. Certo che da oggi – conclude – chi rappresenta il centro-destra, almeno a livello nazionale, siamo solo noi”.


bikini summer orange chiaro due pezzi\nBikini summer orange chiaro due pezzi a tanga con mutanda leggermente a vita alta. Top a forma di conchiglia e lacci da incrociare dietro le spalle e intorno alla vita per stringerlo. Veramente non passerai inosservata.\nil bikini è arancio chiaro.\nil colore tende al corallo


Huawei Watch, arrivano le varianti ideate per le donne /** SCRIPT MONEYTIZER BANNER GDPR *//\nKeyforWeb.it › Home › News › Huawei Watch, arrivano le varianti ideate per le donne\nHuawei Watch, arrivano le varianti ideate per le donne\nHuawei, sempre attivissima nel mondo smartphone (e non solo), si appresta a lanciare una variante femminile del proprio Huawei Watch.\nNonostante tale tipologia di device sia più appropriata ad un polso maschile, Huawei ha voluto ridisegnare le linee dei propri prodotti al fine di avvicinare anche le donne verso questo campo. Ecco, dunque, spuntare alcuni Huawei Watch dall’estetica fine e particolarmente lussuosa, ideati e studiati per renderli maggiormente appetibili anche per le donne.\nSul sito Huawei (e nell’immagine sopra), è possibile ammirare l’estrema eleganza posta in ogni dettaglio, dai cinturini più snelli ad alcuni esemplari realizzati con gli Swarosvki. In quest’ultimo caso, come prevedibile, il prezzo si alza notevolmente. Almeno per il momento, però, non esistono varianti economiche di questi prodotti, tutti allineati intorno ai 500€-600€.\nInoltre, tali modelli riservati alle donne non sono reperibili sul sito ufficiale, ne tanto meno in altri store. Quindi bisognerà attendere notizie in merito, in particolar modo per quanto riguarda la commercializzazione anche se, difficilmente, verranno acquistati in quantità a causa del prezzo sicuramente poco vantaggioso.\nAsus Zenwatch 2 sbarca in Italia con Marshmallow a soli 179 euro


Correzione murales del carrozziere\nLaCuraDellAuto - Detailing Forum » Detailing » L'arte della lucidatura: claying, correzione e polishing. » Correzione murales del carrozziere\n1 Correzione murales del carrozziere Mar 30 Giu 2015 - 19:03\nCiao a tutti ragazzi.chiedo gentilmente un consiglio per correggere un murales sulla fiancata di una bmw serie 3 nera metallizata. So che la cosa migliore sarebbe postare le foto ma ho provato in tutti i modi e in tutte le angolazioni sotto il sole ma non riesco a cogliere il difetto.\nPer darvi un'idea è la stessa cosa che era successo un paio di mesi fa ad un'altro utente del forum su una Audi A5, anche se in modo minore.\nTutto questo è successo dopo averla portata in carrozzeria per far rifare una portiera e il fianchetto.\nPosseggo il kit menzerna, dite che va bene questo o è meglio acquistare qualcosa d'altro???\nAccetto consigli su tutto,anche su come fare le foto.\n2 Re: Correzione murales del carrozziere Mar 30 Giu 2015 - 19:22\nSe si tratta di ologrammi (intuisco) io un problema simile l'ho risolto facilmente con ERO, Scholl S30 e tampone LCDA Arancio\n3 Re: Correzione murales del carrozziere Mar 30 Giu 2015 - 19:57\nAppunto, sono ologrammi , mi ricordo l'a5 di qualche mese fa bella ologrammata!!!\n4 Re: Correzione murales del carrozziere Mar 30 Giu 2015 - 20:10\nSi si sono ologrammi, mi sono dimenticato di scriverlo, chiedo perdono...\nNel mio caso dite che 2500 e tampone arancio, più una passata di 4000 sempre con tampone arancio, dite che va bene? stavo pensando anche all'acquisto di P1 che se ne parla bene, ma se vanno bene già le cose che ho a casa, mi limito a comprare solamente un nuovo tampone.\n5 Re: Correzione murales del carrozziere Mar 30 Giu 2015 - 20:30\nQuello che hai va più che bene!\n6 Re: Correzione murales del carrozziere Mer 1 Lug 2015 - 19:44\nConfermo, con quel ciclo lo risolvi sicuro e senza difficoltà\n7 Re: Correzione murales del carrozziere Mer 1 Lug 2015 - 20:28\nOttimo...allora prendo solamente un nuovo tampone arancio, o consigliate qualcosa di diverso?\n8 Re: Correzione murales del carrozziere Ven 3 Lug 2015 - 19:30


migliorare la funzione articolare usando Hondrocream? È davvero così facile? Gli utenti segnalano i loro trionfi\n5/10 6:38 Tjark Velez\nSe crediamo ai numerosi rapporti attualmente in corso di pubblicazione, molti appassionati saranno in grado di alleviare i dolori articolari usando Hondrocream. Non sorprende quindi che Hondrocream conosciuto.\nPotresti aver già notato che molti siti Web hanno Hondrocream commenti su Hondrocream. Quindi il prodotto aiuta davvero ad alleviare i dolori articolari? Tu nell'articolo del blog.\nCon i suoi principi attivi non nocivi, Hondrocream a meccanismi d'azione testati. 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Meratol una prova. Il fatto che i farmaci siano soggetti a diverse fluttuazioni dovrebbe essere ovvio per tutti, in modo che i risultati possano essere più deboli o più forti.\nSe appartieni a uno di questi gruppi di utenti, non Hondrocream usare Hondrocream\nNel caso in cui tu abbia meno di 18 anni, non dovrai usare Hondrocream. Hai dei dubbi sul fatto che saresti abbastanza paziente da usare questo prodotto in modo affidabile? Se questo è il tuo caso, è meglio lasciarlo. Nel complesso, non sei assolutamente propenso a sacrificare i mezzi monetari per il tuo benessere, anche perché sei meno interessato a migliorare la funzione congiunta? In queste circostanze, puoi anche lasciarlo a quello.\nNel caso in cui questi punti non ti riguardino, devi solo chiarire quanto segue: Non appena troverai la fiducia in te stesso per declamare |, "D'ora in poi migliorerò la flessibilità e la libertà dal dolore e sarei disposto a dare tutto!" Non andare avanti e infine affrontare il tuo progetto.\nSono fermamente convinto che Hondrocream possa essere di grande aiuto per te!\nHondrocream una cooperazione tra Hondrocream e il nostro corpo umano, che sostanzialmente esclude le circostanze di accompagnamento.\nPotrebbe essere possibile che il rimedio appaia inizialmente in qualche modo? Ci vuole un po 'di tempo affinché l'effetto sia davvero piacevole?\nPraticamente si. Comprensibilmente, devi abituarti e il disagio può essere un effetto collaterale per primo.\nIl feedback dei consumatori di Hondrocream mostra anche che non si sospettano effetti collaterali.\nIn questo modo, Hondrocream può essere Hondrocream modo mirato\nUn teorema di facile comprensione conta qui: per questo, le informazioni fornite dalla società sono senza eccezione decisive.\nNon preoccuparti, non prestare attenzione a nient'altro sull'assunzione e ricorda il tempo che è appropriato ai tuoi occhi per provare Hondrocream. 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Uno a Uno project » Andrea Barbagallo - artista visivo, classe '94, vive e lavora a Milano\nIl lavoro di Andrea Barbagallo è frutto di una coerente ricerca che tratta temi e problematiche alla base della scena artistica contemporanea: le relazioni che l’artefatto intesse col pubblico, la sua conservazione e dissoluzione e -non ultimo- il ruolo che l’artista occupa all’interno di tali dinamiche.\nAttraverso l’utilizzo di materiali deperibili e tecnologie quali plotter, 3d printer e software open source, le opere accolgono e suggeriscono continui rimandi alla caducità della vita, alla precarietà tipica dell’epoca postmoderna e al dualismo natura e tecnologia.\nTali temi sono però declinati in modi mai banali, con una certa ricercatezza ideologica, sintomo e specchio di una voracità intellettuale che trova in Barbagallo un ottimo esempio.\nConsunzione e commistione sono verbi molto cari all’artista e vengono evocati continuamente nelle sue opere destinate alla precarietà del tempo, al mutare in favore del cambiamento, sia questo fisico o concettuale.\nCulto, scienza, biologia, sono solo alcuni dei soggetti declinati nei lavori di Barbagallo e che vengono consegnati alla visione dello spettatore, invitato quest’ultimo, a coglierne nel momento dell’ osservazione, almeno le tracce.\nAndrea Barbagallo, classe ’94, nasce a Roma.


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