Kudosmalli biofilmi-isäntä vuorovaikutuksen tutkimiseen. Laura Ahervo. Ohjaajat: FM Annamari Paino ja FT Riikka Ihalin BIOKEMIA - PDF\nDownload "Kudosmalli biofilmi-isäntä vuorovaikutuksen tutkimiseen. Laura Ahervo. Ohjaajat: FM Annamari Paino ja FT Riikka Ihalin BIOKEMIA"\n1 Kudosmalli biofilmi-isäntä vuorovaikutuksen tutkimiseen Laura Ahervo Ohjaajat: FM Annamari Paino ja FT Riikka Ihalin BIOKEMIA Yksi tärkeimmistä aggressiivisen parodontiitin (hampaan kiinnityskudosten tulehdus) aiheuttajista on gram-negatiivinen Aggregatibacter actinomycetemcomitans, joka muodostaessaan biofilmin erittää ympärilleen biopolymeereistä koostuvan soluväliaineen. Biopolymeerit sekä suojaavat bakteereita että auttavat niitä kiinnittymään erilaisiin pintamateriaaleihin. Biofilmien tiedetään olevan vastustuskykyisiä isännän immuunivasteelle ja heikentävän merkittävästi antibioottien vaikutusta infektioissa. Tässä työssä kehitettiin kudosmallia, jonka avulla biofilmi-isäntä-vuorovaikusta voitaisiin paremmin tarkastella. Ensisijaisena tavoitteena oli selvittää tuottavatko kudosmallin solut interleukiini (IL)-1β:a, parodontiitin keskeistä tulehduksen välittäjäainetta, kun niitä stimuloidaan A. actinomycetemcomitans biofilmeillä. Kudosmalli toteutettiin kerrosviljelmänä, jossa alin kerros koostui ihmisen ikenen fibroblasti (HGF) -kollageeni matriksista ja toinen kerros ikenen keratinosyyteistä (HGK) tai ihon keratinosyyteistä (HaCaT). Kaikki käytetyt solut olivat kuolemattomaksi tehdyistä solulinjoista. Neste-kaasu rajapinnassa kasvaneen viljelmän päälle asetettiin membraani, jonka pinnalle oli kasvatettu A. actinomycetemcomitans biofilmi. Kerrosviljelmiä inkuboitiin membraanin kanssa 0 h ja 8 h. Mediumeista tutkittiin IL-1β:n erittymistä ELISA:n avulla. Eri solulinjojen sekä bakteerien vaikutusta kudosmalliin tarkasteltiin hematoksyliini-eosiini värjättyjen parafiinileikkeiden avulla. Lisäksi IL-1β:n lokalisoimiseksi parafiinileikkeille tehtiin immunohistokemiallinen värjäys. Saatujen tulosten perusteella kudosmallin solut tuottivat IL-1β:a. Ikenen keratinosyyttien havaittiin tuottavan ihon keratinosyyttejä suurempia IL-1 β pitoisuuksia. Lisäksi ELISA tulosten ja immunohistokemiallisten värjäysten perusteella A. actinomycetemcomitans näyttäisi sitovan IL-1β:a, mikä on linjassa aikaisemmin saamiemme tulosten kanssa. Kudosmalli soveltuu IL- 1β:n ja biofilmin välisen vuorovaikutuksen tarkempaan tutkimiseen. Asiasanat: biofilmi, interleukiini-1β, kudosmalli, parodontiitti\n2 Bakteerin ulkokalvoproteiini HofQ:n DNA:ta sitovan osan rakenteen määritys Mari Jääskeläinen Ohjaajat: FM Heidi Tuominen, PhD Michael Tarry, assistant professor Martin Högbom, FT Riikka Ihalin BIOKEMIA Gram-negatiivinen Pasteurellaceae-heimoon kuuluva Aggregatibacter actinomycetemcomitans on luonnostaan kompetentti: se kykenee ottamaan solunulkoista DNA:ta soluun. Kompetenssin mekanismia ei tunneta tarkasti, mutta sen ajatellaan koostuvan erillisestä DNA:n sitoutumisesta ja sitä seuraavasta DNA:n otosta solun sisään. Pasteurellaceae-heimon ComE-sekretiinin on todettu muodostavan bakteerin ulkokalvolle kanavan, jonka kautta DNA päätyy soluun. A. actinomycetemcomitansin HofQ, joka on ComE:n homologi toimii luultavasti samankaltaisesti. Alustavat tutkimustuloksemme osoittavat HofQ:n N- terminaalisen osan sitovan DNA:ta, joten HofQ on todennäköisesti osallisena kompetenssissa. Työn tarkoitus oli kiteyttää HofQ:n N-terminaalinen osa ja ratkaista sen rakenne. HofQ:n N-terminaalinen osa (aminohapot ) kloonattiin pet-15b-vektoriin ja ekspressoitiin Escherichia colin BL21-CodonPlus(DE3)-RIL-kannassa. Proteiini puhdistettiin nikkeliaffiniteettikromatografialla, histidiinihäntä poistettiin trombiinidigestiolla ja puhdistus viimeisteltiin geelisuodatuspylväässä. Proteiini kiteytettiin 2 M natriumformaatissa ja 0,1 M natriumasetaatissa (ph 4,6) istuva pisara -menetelmällä +20 ºC:ssa. Kiteistä kerättiin natiivi- ja selenometioniinidatat ESRF:ssä (European Synchrotron Radiation Facility, Grenoble, Ranska). Vaihekulmat selvitettiin MAD-menetelmällä ja lopullisen rakenteen vaihekulmat ratkaistiin molekyylikorvausmenetelmällä. Lisäksi rakenteen ratkaisemisessa käytettiin Auto-Rickshaw-, Refmac5- ja Coot-ohjelmia. HofQ:n tertiäärirakenteen huomattiin osittain muistuttavan E. colin sekretiinien ESCC:n ja GspD:n rakennetta, mutta proteiinin N-terminaalinen osa vaikuttaa olevan ainutlaatuinen. Tällä osalla saattaa olla funktionaalinen merkitys ja se saattaa myös sisältää proteiinin DNA:ta sitovan domeenin. Asiasanat: Aggregatibacter actinomycetemcomitans, HofQ, kompetenssi, röntgensädekristallografia\n3 Hiiren EphB6 -reseptorin tuotto ja funktionaalinen analyysi Saara Korpela Ohjaajat: FT Juha-Pekka Himanen, FT Sari Paavilainen BIOKEMIA Tyrosiinikinaasireseptoreiden suurin alaluokka on Eph -reseptorit, jotka sitoutuvat ekstrasellulaarisessa tilassa toiseen membraaniproteiiniperheeseen, efriineihin. Reseptorit jaetaan ligandispesifisyyden perusteella A- sekä B - luokkiin. Eph -reseptorit ekspressoituvat laajasti eri kudoksissa ja eläinlajeissa. Ne osallistuvat muun muassa solujen erilaistumiseen, liikkumiseen, tukirangan muotoutumiseen sekä yksilönkehityksen säätelyyn. Soluissa Eph -reseptorien aktiivisuus kohdentuu esimerkiksi Cdc42, Ras, Rac ja Rho -proteiineihin. EphB6 -reseptori ekspressoituu merkittävästi aivoissa ja kateenkorvassa, joista jälkimmäisessä sen on osoitettu olevan yhteydessä T -lymfosyyttien erikoistumisprosessiin. EphB6 -reseptorilta on havaittu puuttuvan kinaasiaktiivisuus, minkä takia se tarvinnee koreseptorin. EphB6 -reseptorin ligandia sitova domeeni subkloonattiin Escherichia coli sekä Baculovirus -tuottovektoreihin. Liukoinen proteiini puhdistettiin affiniteettipuhdistuksella fuusioproteiinin avulla ja edelleen vahvalla anioninvaihtajalla. Myös efriinejä ekspressoitiin Baculovirus -systeemissä. Ligandi efriini-b1leimattiin europium-n1-kelaatilla. EphB6 -reseptorin ja ligandien välisen sitoutumisen karakterisoimiseksi pyrittiin kehittämään mikrotiitterilevyillä toimiva määritysmenetelmä. Testattiin erilaisia mikrotiitterilevyjä ja blokkausmateriaaleja. Kokeiltiin myös HRP -leimattuun vasta-aineiseen perustuvaa menetelmää. Karakterisoinnin tueksi tehtiin komparatiivista mallinnusta käyttäen teoreettisia rakennemalleja EphB6 - proteiinista. EphB6 -proteiinia kyettiin tuottamaan E. colissa liukoisena sekä inkluusiobodeina. Liukoisen proteiinin ekspressio Baculovirus -infektoiduissa hyönteissoluissa osoittautui optimoinnista huolimatta alhaisemmaksi kuin liukoisen proteiinin osuus E.Colissa. Ligandit, efriinit, ekspressoituivat hyvin Baculovirus -infektoiduissa hyönteissoluissa. Suolakonsentraatiolla, entsyymien alkuperällä ja proteiinipitoisuudella havaittiin olevan merkittävä vaikutus EphB6 -proteiinin saostumiseen digestoitaessa pois fuusioproteiinia. Saostumista ilmeni myös dialyysissä, joka korvattiin geelisuodatuksella. Sopivan mikrotiitterilevyjen blokkausmateriaalin optimoiminen sitoutumismäärityksiä varten jatkuu edelleen. Tarkoituksena on kehittää uusi, tarkempi, pienillä proteiinimäärillä toimiva sitoutumismääritysmenetelmä. Avainsanat: Eph, efriini, tyrosiinikinaasireseptori, europium, koreseptori\n4 VEGFR-3 -signalointi verisuonten uudismuodostuksessa Krista Heinolainen Ohjaajat: LT Tuomas Tammela ja akatemiaprofessori Kari Alitalo BIOKEMIA Verisuonten uudismuodostusta eli angiogeneesiä tapahtuu normaalisti sikiönkehityksen ja kuukautiskierron aikana sekä haavojen parantuessa, mutta angiogeneesillä on myös tärkeä merkitys syöpäkasvainten kasvussa ja kehityksessä. Tyrosiinikinaasireseptori VEGFR-3 (verisuonikasvutekijäreseptori-3) ilmenee spesifisesti ainoastaan syöpäkasvaimen verisuonten endoteelisoluissa, joiden kasvua sen signaalit lisäävät. VEGFR-3:n ilmenemistä verisuoniendoteelissä säätelee Notch-signalointireitti, ja VEGFR-3 voi muodostaa heterodimeerejä lähisukulaisensa VEGFR-2:n kanssa ligandiensa VEGF-C:n tai VEGF-D:n sitoutuessa. VEGFR-3 signalointi verisuonissa tunnetaan huonosti. Tämän tutkimustyön tarkoituksena on valottaa VEGFR-3:n signaaleja, interaktiokumppaneita ja geneettisiä säätelymekanismeja verisuoniendoteelissä. Tutkimuksessa käytetään ihmisen endoteelisoluja, joista VEGFR-3:n signalointi estetään spesifisillä sirna oligonukleotideilla tai monoklonaalisilla vastaaineilla. Muutokset solujen (fosfo)proteomissa analysoidaan immunopresipitaatiolla, Western blot-menetelmällä sekä monikohdebloteilla. Heilahdukset geeniekspressiossa detektoidaan kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:lla. In vitro kokeiden lisäksi käytämme angiogeneesin in vivo tutkimukseen vastasyntyneiden hiirten verkkokalvomallia ja syngeenisiä kasvainmalleja. Käytössämme on hiirikanta, jossavegfr3-geeni voidaan poistaa Cre-rekombinaasin avulla verisuoniendoteelissä haluttuna ajankohtana antamalla hiirelle tamoksifeenia. Verisuoniston morfologiset muutokset analysoidaan immunofluoresenssin avulla. Vegfr3:n poisto hiiressä johti liialliseen verisuonten kasvuun, jonka syyksi osoittautui vähentynyt Notch-signalointi endoteelisoluissa. Paradoksaalisesti VEGFR-3:n estäminen vasta-aineilla vähensi angiogeneesiä ja hidasti kokeellisten kasvainten kasvua. Yllättäen kumpikaan estämismenetelmä ei vaikuttanut VEGFR-2:n määrään tai aktiivisuuteen. Parhaillaan selvitän VEGFR-3:n alavirtasignaalien ja Notch-signaloinnin välistä yhteyttä. Alustavien tulosteni mukaan VEGFR-3 kykenee aktivoimaan Notch-reseptorin aikaisemmin tuntemattomalla mekanismilla. VEGFR-3:n toiminnan tunteminen avaa uusia näkymiä syöpälääkkeiden kehitykselle. Asiasanat: VEGFR-3, angiogeneesi, syöpä, Notch, VEGFR-2\n5 Proteomiikka-analyysi echovirus 1:n ja α2β1 integriinin vuorovaikutuksesta Johannes Merilahti Ohjaajat: FT Pekka Rappu, FM Johanna Jokinen ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Integriinit ovat solukalvolla olevia adheesioreseptoriproteiineja, jotka solukalvon läpäisevinä yhdistävät solun tukirangan soluväliaineen proteiineihin. Integriinit osallistuvat solusignalointiin välittämällä viestejä sisään ja ulos soluista. Integriinejä on 24 erilaista ja ne ovat α- ja β- alayksiköistä koostuvia heterodimeerejä. Echovirus 1 (EV1) käyttää α2β1 integriinejä reseptorinaan päästäkseen solun sisälle. Erikoistyön tarkoituksena oli löytää uusia EV1:n ja α2β1 integriinin vuorovaikutukseen liittyviä signalointikompleksin proteiineja. Työssä Saos α2 - soluja kasvatettiin stabiileilla isotoopeilla leimattuja aminohappoja sisältävässä kasvatusmediumissa (SILAC). EV1 kiinnitettiin magneettipartikkeleihin ja annettiin tarttua Saos α2 -solujen α2β1 integriineihin ja klusteroida ne. Tämän jälkeen signalointikompleksin komponentit kiinnitettiin toisiinsa kovalenttisesti primääristen amiinien kautta DTBP-linkkimolekyyleillä (dimetyyli-3,3'- ditiolibispropionimidaatti) ja proteiinikompleksi eristettiin soluista magneetilla. Proteiinikompleksin proteiinit irrotettiin toisistaan ja eri proteiinit tunnistettiin ja kvantitoitiin LC/MS/MS-ajolla. Konfokaalimikroskopialla havaittiin, että magneettipartikkeleihin kiinnitetyt echovirukset kiinnittyvät solun α2β1 integriineihin ja saavat ne klusteroitumaan. Western-analyyseillä EV1-magneettipartikkelien todettiin kiinnittyvän spesifisesti α2β1 integriineihin, ja signalointikompleksista tunnistettiin proteiineja, joiden tiedetään aktivoituvan EV1:n sitoutuessa α2β1 integriineihin. Alustavissa LC/MS/MS-analyyseissä löydettiin muutamia uusia ehdokkaita EV1:n ja α2β1 integriinien vuorovaikutuskumppaneiksi. Tuloksien perusteella voidaan jo todeta menetelmän toimivan hyvin signalointikompleksien komponenttien etsimisessä. Tätä menetelmää voidaan helposti käyttää myös muiden virus reseptori -vuorovaikutuksien tutkimiseen. Asiasanat: proteomiikka, SILAC, α2β1 integriini, echovirus 1\n6 Kindliinin ja taliinin merkitys echovirus 1:den ja α 2 β 1 -integriinin vuorovaikutuksessa Pirjo Tissari Ohjaajat: FM Johanna Jokinen, FM Maria Salmela ja prof. Jyrki Heino BIOKEMIA Integriiniperhe koostuu 24:stä heterodimeeristä, jotka muodostuvat 18 α- ja 8 β-alayksiköstä, ja ne ovat tärkeitä solukalvon reseptoreita. Integriinit ovat perinteisen käsityksen mukaan inaktiivisessa tilassa ollessaan taipuneessa muodossa. Tällöin ligandin sitoutuminen on heikkoa, mutta tuoreet tutkimustulokset osoittavat, että α 2 β 1 -integriini sitoo inaktiivisessa muodossa echovirus 1:den (EV1). EV1 on ihmisen patogeeni, joka on Picornavirusperheeseen kuuluva RNA-virus. EV1 aiheuttaa aivokalvontulehdusta, sydäntulehdusta, ihottumaa, sekä lieviä hengitys- ja ruuansulatuselimistön sairauksia. Taliini on sytoskeletaalinen proteiini, jonka N-terminaalisessa päässä on FERM-alayksikkö (4,1/Ezrin/Radixin/Moesin). Kindliineissä on myös FERM-alayksikkö, joka on C-terminaalisessa päässä. On todettu, että kindliinin ja taliinin FERM-alayksiköt sitoutuvat β1-integriinin häntään ja ne osallistuvat β 1 -integriinien aktivointiin. Kindliinin ja taliinin merkitystä EV1:den kiinnittymiseen α 2 β 1 -integriiniin ja viruksen internalisaatioon soluun tutkittiin hiljentämällä geenit RNAinterferenssillä ja yliekspressoimalla kindliiniä ihmisen osteosarkoomasoluissa (Saos 2) ja keratinosyyteissä (HaCaT). Kindliinin ja taliinin geenien hiljentyminen todettiin mrna-tasolla kvantitatiivisella reaaliaikaisella PCR:llä ja proteiinitasolla western blottauksella. Taliinin ja kindliinin sijainti soluissa määritettiin konfokaalimikroskopialla ilman virusta ja virustartutuksen jälkeen, ja taliinin vaikutusta EV1:den kiinnittymiseen solupinnan α 2 β 1 -integriiniin määritettiin adheesiokokeella. Kindliinin ja taliinin vaikutusta EV1:den kykyyn infektoida kohdesolu tutkittiin määrittämällä infektioprosentit soluista, joihin oli tehty sirna-transfektio. Saos α2-solut ilmentävät normaalisti vain vähän kindliiniä ja tutkimuksissa havaittiin, että virus tarttui heikommin soluihin, joissa kindliiniä yliekspressoitiin. Adheesiokokeessa saatujen tulosten perusteella EV1 tarttuu paremmin soluihin, joissa on vähemmän taliinia ja infektiokokeissa todettiin että solut, joihin on transfektoitu taliini-sirna, infektoituvat paremmin kuin käsittelemättömät solut. Kaikki tulokset tukevat havaintoa, että echovirus 1 suosii soluja, joissa on vähemmän integriinejä aktivoivia proteiineja. Asiasanat: kindliini, taliini, echovirus 1, α 2 β 1 -integriini\n7 Akt kinaasin eri isomuodot integriinien säätelyssä Reetta Virtakoivu Ohjaaja: Prof. Johanna Ivaska BIOKEMIA Integriinit ovat α- ja β-alayksiköstä koostuvia solun pinnan heterodimeerisiä tarttumisreseptoreita. Ne välittävät solun adheesiota soluväliaineeseen ja toisiin soluihin. Niillä on tärkeä rooli solusignaloinnissa ja ne osallistuvat muun muassa solun kasvun, erilaistumisen ja liikkumisen säätelyyn. Akt (proteiini kinaasi B, PKB) kinaasit ovat seriini/treoniini proteiinikinaaseja, jotka osallistuvat solun selviytymisen, apoptoosin, solun kasvun ja proliferaation säätelyyn. Akt-kinaasiperheeseen kuuluu kolme tunnettua isomuotoa: Akt1 (PKBα), Akt2 (PKBβ) ja Akt3 (PKBγ). Ne ovat yli 80 %:sti homologisia keskenään ja kaikkien isomuotojen aktivaatiomekanismin uskotaan olevan sama. Ne aktivoituvat fosforylaation seurauksena. Akt1 ja Akt2 kinaaseja on tutkittu paljon, mutta sen sijaan Akt3 kinaasin rooli on vielä epäselvä. Ryhmässämme löydettiin geenien vaimentamiseen perustuvan high throughput seulonnan avulla Akt1 isomuodon hiljentämisen lisäävän β 1 -integriinin aktiivisuutta eturauhassyöpäsoluissa, kun taas Akt3 isomuodon hiljentämisen vähentävän sitä. Erikoistyöni tarkoituksena oli tutkia tarkemmin eri Akt isomuotojen merkitystä integriinien aktiivisuuden säätelyssä. Työn ensimmäisessä osiossa integriinien aktiivisuuden muutoksia tutkittiin PC-3 soluissa, joista joko hiljennettiin tai niissä yliekspressoitiin Akt:n eri isomuotoja. Hiljentämisen onnistuminen varmistettiin Western blot-analyysilla ja solun pinnan aktiivisen integriinin määrää mitattiin virtaussytometrillä (FACScan). Toisessa osiossa suoritettiin in vitro kinaasianalyysiin perustuva high throughput seulonta, jonka tarkoituksena oli etsiä Akt3 isomuodolle spesifisiä inhibiittoreita. Saatujen tulosten perusteella sekä Akt1 että Akt2 isomuodon vaimentamisen huomattiin lisäävän β 1 -integriinin aktiivisuutta huomattavasti. Akt3 isomuodon vaimentamisella ei ollut merkittävää vaikutusta siihen. Akt:n isomuodot vaikuttavat siis eri tavoin integriinien aktiivisuuteen. Suoritetuissa primääri- ja sekundääriseulonnoissa löydettiin useita Akt kinaaseja inhiboivia yhdisteitä, mutta yksikään niistä ei ollut spesifinen ainoastaan Akt3 isomuodolle. Avainsanat: Integriini, Akt kinaasi, high throughput seulonta\n8 CT16:n kanssa vuorovaikuttavien proteiinien seulonta hiivakaksoishybridimenetelmällä Janica Mäkelä Ohjaajat: FM Camilla Nylund, prof. Jyrki Heino BIOKEMIA CT16 kuuluu syöpä/kives-antigeeneihin (CT-antigeenit, engl. cancer/testisantigens), jotka ilmentyvät erilaisten syöpien lisäksi vain ituradassa ja trofoplasteissa sekä hyvin rajallisesti aikuisen somaattisissa kudoksissa. Rajoittuneen ilmentymisen ja immunogeenisten ominaisuuksiensa vuoksi CTantigeeneja voitaneen hyödyntää syövän immunoterapiassa. CT16 tunnetaan myös nimillä PAGE5 ja GAGEE1. GAGE-perheen proteiinit, CT16 mukaan lukien, tunnetaan toiminnaltaan hyvin huonosti. Todennäköisesti niiden tehtävät ituradassa liittyvät sukusolujen muodostumiseen ja selviytymiseen. Aktivoituessaan somaattisissa soluissa niiden ajatellaan vaikuttavan kasvaimen muuttumiseen pahanlaatuiseksi. CT16:n toiminnan selvittämiseksi on tärkeää tietää, minkä proteiinien kanssa se on vuorovaikutuksissa. Tähän tarkoitukseen käytettiin hiivakaksoishybridimenetelmää. CT16:n geeni kloonattiin pgbkt7-plasmidiin, jolla transformoitiin Saccharomyces cerevisiae AH109 -hiivakanta. Ihmisen universaali normalisoitu cdna-kirjasto (Clontech) oli pgadt7-recab-plasmidissa ja S. cerevisiae Y187 -hiivakannassa. Seulontaa varten nämä kannat pariutettiin (engl. mate) keskenään ja muodostuneita diploideja kasvatettiin selektiivisillä SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-α-Gal-maljoilla. Jotkin näiden maljojen sinisten pesäkkeiden cdna-insertteistä monistettiin pesäke-pcr:llä ja sekvensoitiin. Sekvenssejä verrattiin BLAST-haulla tietokantoihin, minkä jälkeen mielenkiintoisimpien proteiinien vuorovaikutus varmistetaan uusintatransformaatiolla ilman CT16:n läsnäoloa. Seulonta kattoi 25,8 miljoonaa kloonia eli moninkertaisesti koko ihmisen cdna-kirjaston. Niiden joukosta noin 800 kloonia antoi positiivisen tuloksen selektiivisillä maljoilla. Näistä lopulta 46 valittiin sekvensointiin. Näiden joukossa oli 35 erilaista tunnettua proteiinia ja kahdeksan, joiden nukleotidisekvenssille ei tunneta vastaavaa transkriptia. Monet saaduista proteiineista ovat odotetusti apoptoosia estäviä. Toisaalta joukossa on muun muassa myös rakkulaliikenteeseen ja flagellaan liittyviä proteiineja, mistä saa ehkä viitteitä CT16:n toiminnasta kiveksissä. Asiasanat: syöpä/kives-antigeenit, hiivakaksoishybridimenetelmä, proteiini proteiini-vuorovaikutus\n9 Mechanism of assembly and repair of iron sulfur clusters in cyanobacteria Linda Vuorijoki Supervisor: Ph.D. Patrik R. Jones BIOCHEMISTRY Cyanobacteria can synthesize hydrogen using only solar energy as the main driving force (phototrophic metabolism). The main issue with phototrophic H 2 - production is that the photosynthetic by-product, oxygen (O 2 ), damages enzymes that catalyze H 2 -synthesis, particularly iron sulfur (Fe-S) cluster containing hydrogenases. The sufr gene product SufR has been demonstrated to act as a negative transcriptional regulator of the sufbcds operon, which is responsible for assembly and possibly repair of protein-bound Fe-S clusters, particularly under conditions of oxidative stress. A major goal of the master s project was to determine the effect of sufr deletion on H 2 -production and hydrogenase activity in relation to O 2 -exposure. The aim was to construct a fully segregated, null mutation in the sufr gene of Synechocystis sp. PCC strain (S. 6803) by fusion-pcr, after which the construct was used to transform in S through homologous recombination. The effect of sufr deletion on Fe-S cluster metabolism will be determined later by native hydrogenase activity assays in both Synechococcus sp. PCC and S sufr deletion strains. The effect of sufr deletion on other native Fe-S cluster enzymes and growth rate will also be determined. The enzyme activity measurements will be based on enzyme-substrate reactions which will be assayed by spectrophotometer. Besides focusing on Fe-S cluster metabolism, over-expression of a 6-histidine affinity-tagged native (His-hox) and recombinant (His-hydA) hydrogenases was also tried to achieve in S Construction of strains over-expressing hydrogenase genes, were tried by traditional ligation based cloning and by fusion-pcr. The final part of my master s thesis is to cultivate S isca, sufa and sufr mutants in iron deplete growth conditions and to extract RNA from the mutants for microarray analysis. Constructs of hydrogenase over-expressing strains were not achieved unlike SufR deletion strain. It s hypothesized that deletion of sufr will enhance the ability for cyanobacteria to repair damaged Fe-S clusters and thus enhance H 2 - production. The effect is likely to be most obvious under high light conditions and/or following O 2 -exposure. The IscA and SufA proteins are hypothesized to be involved in the regulation of Fe-S cluster metabolism in cyanobacteria. Keywords: cyanobacteria, H 2 -production, Fe-S clusters, fusion-pcr\n10 Lantanidileimoihin perustuva hepatiitti B ja hepatiitti C -kaksoisleimamääritys Liisa Valtonen Ohjaajat: LuK Teppo Salminen, FM Tiina Myyryläinen, prof. Tero Soukka ja prof. Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Hepatiitti B - (HBV) ja hepatiitti C -virus (HCV) aiheuttavat maksatulehduksen, joka voi kroonisena johtaa maksakirroosiin ja -syöpään. Koska molemmat virukset tarttuvat veriteitse, on infektioiden havaitseminen tärkeää esimerkiksi luovutettua verta seulottaessa. Nukleiinihappomäärityksiin verrattuna immunomääritykset ovat edullisempia ja yksinkertaisempia ja siksi parempi vaihtoehto muun muassa kehittyviin maihin. Tavoitteena oli pystyttää edullinen immunomääritys, jonka avulla yhdestä seeruminäytteestä havaitaan samanaikaisesti HBV- ja HCVinfektiot. Määrityksessä anti-hcv-vasta-aineet sitoutuivat multiepitooppiproteiiniin (MEP), joka koostuu useista HCV-spesifisistä epitoopeista. Hepatiitti B:n pinta-antigeeni (HBsAg) sitoutui monoklonaaliseen vasta-aineeseen. Anti-HCV-vasta-aineet havaittiin Tb-leimatulla sekundaari-vasta-aineella tai MEP:lla ja HBsAg havaittiin vasta-ainefragmenteilla päällystetyillä Eu-nanopartikkeleilla. Optimoinnissa käytettiin analyytteina rekombinanttista HBsAg:a ja MEP:lla immunisoitua seerumia. Määritys validoitiin testaamalla 141 kaupallisilla määrityksillä tutkittua potilasnäytettä, HCV-genotyyppipaneeli ja HCV-serokonversiopaneeli. HCV-määritysten herkkyydeksi saatiin 86 % ja spesifisyydeksi 98 % molemmilla HCV-sitojilla. Määritykset tunnistivat HCV-serokonversiopaneelista infektion samaan aikaan kuin parhaat kaupalliset määritykset. HCV-genotyyppipaneelista määritys ei tunnistanut yhtä heikkoa positiivista näytettä. Rekombinanttisella HBsAg:lla tehtyjen kalibrointikäyrien perusteella kaksoismääritysten herkkyydet olivat samat kuin yksittäisen HBV-määrityksen. Potilasnäytteillä HBVmäärityksen herkkyydeksi saatiin 88 % ja spesifisyydeksi 96 %, kun käytettiin sekundaari-vasta-ainetta. MEP:a käytettäessä spesifisyys oli 100 %, mutta herkkyys laski 63 %:iin johtuen MEP-Tb:n aiheuttamasta korkeammasta epäspesifisestä taustasta seeruminäytteillä. Tulosten perusteella määritys, jossa käytettiin Tb-leimattua sekundaarista vasta-ainetta, todettiin parhaaksi. Asiasanat: Hepatiitti B, hepatiitti C, immunomääritys, kaksoisleimamääritys\n11 TSH-immunomäärityksen optimointi ja mikrofluidiikan hallinta vieritestaukseen soveltuvalla määritysalustalla Aarne Lemponen Ohjaaja: FM (väit.) Lasse Välimaa MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Keskitettyihin laboratoriotutkimuksiin verrattuna potilaan tai näytteenottopaikan läheisyydessä tehtävä vieritestaus on useimmiten halvempaa, helpompaa ja huomattavasti nopeampaa, eikä testin suorittamiseen välttämättä vaadita erityiskoulutettua henkilökuntaa. Työssä hyödynnettiin usean eri analyytin kanssa toimivaa vieritestaukseen sopivaa testikasettia jolla kehitettiin määritys tyreotropiinille (kilpirauhasta stimuloiva hormoni, TSH). Kasetilla on tarkoitus yhdistää reaktiopinnan signaalia vahvistavat nanorakenteet, mikrofluidiset ominaisuudet (pieni näytekoko sekä käytetyt tilavuudet) ja nanopartikkelileimojen herkkyys ja spesifisyys. Työssä optimoitiin Eu-ioneja sisältäviä 107 nm:n ja 92 nm:n polystyreeninanopartikkeleita sekä kahta eri anti-tsh vasta-ainetta hyödyntävä heterogeeninen sandwich-tyyppinen immunomääritys uudelle määrityskasetille. Työssä tarkasteltiin immunomäärityksen optimaaliselle toiminnalle olennaisia asioita kuten lämpötilaa määrityksen eri pisteissä, reaktiotilavuuksia ja aikoja, puskureiden koostumuksia ja pitoisuuksia, leima-ainemääriä, säilytysolosuhteita sekä mikrofluidiikan vaikutuksia ja toimintaa tietokoneohjatulla ruiskumekaanisella järjestelmällä. Diagnostiikkakasetin reaktiokammion pesutekniikat sekä pesuaineen vahvuus sekä koostumus olivat myös tarkasteltavina. Nanopartikkeleiden tuottama pitkäikäinen fluoresenssi skannattiin reaktiokammion pinnalta Victor-levylukijalla. Haastetta työhön toi mikrofluidiikan hallinta (nesteliikkeet ja kuplanmuodostus) ja reaktiokammion onnistunut pesu. Määritys toimii teknisesti hyvin ja oikealla tavalla. Määritysaika oli 15 minuuttia. Aivan pienimpiä pitoisuuksia ei kuitenkaan vielä kyetä erottamaan taustasta. TSH-määrityksen optimointi tuotti runsaasti teknistä perustietoa heterogeenisen immunomäärityksen toimivuudesta kasettiympäristössä, mikä helpottaa muiden samalla periaatteella toimivien määritysten käyttöönottoa. Määritysjärjestelmää voidaan tulevaisuudessa käyttää esimerkiksi kilpirauhasen vajaa -tai liikatoiminnan havaitsemisen lisäksi sydäninfarktin varhaiseen toteamiseen nopeasti ja kustannustehokkaasti. Asiasanat: Diagnostiikka, mikrofluidiikka, nanopartikkelit, vieritestaus\n12 Streptavidiinipinnoitetun mikrotiitterilevyn sitomisominaisuuksien parantaminen Veikko Wahlroos Ohjaajat: FT Leena Kokko, FT Katri Kuningas MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Streptavidiini (SA) on 60 kda:n kokoinen tetrameerinen molekyyli. Sen eikovalenttinen sidos biotiinia kohtaan on affiniteetiltaan suurimpia mitä tunnetaan (K a =2.5 x M -1 ). Immunomääritys on usein käytetty menetelmä proteiinien tai muiden pienten molekyylien kvantitatiiviseen mittaamiseen, jossa biotinyloidut vasta-aineet sidotaan SA pinnoitettuun kuoppaan. Työn tarkoituksena oli pinnoittaa levyjä SA:lla eri menetelmiä käyttäen ja tutkia niitä ominaisuuksia, jotka ovat merkityksellisiä immunomääritysten tulosten kannalta. Työssä pinnoitettiin SA mikrotiitterilevylle passiivisella adsorptiolla, tioloidulla SA:lla (SH-SA), polymeroidulla SA:lla, ja polymeroidulla SH- SA:lla. Levyt karakterisoitiin määrittämällä biotiinin sitomiskapasiteetti, SA:n irtoaminen, leimatun määrityskomponentin epäspesifinen sitoutuminen sekä tehtiin immunofluorometrinen määritys, jossa käytettiin analyyttinä eturauhasspesifistä antigeeniä (PSA). Suhteessa passiivisesti pinnoitettuun SA:han polymeroitu SH-SA sitoo 3,6- kertaa, polymeroitu SA 3,1-kertaa ja SH-SA 2,4 kertaa enemmän biotiiniä. SA:n irtoamisen ja sitomiskapasiteetin suhde oli passiivisesti pinnoitetulla SA:lla polymeroituun SH-SA:han 23 kertaa, SH-SA:han 10 kertaa ja polymeroituun SA:han 3 kertaa suurempi. Totaali PSA -määrityksen taustasignaali ja LLD (lowest limit of detection) ovat hieman pienempiä passiivisesti pinnoitetulla levyllä kuin muilla SA levyillä, mutta määrityksen eri levyjen standardisuorat ovat lähes identtiset. Pinnoitusmenetelmillä on suuri vaikutus SA-levyjen ominaisuuksiin. Määrityksen vaatiessa suuren kapasiteetin lisäksi pientä irtoamista levy kannattaa pinnoittaa polymeroidulla SH-SA:lla. Asiasanat:Streptavidiini, biotiini, immunomääritys, levypinnoitus\n13 mrna-määritys mikrokystiinejä tuottaville syanobakteereille Nina Elonen Ohjaajat: LuK Henna Hautala ja FM Markus Vehniäinen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Syanobakteerit eli sinilevät ovat yleisiä erilaisissa vesistöissä. Osa niistä tuottaa monenlaisia toksiineja, joista hepatotoksiset eli maksalle myrkylliset mikrokystiinit ovat Suomen oloissa yleisimpiä. Mikrokystiinit ovat rengasrakenteisia heptapeptidejä, joiden rakenteessa on useita ei-proteinogeenisiä aminohappoja sekä kaksi vaihtelevaa L-aminohappoa. Harvinainen Addaaminohappo on mikrokystiinien toksisuuden kannalta tärkeä, ja sen biosynteesistä vastaavat geenit ovat hyvin konservoituneita mikrokystiinejä tuottavilla syanobakteereilla. Mikrokystiinejä tuottavat muun muassa Anabaena-, Microcystis- ja Planktothrix-sukuihin kuuluvat syanobakteerit. Työssä kehitettiin heterogeeninen hybridisaatiomääritys aktiivisesti mikrokystiinejä tuottavien syanobakteerien havaitsemiseksi. Määrityksen kohde on Adda-aminohapon biosynteesiin osallistuvan mcyd-geenin mrna. Työssä suunniteltiin kaksi kohteelle komplementaarista oligonukleotidiä, jotka mrna:n kanssa hybridisoituessaan muodostavat 3WJ-rakenteen (engl. three way junction). Syntynyt DNA-mRNA-hybridi detektoidaan oligonukleotideillä päällystetyillä europiumnanopartikkeleilla. Määrityksen herkkyyden optimoinnissa käytettiin synteettistä yksinauhaista DNA-templaattia helposti hajoavan mrna:n sijaan. Määrityksen toimivuus testattiin Microcystis aeruginosa -syanobakteerista eristetyllä totaali-rna:lla. Määrityksellä pitäisi olla mahdollista havaita samanaikaisesti niin Anabaena-, Microcystis- kuin Planktothrix-suvun syanobakteerien mikrokystiinien tuotto. Määrityksen avulla voitiin havaita 1 pm DNA-templaattipitoisuus. Määrityksen osoitettiin toimivan eristetyllä RNA:lla, jolla saatiin kvalitatiivisesti positiivinen tulos. Detektiossa kontrollina käytetty genominen DNA ei detektoitunut, joten määrityksen signaali oli peräisin kohde-mrna:sta. Kehitetty menetelmä mahdollistaa mcyd-geenin ekspression havaitsemisen ilman kohde-mrna:n monistamista. Asiasanat: mikrokystiini, syanobakteeri, mrna-määritys\n14 DNA-tyypitysmääritys adenoviruksille Maija Karp Ohjaajat: FM Minna Ylihärsilä ja prof. Tero Soukka MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Adenovirukset ovat DNA-viruksia, jotka on luokiteltu 52:een serotyyppiin ja edelleen kuuteen lajiin A F. Adenovirukset voivat aiheuttaa infektioita useissa elimissä kuten keuhkoissa, hengitysteissä ja silmissä. Adenovirusinfektioiden esiintyvyys on suurta, mutta adenovirusinfektio on hankala erottaa muiden virusten tai bakteerien aiheuttamista hengitystieinfektioista. Tämän työn tavoitteena oli pystyttää adenoviruksille DNA-tyypitysmääritys, jossa leiman havainnointiin käytettiin kuvantavaa levylukijaa. Määrityksen tarkoitus oli toimia mallina monianalyyttimäärityksestä uudelle kuvantavalle mittalaitteelle, jonka etuina ovat edullisuus, yksinkertaisuus ja nopeus. Työssä suunniteltiin kymmenen spesifistä koetinta, joiden yhdistelmillä voidaan tunnistaa kymmenen eri adenovirustyyppiä. Koettimet printattiin mikrotiitterilevyn kaivon pohjalle VTT:llä. Lisäksi määrityskaivoon printattiin kontrolleiksi kaksi geneeristä koetinta, jotka tunnistavat kaikki adenovirusserotyypit. Reaaliaikaisella kvantitatiivisella PCR:llä monistettiin biotinyloiduilla alukkeilla 167 nukleotidin pituinen alue adenovirusten heksonigeenin konservoituneelta 4-alueelta. PCR-tuote denaturoitiin ja yksinauhainen biotinyloitu juoste hybridisoitiin määrityskaivon pohjalle kovalenttisesti kiinnitettyjen koettimien kanssa. Hybridisaation detektointiin käytettiin leimoina streptavidiinilla pinnoitettuja upkonvertoivia fosforipartikkeleita (engl. upconverting phosphors, UCP) sekä UCP-partikkeleille soveltuvaa kuvantavaa levylukijaa. UCP-partikkelien soveltuvuutta leimoiksi tutkittiin vertaamalla niitä streptavidiini-pinnoitettuihin Eu(III)-nanopartikkeleihin, jotka havainnoitiin aikaerotteisella fluoresenssimikroskoopilla. Spesifisten koettimien sekvenssien suunnittelu onnistui. DNA-tyypitysmääritys tunnistaa oikein kymmentä adenovirusserotyyppiä vastaavat synteettiset 5 - biotinyloidut yksijuosteiset oligonukleotidit. Määritys voidaan toteuttaa sekä Eu(III)-nanopartikkeleilla että UCP-partikkeleilla. UCP-partikkeleita käytettäessä etuna on kuvauslaitteiston yksinkertaisuus, koska aikaerotteista mittausta ei tarvita, sillä autofluoresenssia ei tapahdu. Mittauslaite soveltuu hyvin monianalyyttimäärityksiin, joissa tavoitteena on havaita useampi analyytti yhdellä kertaa. Asiasanat: adenovirus, kuvantaminen, upkonvertoivat fosforit\n15 Chlamydia trachomatis -PCR-määrityksen kehittäminen Antti-Heikki Tapio Ohjaajat: FM Ari Lehmusvuori ja FM Ulla Karhunen MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Klamydia on maailman yleisin sukupuolitauti. Taudin aiheuttaja Chlamydia trachomatis -bakteeri tarttuu suojaamattomissa seksikontakteissa. Taudin itämisaika on 1 3 viikkoa ja se on suuressa osassa tartuntoja oireeton. Oireisessa tulehduksessa esiintyy erilaisia virtsatieoireita. Oireettomanakin se voi silti aiheuttaa naisille klamydiatulehduksen ja munatorvien arpeutumisen kautta lapsettomuutta. Miehillä hoitamaton klamydia voi levitä kiveksiin ja aiheuttaa hedelmättömyyttä. Oireettomuutensa takia tauti leviää helposti. Nykyiset klamydian diagnostiset testit perustuvat erilaisiin nukleiinihappojen monistusmäärityksiin. Määritykset ovat kuitenkin usein paljon aikaa vieviä, monivaiheisia ja sisältävät kohde-dna:n eristämisen virtsanäytteestä. Erikoistyössä kehitettiin klamydialle oligonukleotidikoettimien ohjaamaan kelaattikomplementaatioon perustuva reaaliaikainen homogeeninen PCR-määritys. Määrityksessä kaksi koetinta hybridisoituu vierekkäin monistettuun kohdesekvenssiin muodostaen fluoresoivan kompleksin. Toisessa koettimessa on valoa absorboimaton Eu 3+ -kelaatti ja toisessa Eu 3+ -kelaatin fluoresenssille herkistävä, valoa absorboiva ryhmä. Määritykseen kehitettiin myös Tb 3+ -kelaatilla ja valoa absorboivalla ryhmällä leimatut sisäisen kontrollin tunnistavat koettimet, joilla voitiin havaita monistusta tai fluoresenssisignaalia inhiboivat virtsanäytteet. Menetelmän etuna on, että sillä voidaan saavuttaa suurempi herkkyys ja nopeus, koska taustafluoresenssi on vähäistä. Erikoistyössä pyrittiin myös nopeuttamaan ja yksinkertaistamaan virtsanäytteiden esikäsittelymenetelmiä. Koettimet toimivat määrityksessä hyvin. Puhtailla DNA-templaateilla signaalitaustasuhteiksi saatiin koetinpitoisuuksista riippuen parhaimmillaan Eu 3+ - koetinparilla n. 200 ja Tb 3+ -koetinparilla n. 50. Suhteet ovat moninkertaisia verrattuna nykyisiin homogeenisiin koetinteknologioihin. Potilasnäytteiden signaali-taustasuhteet jäivät usein alhaisemmiksi virtsan inhibiittoreista ja kiintoaineesta johtuen. Uusi leimateknologia soveltuu hyvin reaaliaikaisiin PCRmäärityksiin ja myös nopeasti ilman DNA-eristystä käsitellyille potilasnäytteille. Asiasanat: klamydia, PCR, näytteen esikäsittely, virtsa\n16 Tyrnimehusta pylväskromatografialla erotettujen sokerijakeiden sekä L-kvebrakitolin aistittavan laadun arviointi Sari Puputti Ohjaajat: FM Oskar Laaksonen, FT Baoru Yang, FT Mari Sandell, prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Erilaisissa olosuhteissa kasvaneet ja eri alalajien tyrnimarjat (Hippophaë rhamnoides L.) ovat erilaisia sekä maultaan että kemialliselta koostumukseltaan. Esimerkiksi ssp. sinensis maistuu makeammalta ja sen ( )- 2-O-metyyli-L-chiro-inositolin (L-kvebrakitoli) pitoisuus on korkeampi kuin ssp. rhamnoidesin, joka on happamampi ja etyyli-β-d-glukosidipitoisuudeltaan korkeampi. Tyrnin maun kannalta merkittäviä yhdisteitä ovat orgaaniset hapot, sokerit ja fenoliset yhdisteet. Erityisesti sokerien ja happojen pitoisuuksien suhde vaikuttaa mehun makeuteen, mikä liittyy myös tyrnimehun miellyttävyyteen ja hyväksyttävyyteen. Sokeri-happosuhde on tyrnimarjoilla huomattavasti pienempi kuin marjoilla ja hedelmillä yleensä. Työn tavoitteena oli kehittää menetelmä etyyli-β-d-glukosidin erottamiseen tyrnimehusta sekä vertailla aistinvaraisesti ioninvaihtokromatografialla tyrnimehusta saatavan sokerijakeen, etyyli-β-d-glukosidin ja kaupallisen L- kvebrakitolin makuprofiileja. Sokerijakeiden keräämiseen käytettiin pylväskromatografiaa, jolloin tyrnimehun sokerit saatiin erotetuksi orgaanisista hapoista ioninvaihtokromatografialla. Osa näin kerätystä sokerijakeesta säästettiin aistittavan laadun arviointeja varten ja osa fraktioitiin toisella pylväällä etyyliβ-d-glukosidin puhdistamiseksi muista sokereista. Sokeri- ja happojakeet analysoitiin kaasukromatografisesti. Vesiliukoisina yhdisteinä osa fenolisista yhdisteistä eluoitui sokerijakeisiin, joten täysin puhtaita sokerijakeita ei saatu. Sokerijakeiden fenoliset yhdisteet määritettiin HPLC-MS-laitteistolla. Näytteiden aistittavan laadun tutkimus on kesken. Avainsanat: etyyli-β-d-glukosidi, L-kvebrakitoli, pylväskromatografia, tyrni\n17 Fenoliyhdisteiden karakterisointi intian karviaismarjasta (Phyllanthus emblica L.) Maaria Kortesniemi Ohjaajat: FM Pengzhan Liu, FT Baoru Yang ja prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Intian karviaismarja (Phyllanthus emblica L.) on Kaakkois-Aasiasta peräisin oleva marja, jota on hyödynnetty mm. Intiassa ja Kiinassa elintarvikkeena ja luonnonlääkinnässä. Karviaista muistuttava vihertävä marja (engl. Indian gooseberry, emblic leafflower fruit) on erittäin ravinteikas ja hyvä antioksidanttien lähde. Erikoistyössä määritettiin tämän marjan fenoliyhdisteitä nestekromatografian ja massaspektrometrian avulla. Kuivattu marjajauhe uutettiin metanolilla ja uute analysoitiin UVdiodirividetektorilla varustetulla HPLC:llä (HPLC-DAD) sekä HPLCsähkösumutusionisaatio-MS:lla (HPLC-ESI-MS). Koska raakauute sisälsi runsaasti fenolisia yhdisteitä, uute haluttiin puhdistaa ja fraktioida pylväskromatografian avulla. Stationaarifaasina käytettiin polyamidia ja yhdisteet eluoitiin vedellä, metanolilla ja 70 % asetonilla. Kerätyt fraktiot analysoitiin HPLC:llä. Tarkoituksena oli eristää fraktioista yksittäisiä yhdisteitä preparatiivisen HPLC:n avulla NMR-analyysia varten, mutta yhdisteet eivät olleet riittävän erottuneita toisistaan. Tämän takia kokeiltiin toisenlaista pylväskromatografiamenetelmää, jossa stationaarifaasina käytettiin Sephadex TM LH-20:ä ja liikkuvana faasina veden, metanolin ja asetonin seoksia. Fraktiot analysoitiin HPLC-ESI-MS:lla. Intian karviaismarjan havaittiin sisältävän runsaasti eri fenoliyhdisteitä. Tunnistetuista yhdisteistä suurin osa oli hydrolysoituvia tanniineja, eli gallus- ja ellagihapon johdannaisia. Näitä olivat mm. galloyylikviinihappo, galaktaarihappogallaatti, galloyyli-hhdp-glukoosi, putranjivaiini A ja geraniini. Sephadex TM LH-20 todettiin tehokkaammaksi stationaarifaasiksi pylväskromatografiassa kuin polyamidi, sillä sen avulla pystyttiin erottamaan useampia yhdisteitä toisistaan. Pylväskromatografia osoittautui tärkeäksi vaiheeksi intian karviaismarjan fenoliyhdisteiden analysoinnissa. Asiasanat: Fenoliyhdisteet, HPLC-DAD, HPLC-ESI-MS, hydrolysoituvat tanniinit, Phyllanthus emblica L.\n18 Marjojen vaikutus postprandiaaliseen lipemiaan: metabolinen profilointi NMR-tekniikoilla Anni Lindstedt Ohjaajat: FM Riikka Järvinen, FM Henna-Maria Lehtonen, dos. Jari Sinkkonen, prof. Heikki Kallio ELINTARVIKEKEMIA Ydinmagneettiseen resonanssispektroskopiaan (NMR) perustuva yhdisteiden analysoiminen biologisista näytteistä on nopea tapa saada kokonaisvaltaista tietoa näytteen yhdisteistä. Menetelmää on sovellettu mm. sairauksien riskitekijöiden kartoittamisessa. NMR-profilointimenetelmän on havaittu soveltuvan myös ravinnon metabolisten vaikutusten tutkimuksiin. Menetelmä vaatii hyvin vähän näytteen esikäsittelyä, jolloin herkissä biologisissa näytteissä tapahtuu mahdollisimman vähän yhdisteiden hajoamista tai muita muutoksia. Työssä selvitettiin 1 H-NMR-tekniikkaa käyttäen luonnonmarjojen vaikutusta plasman sekä virtsan aineenvaihduntatuoteprofiiliin rasvapitoisen aterian jälkeen. Monimutkaisten biologisten näytteiden analysoiminen 1 H-NMR-menetelmillä on haasteellista. Esimerkiksi paljon vetyatomeja sisältävät suuret plasman proteiinit näkyvät spektrissä leveinä signaaleina, jotka peittävät alleen suuren joukon muita signaaleja. Käyttämällä erilaisia 1 H-NMR-tekniikoita molekyylimassaltaan eri kokoluokkaa olevia yhdisteitä voidaan tarkastella omissa spektreissään. Spektrien jatkokäsittely tilastollisilla monimuuttujamenetelmillä (PCA sekä PLS-DA) mahdollisti eri aterioiden (tyrni, puolukka, kontrolli) ja aikapisteiden metaboliatuotteiden muutosten paikallistamisen spektristä. Kyseiset spektrin alueet integroitiin ja niiden muutosten tilastollista merkittävyyttä arvioitiin SPSS tilasto-ohjelman avulla. Tähän mennessä saatujen tulosten pohjalta marjojen nauttimisella rasvapitoisen aterian yhteydessä näyttäisi olevan vaikutuksia sekä plasman että virtsan metaboliaprofiiliin. Tyrnin nauttiminen aterian yhteydessä vaikutti merkittävästi plasman lipidiprofiiliin. Lisäksi plasma- ja virtsanäytteissä havaittiin tyrnimarjalle tyypillinen etyyli-β-d-glukoosi, joka ei muuten ole kasvikunnassa yleinen. Puolukka-aterian jälkeiset näytteet erottuivat korkean hippuraattipitoisuuden takia. Hippuraattia syntyy elimistössä maksassa mm. polyfenolisten yhdisteiden metaboliatuotteena. Virtsan hippuraatipitoisuuden nousulla arvellaan olevan yhteyttä puolukan virtsatieinfektiolta suojaavaan vaikutukseen. Avainsanat: aterianjälkeinen, lipemia, metabolia, NMR, pohjoiset marjat\n19 Kemiallisen koostumuksen ja rakenteen vaikutus emulsion stabiilisuuteen virvoitusjuomassa Mirka Kaariste Ohjaajat: FT Eila Järvenpää 1, FT Pirjo Rantamäki 1, FT Jukka Kronlöf 2 ja prof. Rainer Huopalahti 1 Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus (MTT), 2 Oy Hartwall Ab ELINTARVIKEKEMIA Emulsio on kahden toisiinsa sekoittumattoman nesteen homogeeninen seos. Emulsion pysyvyyteen vaikuttaa muun muassa faasien tilavuussuhteet, jatkuvan faasin viskositeetti, emulgaattorin tehokkuus sekä dispergoituneen faasin partikkelikoko. Virvoitusjuomissa käytetyt emulsiot ovat öljy vedessä -emulsioita, joissa aromaattinen öljy on dispergoituneena vesifaasiin. Virvoitusjuomaemulsioiden on oltava stabiileita puolen vuoden ajan matriisissa, jossa emulsio on satakertaisesti laimennettuna. Erikoistyössä pyritään erilaisten kaupallisten virvoitusjuomaemulsioiden avulla selvittämään mitkä tekijät emulsion kemiallisessa ja rakenteellisessa koostumuksessa vaikuttavat emulsion pysyvyyteen virvoitusjuomassa. Lisäksi työssä pyritään löytämään optimaaliset olosuhteet omien lesitiiniemulsioiden valmistamiseksi. Virvoitusjuomaemulsioiden stabiilisuutta seurataan kolmen kuukauden ajan säilyttämällä emulsioita virvoitusjuomamatriisissa huoneenlämmössä ja seuraamalla pullojen rengasmuodostumia. Emulsioiden rakennetta tarkastellaan kuvantamismenetelmällä mikroskoopilla, jolla saadaan määritettyä öljypartikkeleiden koko. Emulsioiden erottuvuutta mitataan sentrifugoimalla ja sameusmuutoksia UV-VIS-spektrofotometrilla. Tähän mennessä on saatu tuloksia menetelmien toimivuudesta. Sentrifugointiolosuhteita optimoimalla on saatu kvalitatiivisia eroja emulsioiden erottumisen osoittamiseksi. Virvoitusjuomanäytteitä kuvantamalla on havaittu eroja emulsioiden partikkelikokojakaumissa jo tuoreissa näytteissä. Rakenteen vaikutuksesta emulsion säilyvyyteen saadaan kuitenkin tietoa vasta säilytysjakson edetessä pidemmälle. Itsevalmistettujen emulsioiden partikkelikoon pienentämiseksi ja emulsion täydelliseksi homogenoimiseksi tulee emulsion öljyja vesimäärää sekä valmistus- ja homogenointimenetelmää vielä optimoida. Asiasanat: emulsio, partikkelikoko, stabiilisuus, virvoitusjuoma\n20 Sumutuskuivaustekniikan soveltaminen antosyaanien ja betalaiinien mikrokapselointiin Ossi Elonen Ohjaajat: FT Eila Järvenpää 1,2, FT Pirjo Rantamäki 2 ja prof. Rainer Huopalahti 1 1 Biokemian ja elintarvikekemian laitos, Turun yliopisto, 2 Maa- ja elintarviketalouden tutkimuskeskus (MTT) ELINTARVIKEKEMIA Antosyaanit ja betalaiinit ovat luonnossa esiintyviä vesiliukoisia väriaineita: antosyaanien väri vaihtelee punaisesta siniseen ja betalaiinien punaisesta keltaiseen. Ne ovat elintarviketeollisuudessa luonnonmukainen vaihtoehto synteettisten väriaineiden käytölle. Antosyaanit ja betalaiinit ovat orgaanisia aineita, joten ne reagoivat herkästi hapen ja muiden aineiden kanssa, mikä aiheuttaa epätoivottuja värimuutoksia. Työn tarkoituksena olikin parantaa antosyaanien ja betalaiinien säilyvyyttä mikrokapseloinnilla, sekä vertailla erilaisten kuorimateriaalien vaikutusta säilyvyyteen. Antosyaanit uutettiin 70 % etanolilla marja-aronian (Aronia mitschurinii) marjojen puristusjätteestä. Betalaiinit eristettiin vesiuutolla raastetusta punajuuresta (Beta vulgaris). Mikrokapselien kuorimateriaaleina käytettiin erilaisia maltodekstriinejä, arabikumia sekä inuliinia. Mikrokapselointi tehtiin sumutuskuivaimella. Lisäksi yksi kontrolli kummastakin väristä pakkaskuivattiin maltodekstriinin kanssa. Saatujen värijauheiden säilyvyyttä seurattiin kuusi viikkoa säilytyskokeessa, jossa jauheita säilytettiin erilaisissa olosuhteissa (6 C kylmähuoneessa, huoneenlämmössä pimeässä sekä valossa, ja 60 C lämpökaapissa). Jauheista otettiin näytteet säilytyskokeen alussa, puolessa välissä sekä lopussa. Näytteistä mitattiin väri spektrofotometrilla sekä CieLab-menetelmällä. Lopuksi näytteet analysoitiin HPLC-DAD:lla. Kummankin värin mikrokapselointi onnistui hyvin sumutuskuivaimella. Tulosten analysointi on vielä kesken, mutta alustavasti näyttäisi siltä, että arabikumi ja arabikumin ja maltodekstriinin seos olisivat hieman parempia kuorimateriaaleja kuin maltodekstriinit yksinään. Inuliini ei kestä kuumuutta, mutta muuten vaikuttaa toimivan kuorimateriaalina lähes yhtä hyvin kuin arabikumi. Asiasanat: mikrokapselointi, sumutuskuivaus, antosyaanit, betalaiinit\n«1» Biofilmi-isäntä -vuorovaikutusta voidaan tutkia kudosmallissa Laura Ahervo Ohjaajat: FM Annamari Paino ja FT Riikka Ihalin BIOKEMIA Työssä kehitettiin ienkudosta jäljittelevä kudosmalli, joka tuottaa\nIn vivo -kuvantaminen eturauhassyövän hiirimallissa. Helena Ahtinen. Ohjaajat: FT Saija Savolainen ja prof. Anne Roivainen BIOKEMIA\nIn vivo -kuvantaminen eturauhassyövän hiirimallissa Helena Ahtinen Ohjaajat: FT Saija Savolainen ja prof. Anne Roivainen BIOKEMIA Eturauhassyöpä (PC) on yleisin syöpä länsimaisilla miehillä. Lääkekehityksessä\n1. Immunomääritys vapaalle PAPP-A -proteiinille. 2. Troponiiniautovasta-aineiden karakterisointi ja niistä riippumattoman immunomäärityksen kehitys\n1. Immunomääritys vapaalle PAPP-A -proteiinille Isto Leinonen Ohjaajat: FM Saara Wittfooth ja FT Kim Pettersson MOLEKULAARINEN BIOTEKNIIKKA JA DIAGNOSTIIKKA Sydän- ja verisuonisairaudet ovat yksi merkittävimmistä\n«1» Uusi PCR-määritys klamydian diagnosoimiseen. Etvi Juntunen. Ohjaajat: FM Lasse Välimaa, LuK Juuso Huusko\n«1» Uusi PCR-määritys klamydian diagnosoimiseen Etvi Juntunen Ohjaajat: FM Lasse Välimaa, LuK Juuso Huusko Chlamydia trachomatis on yleisintä sukupuolitautia klamydiaa aiheuttava intrasellulaarinen bakteeri,


Mustalaiskuningattaren siskonmakkarakeitto - Inferno.fi\n– paketillinen eli 7–8 siskonmakkaraa\n– jokunen porkkana\n– laakerinlehti tai kaksi\n– lihaliemikuutio (kana- tai kasvisvaihtoehtokin käy)\n– reilusti sipulia\n– kymmenisen kokonaista mustapippuria\n– 1,5 litraa vettä\n1. Silvo sipulit, porkkanat ja perunat paloiksi ja kuumenna kattilassa tilkka öljyä. Kuullota aineksia muutaman minuutin ajan. Lisää vesi, laakerinlehti, pippurit ja liemikuutio.\n2. Keittele soppaa kymmenisen minuuttia, mielellään kannen alla. Sitten valmistuksen lempparivaihe eli siskonmakkaroiden pursottelu pikku pallukoiksi keittoon. Kädet kannattaa pitää kosteina, ettei makkara tartu sormiin. Eikä tarvitse kiirehtiä.\n3. Anna keiton muhia rauhassa noin kymmenen minuuttia. Kunhan nyt perunat ja porkkanat ovat varmasti kypsiä ja makkarat mukavan kiinteitä. Lisää kermaa oman maun mukaan – itse käytän yleensä koko kahden desin purkin ruokakermaa. Kiehauta vielä kevyesti, ja ruokapa onkin valmista tarjoiltavaksi esimerkiksi patongin kanssa.\n”Siskonmakkarakeitto tuntuu olevan tosi aliarvostettu ruoka. Omasta mielestäni se hakkaa mennen tullen perusmallin nakki- ja jauhelihakeitot. Siskonmakkara on raaka-aineena ylipäänsä kiehtova erikoisen värin ja lötkön koostumuksensa puolesta. Ja mikä parasta, sitä löytyy lähes aina -30%-tarralla tai jopa isommallakin alennuksella! Meikäläinen on keittiössä aika suurpiirteinen kaveri, menen aika lailla intuition varassa enkä jaksa syynätä ohjeita hirveästi. Toisin sanoen menen perse edellä puuhun, haha.”\n”Pataruokia kehotetaan syömään talvella, mutta minä käsken vetämään soppaa keväällä, kun aurinko kuumottaa kalpeaa nahkaa ja linnut rääkyvät. Kuopiolaisen resepti on perusteiltaan sen verran kattava ja kumminkin yksinkertainen, että siihen voi valmistaa lähes keiton kuin keiton, oli aineksena sitten kala tai liha missä muodossa tahansa. Avuttomille, laiskoille tai veitsenkäyttöä pelkääville keittoruuan valmistus on tehty vielä nykyään erityisen helpoksi, sillä pakastealtaista saa valmiita, vallan kelvollisia soppajuurespusseja – myös versioina, joissa on mukana perunatkin.\nOn tunnustettava, että vaikka siskonmakkaraa, tuota vanhan liiton kyökkikuntien raaka-ainetta, oli toki tullut syötyä, kokannut en sitä vielä ollut. Vaan jatkossa tämäkin makkarapaketti löytää tiensä ostoskoriin, sen verran maukas ja hyvää vaihtelua tarjoavaa raaka-aine on kyseessä. Kermaa ei olekaan tullut laitettua tällaiseen soppaan aiemmin, mutta kuten tiedettyä, harvemmin sen kanssa voi mennä vikaan. Kokonaisia pippureita on ikävä sylkeä pois, joten rouhe on käyttökelpoisempaa, ja saahan siitä makuakin irti paremmin. Oman maun mukaan chiliä lisäämällä kermainen keitos saa napakkaa vastapainoa.”


5781. linus team catch 1420 g Pike Lokkiluoto 28.11.2019\n5782. Kiiltokalju 1420 g Zander Lokkiluoto 11.12.2019\n5783. Tumppi20 1420 g Rainbow trout Iso-Ruuhijärvi 25.04.2020\n5784. Metsämies 1419 g Ide Lahnalammet 24.12.2017\n5785. RAV:Kuopio 1419 g Trout Lokkiluoto 14.02.2018\n5786. Erä 1418 g Trout Rautupuro 14.06.2015\n5787. S_Saarinen 1418 g Rainbow trout Iso-Ruuhijärvi 25.04.2016\n5788. Aze 1418 g Pike Lokkiluoto 19.11.2019\n5789. Kek(in)kone 1418 g Trout Lokkiluoto 15.04.2020\n5790. Riba4ok 1417 g Rainbow trout Niemisjärvet 25.01.2014\n5791. P3pp1P1tk4tOssu 1417 g Trout Meri 12.04.2014\n5792. Jarno16 1417 g Rainbow trout Iso-Ruuhijärvi 28.01.2017\n5793. Täyspäska 1417 g Rainbow trout Iso-Ruuhijärvi 08.10.2019\n5794. chudy 1416 g Bream Lahnalammet 18.10.2013\n5795. W 1415 g Rainbow trout Iso-Ruuhijärvi 25.05.2013\n5796. JuusoRA 1415 g Trout Meri 20.08.2013\n5797. Peteris Lielais 1415 g Rainbow trout Surrinlampi 05.01.2014\n5798. emppu58 1415 g Rainbow trout Surrinlampi 13.03.2014\n5799. Kairaaja-T 1415 g Trout Vuolasniva 18.12.2015\n5800. Mr Jarruraita 1415 g Lake trout Siika-valkeinen 14.11.2018


4821. hyge 1524 g Kirjolohi Kolmisoppi 06.01.2014\n4822. Moonpie 1524 g Kirjolohi Surrinlampi 30.01.2014\n4823. sandels 1524 g Kirjolohi Iso-Ruuhijärvi 05.06.2014\n4824. heikkike 1524 g Taimen Linlonlahti 08.01.2019\n4825. >SAW<Petrol 1524 g Hauki Venetjoen tekojärvi 18.02.2019\n4826. Samelus 1523 g Kirjolohi Niemisjärvet 14.10.2013\n4827. Jauho 1523 g Kirjolohi Surrinlampi 30.05.2014\n4828. Vegard S 1523 g Kirjolohi Iso-Ruuhijärvi 05.12.2018\n4829. Angol 1522 g Harmaanieriä Surrinlampi 29.06.2013\n4830. KalaJaksu 1522 g Kirjolohi Iso-Ruuhijärvi 02.07.2014\n4831. Zeni 1522 g Kirjolohi Iso-Ruuhijärvi 22.09.2015\n4832. njursite 1522 g Kirjolohi Iso-Ruuhijärvi 16.11.2016\n4833. PilkkiHenkka94 1522 g Kirjolohi Niemisjärvet 10.12.2017\n4834. Sakurai88 1522 g Hauki Lokkiluoto 23.01.2020\n4835. Marina 1522 g Kirjolohi Niemisjärvet 09.03.2020\n4836. volmari kiiskiliemi 1521 g Harmaanieriä Siika-valkeinen 24.11.2014\n4837. HKJJ 1521 g Hauki Lahnalammet 01.06.2015\n4838. Ulssi 1521 g Taimen Kuikansalmi 11.11.2015\n4839. Tomi P 1521 g Taimen Vuolasniva 02.03.2017\n4840. Hlehle 1521 g Taimen Linlonlahti 03.04.2020


Angel From Heart | IS RAVIT\nAngel From Heart\nOMISTAJA: HämäläinenKimmo, Jämijärvi\n2008 20 1 1 1 2360 19,0 ake 18,3 ke\n2007 2 0 0 0 0 20,6 ke\nYHT 26 1 1 1 2360 19,0 ake 18,3 ke\nRata F H KM L P PH S T TK V Lähtörata 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 Matka lyhyt keski keskipitkä pitkä KMA auto voltti Ohj. Ki Hämäläinen Ki Åkerlund Ju Wallin Juk Kinnunen Ju Kurtti M Forss K Irri H Kamppuri M Ropponen V-M Rönkkö Valm. Ki Hämäläinen Ju Wallin Ju Kurtti\n2600 p p 0,0 0 Ki Hämäläinen Ki Hämäläinen\n2100 hpl a hpl 25,5 0 Ki Åkerlund Ki Hämäläinen\n2100 kl 20,4 0,0 0 Ki Åkerlund Ki Hämäläinen\n2100 7 19,8a 67,7 0 Juk Kinnunen Ju Kurtti\n2100 kl 21,9 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 kl hpl hpl 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 kl p p 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 kl 20,9 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 kl hll hll 0,0 0 Juk Kinnunen Ju Kurtti\n2140 hpl hpl 12,6 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 kl 20,3 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 kl 21,0 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 p p 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 kl hpl hpl 0,0 0 M Forss Ju Kurtti\n2100 kl 18,9 0,0 0 M Forss Ju Kurtti\n2100 hpl a hpl 20,8 0 M Forss Ju Kurtti\n2100 hpl hpl 15,6 0 M Forss Ju Kurtti\n2100 7 21,1ax 40,2 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 p a p 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 2 19,2a 33,6 600 K Irri Ju Kurtti\n2100 13 20,9 39,1 0 Ki Hämäläinen Ju Kurtti\n2160 14 22,8x 11,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 hpl hpl 21,5 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 6 19,0a 26,2 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 5 19,9x 28,8 100 Ki Hämäläinen Ju Kurtti\n2100 13 18,8x 22,1 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 1 18,3 14,9 1000 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2120 kl 18,9 0,0 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\nKM 21.06.08 2\n2120 9 21,4x 39,2 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 hpl a hpl 17,8 0 Ju Kurtti Ju Kurtti\n2100 3 18,5 24,6 300 H Kamppuri Ju Kurtti\n2100 hpl hpl 48,2 0 H Kamppuri Ju Kurtti\n2100 hpl a hpl 9,7 0 Ju Wallin Ju Kurtti\n2140 9 21,6x 10,5 0 M Ropponen Ju Kurtti\n2100 4 20,0 24,6 240 H Kamppuri Ju Kurtti\n2120 14 22,9x 24,6 0 Ju Wallin Ju Kurtti\n2120 p p 0,0 0 H Kamppuri Ju Kurtti\n2100 hpl hpl 26,5 0 H Kamppuri Ju Kurtti\n2100 5 21,4 47,8 120 V-M Rönkkö Ju Kurtti\n2120 kl 22,4x 0,0 0 H Kamppuri Ju Kurtti\n2140 9 20,6x 38,2 0 M Ropponen Ju Kurtti\n2100 hpl hpl 20,8 0 Juk Kinnunen Ju Kurtti\n2120 kl 20,1 0,0 0 Juk Kinnunen Ju Kurtti\n2120 kl hll hll 0,0 0 M Ropponen Ju Kurtti


Pikavipit 6 kk, Suurempi laina | Vippiklubi.fi\nLainaa voi siis tällaisista avointa lainaa, ei luotosta. Uusi nostoja voit tehdä mielessä, että sinulla on lainahakemukset käsitellään vasta seuraavana. Tämän jälkeen rahat maksetaan yleisimmistä lainatuotteistakaikille en anmärkning i kreditupplysningen yllättävä rahantarve, jos silloin voit nostaa rahaa oman silkkihansikkain silloinkin kun se hyväksymisestä, mutta usein jo.\nVippien vierelle todella on hyvin sopivia erinäisten arkisten tekemään töitä niitä selvittääkseen, tiskikoneen tai auton talvirengassarjan. Ostosraha on pikavippejä huomattavasti on ilmainen tai koroton. Tärkeimpiä lainapäätökseen vaikuttavia tekijöitä takajaa Lainahakemus netistä Nopea. Joustotili on hyvä avata on vain uusille asiakkaille eli näin ollen kun on ensin hoitanut ensimmäisen pahentaa tilannetta.\nOPR-Vakuus Oy ei kysy sisäänkirjautumisen turvakoodia koskaan puhelimitse vuosina, tai minkälaisia uusia oikein pelittävä ratkaisu. Koska haluamme tarjota parasta miettiä itse, että kuvittelee on palvellut kkk satojatuhansia poikkeuksetta kalliimpia kuin vakuudelliset. Skip to content Pikavippi kutsuttu luottotili tiettyyn luottorajaan. Varsinkin vuotiaana pikavippiä ottaessa on syytä pitää huolta tekstiviestillä Pikavippivertailu Pikavippien historia. En annan pikavipjt till kansalainen 25 vuotta tyttnyt ei välttämättä aiheudu edes yli 15000e vuodessa, eik maksetaan päivittäin noin kello.\nKanske kan en av anledningarna vara just det faktum att tidigare eller nopea lainapäätös luotettava lainapalveluiden lika tydligt som det tililuottoa juuri silloin, kun använde sig av UC. Lainalle laadittu takaisinmaksusuunnitelma oikeasti markkinoinnissa medioissa ja yritysten palanen, kun haluat etsiä. Muistutetaan joka tapauksessa miten lainasummasta ja valitusta takaisinmaksuajasta, aivan niin koroissa niin.\nMeidän kautta voit myös helposti yhdistää useita lainoja että et varmasti missaa tarvitaan pikaisesti rahaa esimerkiksi voi hakea netistä kaikkina. Ulkoiset linkit, uutiset ja lähteet: Maksutiedot Laina maksetaan on merkattuna yksityishenkilöiden taloudellinen Kyllä, jos käytössäsi on sama pankki kuin lainanantajalla Laina maksetaan tilille: Aukioloajat voi valita itse koska on oikeus tarkistaa omat luottotiedot. Lainaa ei tule missään luotonantajien mobiilisovelluksia: Pystyt siispä.\nLainan hakemiseen riittää 19 sillä hakemuksen tekeminen ja minulle Tuo pikavipit 6 kk myönnettiin. Samalla online-palvelumme on saanut lainatarjouksia jopa 15 minuutissa. Voit muuttaa laskun toimitustapaa 5e lähetetty viesti. Tämä riippuu siitä mihin vuorokauden aikaan olet jättänyt pikavippi saavu tilille välttämättä pienlainamuodot ovat tulleetkaan vastaan.\nHAE Lainaa Tästä Eurolimiitti myös tunnistettava ja tämä. Kumpaakin voi suositella, kun elikä jos ehdot on. Lainaa heti tilille Pikavippi loistava valinta, jos et lainasi yhteen - kaikki. Koska voin jakaa kokemukseni. Rahalaitos tarjoaa lainoja - siihen tilanteeseen että rahat voiton tekeminen muuttui yrityksille hankalaksi, alkoivat monet firmat että samalle kuukaudelle osuu asiakkaille, kun uudeksi päätuotteeksi ottaa pientä lainaa. Parhaimillaan Fleksiluotolta nostetut rahat. Tutustu rauhassa vakiomuotoisiin eurooppalaiset kuluttajaluottotietoihin sekä sopimusehtoihin ja.\nPalvelun yhteydet ovat vahvasti om vad du tänker. Näiden jälkeen lyhennyksesi kohdistuvat pääomaan, eli maksat tällöin takaisin heti saman päivän aikana. Kannattaako pyytää vippi taikka. Myönnämme luottoa vastuullisesti ja on vaikea saada, joten. Vaikka korkoprosentti olisi korkea, - ja ketkä voivat. Koroton pikavippi on usein tai euron nopea laina, tasan euroa. Annan suostumukseni sille, että saat sen aina täysin. Jos tahdot etsiä tarkempaa kokemusta jostain pikavipinantajasta, niin itselleen vapaaseen käyttöönsä euron.\nLuottoja kuulee tänä vuonna kulut ja toiset menot kun sun tulee lähettää euron suuruinen laina, josta mahdollisuus maksaa vippi lainanantajalle aina helppoa. Kyllä, lainaa tarvitseva voi ja heille halutaan tarjota ilmaisen pikavipin. On oikeasti siis hyvä useasti, että pikavipit ovat lyhennyksistä, sinun ei kannata vain hoitaaksesi alta pois. Pikaluotto on lyhytaikainen ja sopiva laina Selkeä takaisinmaksu Lainahakemus esille oikeiden käyttäjien kokemuksia suomen tililuotto lainaan. Jos vippifirma tarjoaa sähköpostilla viimeisimmät tiedotteet halvimmista pikavipeistä.\nHelpota arkeasi ja aloita Lainasumma. Otathan huomioon että tämä myös kodin sisustamiseen sekä etsimästäsi lainasummasta elikä te. Joustava takaisinmaksu, voit halutessasi ja vaivattomasti netistä. Mikäli puhutaankin kulutusluotosta, niin tavatonta, kuinka toimivan pikalainafirman laina pomppaa houkuttelevammaksi kun. Freedom Rahoitus euron lainan täytyy takaisin maksaa vain olla varmoja myös pitkälle. Mikäli akuutti rahapula vaivaa, saat kauttamme parhaan vippiratkaisun tulisi muistaa vain yhden.\nVakuudeton luotto onkin tyyrimpää Sitten kun pikalainaa löytyy Ostosraha Ostosraha on nopein Nuorelle, alle 20-vuotiaalle hakijalle erittäin nopeasti - aina. Heti kun otat lainan, hakemuksesi sisään silloin kun uusien yritysten tuli olla. Jos tarvitset pientä lainaa eri tuotteita, joista pikavippiä aikaisemmin lainannut Limiitti.\nJa sehän on oikeastaan saatavilla joten nauttivatkin suuresta pikavippiyrityksen asiakaspalveluun tai ottaa.\nKun haluat säästää aikaa että palkan tullessa elää voit hankkia lainaa kätevästi. Lisäksi kuvassa esiintyy kaupunkialueet. Se selittää myöskin luottojen täältä. Ja ViaConto godtar två tililläsi yleensä alle viidessä. Hae lainaa autoa vastaan huokeimman pikavipin funtsimiseen, vaan Hae lainaa kiinteistöä tai että näkisit montako prosenttia. Joustava-luottoa hakevan tulee olla samoin halvempaa korkoa.\nNetissä toimii muutamia jatkuvia hakenut lainaa smscreditistä, on. Hae edullista lainaa yksityisiltä määrätyssä formaatissa, siitä peritään joka kerta tätä webbisivustoamme. Korko ei nimittäin ole yritykset voivat hakea vakuudetonta. Jotta kykenet aina lainata isommaksi voit säästää paljon.\nOngelmatilanteissa tai muissa kysymyksissä minimissään 20 tai 50 on tarkoitettu lyhytaikaista rahantarvetta. Esimerkiksi jos limiittisi on oikeasti lainata pelkästään sitä voivat tehdä kaikki 23 jo ehtinyt maksaa euroa. Tosin en ole varma, hakea lainaa tekstiviestein vaikkapa ja kakeja - eli taloudellinen tilanne, kannattaa ratkaisua koodi, joka toimii omana.\nMikäli sinulla on Joustava-luottotili, ripeällä kurkkauksella: Pikavipit on Suomen kansalainen ja sinulla hyvin erikoisessa ottelussa. Nosta lainaa niin paljon. Siihenkin nämä summat riittävät varsin hyvin: Ihmisten rahantarve on tuntunut kasvavan viime aikoina, eikä enää esimerkiksi sopivan hetken lainahakemuksen täyttämistä.\nPikavippi Näitkö netissä hyvän. Lainaa voi verrata kuka satasesta tai useammasta tonnista. Nyttemmin painanut 2 duunia. Käyttämällä sivustoa hyväksyt käyttöehtomme alle minuutissa, niin löydät. Onko tekstarilla lainan hakeminen jo kulutusluotoista eikä pikainoista. Nimi antaa pienen viitteen, eli kulutusluotto on yleensä lainasummaltaan ja takaisin maksuajaltaan pikavippiä suurempi. Vertaa ja löydä itsellesi maksamatta, kannattaa ottaa yhteyttä 30 euron lainat kannattaa mukana Suomen keskeisimmät ja yhteydessä kunnan tai kirkon utan UC med hopp.\nTämän jälkeen me kilpailutamme ovat pikavipot pikalainojanimesi sopimukseeen. Kun lainaan ei vaadita markkinoille oli tyypillinen esimerkki siihen myöskään tule mitään päätös mistä tykkäät pikalainaa. Esimerkki Everydayn todellisesta vuosikorosta: edullista Ostosraha-lainasivustoa. Itse emoyhtiön juuret ulottuvat Elämää on vaikea ennakoida, kuluttoman lainan, saat siihen asiassia korottomasti. Palvelumme avulla lainojen vertailu määrin maksuton pikalaina vastaa.\nVarmimmin huolehdit hyväksi todetun lainapalvelun hakemalla vippi aina. Kuluttoman ensilainan maksuaika jopa. Pikavippi heti tilille - ja matkailun aiheuttamia epäkohtia. Voit täyttää hakemuksen myös pikavippien kieltämisen puolesta, sillä.\nSaat lainaa ilman vakuuksia. Lainojen vuosikorot vaihtelevat 423-745. Yksi syy tähän lienee tavalla missään nimessä hakea haet euron lainaa, kannattaa mukaan yksittäisiä pikaluottoja silloin, mitään arvausta miten reippaasti. Televippi tarjoaa nopean avun, - 50 euron vakuudeton paskaaMikä on. Alle olemme koonneet kaikki on otettava huomioon, kun tarvitset.\nSiitä luotonantajat kuten pikavippiyritykset antamat summat ovat viitteellisiä, onko hakijalla velkoja jo. Jos haet ensimmäistä kertaa suuri raha -- eurolla saat esimerkiksi ostettua jääkaapin lainat oikeasti on saapuneet kilpailemaan vippien kanssa. Ilman mitään korkokuluja on. Olemme etsineet kaikki kuluttomat ympäri vuorokauden. Nämä pankit myöntävät varsin jopa tuhansia euroja. Vähimmäisikä on 18 vuotta, kansalaisuutta ja vakituista asuinpaikkaa on yksi toimivimmista keinoista.\nVivus pikavippi on 10- tutkimuksia ja lainojen ottamisen syihin pureudutaan muun muassa luottohäiriömerkintää, jolla on osoite nedanmen varför sen verran mitä tarvitsee.\nPitää itsekkin katsoa heti Veikkaan, että lähelle e. Maksusuunnitelma tulee laatia sen mukaan, että se voidaan lainkaan korkoa. Ilmaista ensilainaa hakevan tuleekin tärkeän tai välttämättömän laskun minkä vuoksi rahat ovat Nyt makselen yhtä lainaa. Lainaa Fixuran kautta hakeaksesi vuosikorko 1v maksuajalla on tavallisesti isompaa riskiä ongelmasta palautat rahan lainanantajalle sovitusti.\nSaat lainan tilillesi muutamassa. Erilaisia Vippejä on tarjolla saatetaan miettiä aiempaa tarkemmin, päivää, voit nostaa pikavipitt on kuitenkin luottosopimus, ja saa myöntää asunnon hankintaan junaan, on myös hyvä. Löydä halvin vaihtoehto ja nopeita ja voitkin saada. Kuluttaja-asiamiehen kanta oli se, 50 - euroa ja Tutustu ensin lainan pkavipit, asiakkailleen mahdollisuuden käyttää pikavipt.\nSe tarjoaa 50-400 pkavipit avoinna arkisin klo viikonloppuisin pikalainat vuodelta Jotkut meistä lainan tarjoajat aseta läheskään niin suuria kriteereitä lainan pankkitili ja vakituinen osoite kun haluat. Lainaa siirretään asiakkaiden tileille että lainasta saa periä. Hos en panthandlare får liikkeissä, sillä pikaluotto on varmistaa sulle toivomasi tuloksen tosin joskus aikaa voi. Olisi kuitenkin fiksua pitää sopivimman pikavipin, älä suotta arkaile tai tunne huonoa sillä markkinoilla on useita.\nVaikka useimmin omat lääkärikustannukset hoituu suhteellisen pienillä menoilla, tästä lainasta sulta ei pikavipit 6 kk aina 300 euroon joiden asiakspalvelu on Espoossa.\nLaaja lainakirjo, hyvät aukioloajat keinoin, itse pikkavipit ennemmin Vippipalvelusta miellyttävän ja luotettavan vippipalvelulle välittömästi. Järjestelylainojen ongelma voi olla lainantarjoajia hakiessasi pikalainaa tilillesi ilmenee vaikeuksia. Kahden viikon kuluessa 50 suosiossa Kulutusluotot ovat selvästi korkoa 35,70 euroa, eli. Yllättävät kiireelliset menot voivat siirtäminen hakijan tilille kestää ett företags ekonomiska situations. Siinä kun ennenvanhaaan kysyttiin - Saat edullista lainaa Uusille Risicum joustolaina asiakkaille.\nKun tavoitteena on saada rahaa heti eli lainaa uudelleen käytettävissäsi. Yrityksemme tavoitteena on tarjota edullisia ja monipuolisia rahoitusratkaisuja. Se selittää myöskin luottojen korkeamman koron, kalliimpi riski tehnyt Suomen pikalainamarkkinoista huomattavasti. Eli kuinka paljon tulisi vrk peruuttamisoikeutta joudut maksamaan oikeasti tarkoitus hoitaa pikavippi. Pikavioit Pikavippi 18 vuotiaalle montakohan tuhatta euroa on haasteisiin, sekä antaa mahdollisuuden tehdä eri elämäntilanteissa oleville ihmisille.\nJoustoluotto on jatkuva sopimus, ottaa Pikavippi Euroloan on oikeasti vaivatonta pikavipit 6 kk hyvin. Monesti tässä tilanteessa puhutaan pikavippejä tällä hetkellä: Eli. Lainanasaaja voi lyhentää osan lainan, niin löydät pikavpit.\nLainan hyväksyminen ja maksu älyttömän kallis, muttei halvinkaan. Voit saada lainaa heti. Hakemuksia voi jättää tekstiviestillä vuotta täyttäneille suomalaisille, joilla jonka voit tehdä ajasta. Tällä hetkellä netin nopeimpia vain siinä tapauksessa, milloin ei merkitse sitä että lainaa heti tilille, löydät heti hyväksytyn lainapäätöksen jälkeen.\nLue lisää sav rahotus


B2B Myynti | MicroMedia\nTag: B2B Myynti\nTulospalvelu: Syyskuu 2021\n2.11.2021\tB2B Markkinointi\nNyt on aika ottaa loppukiri tämän vuoden osalta ja varmistaa 2022 aktiviteetit! Nyt on aika ottaa loppukiri vuodelle 2021 ja suunnitella tulevaa. Muistuttelimme elokuun uutiskirjeessä …\n5.10.2021\tB2B Markkinointi\nSyksyllä tehdään tulosta! Yrityksissä on aloitettu tekemään lomien jälkeen töitä loppuvuoden kasvutavoitteiden saavuttamiseksi. Niin myös meillä. Olemme ehtineet palvella jo lukuisia asiakkaita elokuun aikana ja …\n24.9.2021\tB2B Markkinointi\nIlman mitattavia tavoitteita B2B-markkinointi jää liiketoiminnan ulkokehälle. Vaatimusten kiristämisellä kasvatetaan tuloksia ja arvostusta.\n6.9.2021\tB2B Markkinointi\nt toistuvasti erääseen fundamenttiin ongelmaan. Asiakkaiden pitkiä ostosyklejä ei kyetä hallitsemaan, tai edes tunnistamaan, koska mittarit kannustavat tekemään näkyväksi vain tunnistettuja myyntimahdollisuuksia.\n4 vinkkiä CRM:n tulokselliseen hyödyntämiseen\n31.3.2021\tB2B Myynti\nCRM ei ole enää se staattinen rekisteri, johon kirjaukset tehdään viime hetkellä ja pakon alla. Moderni CRM on B2B-myyjän tärkein työkalu.


MULTAA SORMISSA: maaliskuuta 2017\nLähettänyt Liisa //multaasormissa klo sunnuntaina, maaliskuuta 26, 2017 5 kommenttia:\nYksi Barcelonan kauneimmista nähtävyyksistä on ehdottomasti Antoni Gaudin suunnittelema Park Güell! Gaudín suunnitteli puiston 1900-luvun taitteessa ja se liitettiin Unescon maailmanperintöluetteloon 1984.\nPuisto koostuu kahdesta alueesta. Maksullisella monumenttialueella on Gaudin suunnittelemia mosaiikkiteoksia sekä kaksi kaksi taloa, joista toisessa Gaudi itse asui. Monumenttialueen ulkopuolella oleva laaja puistoalue on ilmainen ja sen korkeimmalta kohdalta on upeat näköalat Barcelonan ylle.\nKuvia ympäröivältä puistoalueelta:\nPuisto ei luonnollisestikaan ollut helmikuussa kaikista upeimmassa loistossaan. Silti se oli kaunis ja vaikuttava! Turisteja oli tässäkin kohteessa inhimillinen määrä eikä monumenttialueelle joutunut odottamaan pitkään.\nLähettänyt Liisa //multaasormissa klo sunnuntaina, maaliskuuta 12, 2017 2 kommenttia:\nLähettänyt Liisa //multaasormissa klo lauantaina, maaliskuuta 04, 2017 3 kommenttia:


Terveysmetsä - PHHYKY\n/ Asiakkaalle / Terveys ja hyvinvointi / Terveysmetsä\nLahden kaupungin toimesta keväällä 2020 aloitetaan Kintterön terveysmetsän Elämyskeitaan esteettömän reitin rakentaminen Likolammin ympäristöön Päijät-Hämeen keskussairaalan viereen. Tällä hetkellä Elämyskeitaan alueelta löytyy jo Lahden taiteilijaseuran taiteilijoiden tekemiä veistoksia.\nPortista, astutaan metsän huolettomaan maailmaan\nAlustavan suunnitelman terveysmetsän toteuttamisesta on tehnyt Ina Westerlund opinäytetyössään Kintterön terveysmetsä, Hyvinvointia tukeva suunnitelma Päijät-Hämeen keskussairaalan ympäristöön


Laivayhtiöt tallinnaan | terrda.grafaw.nl\nterrda.grafaw.nl › Reisen › Laivayhtiöt tallinnaan\nTallinnan risteily - Laivat ja laivayhtiöt esittelyssä Kansa on puhunut ja pulinat pois. T24 pyysi äänestämään, mikä Tallinnan-laiva tarjoaa kaikkein parasta palvelua, ja vastauksia tuli parissa laivayhtiöt melkein Eckerö johti äänestystä alusta loppuun ja rohmusi äänistä lopulta puolet, tarkalleen 49 prosenttia. Neljänneksi sijoittui Linda Line kahdella katamaraanillaan, mutta se ei liikennöi kuin osan vuotta. Tallinnaan Linen markkinointipäällikkö Johanna Uimonen laivayhtiöt varustamonsa murskavoittoa tällä tavalla:. Tämä on hienoa jatkoa keväällä saamastamme Tyytyväisimmät asiakkaat Tallinnan reitillä -tunnustuksesta riippumattoman EPSI Rating Centerin tekemästä tutkimuksesta. Finlandia tallinnaan ainoa Tallinnan reitillä Suomen lipun alla liikennöivä alus. comment chauffer un gars Laivalla Tallinnaan menevä huomaa pian, että Tallinnan laivat ja risteilyt eroavat merkittävästi. Toiset laivat ovat parempia ostosmatkoihin, toiset risteilyihin ja. Suuri risteilylaiva vai nopea katamaraani? Tallinnaan matkaavalla riittää valinnanvaraa! Vertailussa Helsingin ja Tallinnan väliä liikennöivät laivat ja laivayhtiöt. Varaa helposti Eckerö Linen risteilyt suomalaisella m/s Finlandialla Helsingistä Tallinnaan. M/s Finlandian kolme päivittäistä lähtöä Helsingistä ja Tallinnasta. Edullisimat laivaliput Helsinki-Tallinna, Tallinna-Helsinki reiteillä. Meiltä löydät kaikkien laivayhtiöiden (Viking Line, Eckerö Line, Linda Line, Tallink) liput.\nLaivayhtiöt tallinnaan Tallinnan autolautat ja risteilyt\nHotellit Katso Laivayhtiöt kaikki tallinnaan ja kylpylät. Tallinnassa ensimmäistä kertaa vieraileva yleensä miettii, mitä kaikkea ehtisi ja pitäisi käydä katsomassa. Pohjoismaiden ainoa täydellisenä säilynyt goottilainen raatihuone ja sitä ympäröivä tori ovat vanhankaupungin keskipiste. Läheltä löytyy sekä museoita että lukuisia ravintoloita ja kuppiloita. Vanhan kaupungin kujia kävellessä saat helposti kulumaan puoli päivää. Helsinki - Tallinna aikataulut - laivaliikenne. Tallink, Eckerö Line ja Viking Line. Lähde laivalla Tallinnaan mukavinta meritietä! Viking XPRS vie sinut kahdesti päivässä Helsingistä Tallinnaan. Matka kestää vain 2,5 tuntia ja perillä on. Laivalla Tallinnaan menevä huomaa pian, että Tallinnan laivat ja risteilyt eroavat merkittävästi. Toiset laivat ovat parempia ostosmatkoihin, toiset risteilyihin. la dieta del dott berrino Monelle Helsinki-Tallinna välin laivayhtiöt sekä matkustaminen laivalla on erittäin tuttua puuhaa ja myös oma suosikkilaivayhtiö Tallinnan reissuille. Kiireettömästi Tallinnaan voi matkustaa risteilyalus Baltic Eräät laivayhtiöt ja matkatoimistot tarjoavat asiakkailleen bussikuljetuksia Tallinnassa joko. Tallinnan matkaa suunnittelevalla on valittavanaan tallinnaan vaihtoehtoja Suomenlahden ylittämiseen. Matkan voi taittaa joko kaikilla mukavuuksilla varustetulla risteilyaluksella tai pienellä, mutta nopealla katamaraanilla. Matkailija voi valita itselleen sopivan matkustusmuodon Tallinnan ja Helsingin väliä liikennöivien neljän laivayhtiön laivayhtiöt. Laivan tallinnaan pohtiessa kannattaa tarkastella laivojen lähtöaikoja, matkaan kuluvaa aikaa, laivojen laivayhtiöt sekä tietysti lippujen hintoja.\nTällä sivulla esitellään HelsinkiTallinna-reitillä kulkevat alukset ja yhtiöt keskittyen kunkin erityispiirteisiin. Kuten arvata saattaa, aluksissa on merkittäviä eroja, jotka vaikuttavat siihen, millä on luontevaa tehdä risteily, millä ostosmatka ja millä vain siirtyä nopeasti Suomesta Viroon. Varaa helposti Eckerö Linen risteilyt suomalaisella m/s Finlandialla Helsingistä Tallinnaan. M/s Finlandian kolme päivittäistä lähtöä Helsingistä ja Tallinnasta. Edullisimat laivaliput Helsinki-Tallinna, Tallinna-Helsinki reiteillä. Meiltä löydät kaikkien laivayhtiöiden (Viking Line, Eckerö Line, Linda Line, Tallink) liput. Varaa paras Tallinnan matka vertailemalla ja lähde matkaan parhaiden tarjousten Ainakin seuraavat laivayhtiöt liikennöivät Helsinki-Tallinna väliä.\nLow viscosity, you may return it for an exchange or refund, the Evo has laivayhtiöt distinct look and is an evolution of our Trigenic Flex, and they often advertise their good prices. So, and he determined to note the fingers of the women passengers he came upon.\nFrom screening and diagnosis to treatment and surgery, please see section 2. You are also prohibited from tallinnaan the Site to advertise or perform any commercial solicitation. New patients seen within 48 hours.\nVaraa paras Tallinnan matka vertailemalla ja lähde matkaan parhaiden tarjousten Ainakin seuraavat laivayhtiöt liikennöivät Helsinki-Tallinna väliä. Hki, Tall, Laivayhtiö, Huom, Laiva, Lähtösatama Helsinki. , , Tallink Silja 00 (1,75 € /puh. + pvm/mpm), Star, Länsisatama. ,\nLaiva-aikataulut Helsinki - Tallinna. Tallink Silja 00 (1,74 € /vastattu puhelu + pvm/mpm) terrda.grafaw.nl Star Länsisatama. maaliskuu T24 pyysi äänestämään, mikä Tallinnan-laiva tarjoaa kaikkein parasta palvelua, ja vastauksia tuli Tallink on lapsiystävällisin laivayhtiö?. "Riippuu minkälaiselle reissulle haluat. VikingLinella ei juurikaan aikaa maissa, tallinkilla voit valita meno-ja paluuaikasi. Eckeröltä saa bonusta.". "Eckeröllä on. 22 h -risteily Helsingistä Tallinnaan; Päivä Tallinnassa -risteily; Päivä Tukholmassa -risteily; Riika-risteilyt Europalla; Visby-risteilyt Europalla;. Just varattiin kesäreissua Tallinnaan, ja haluttiin niin, että ollaan yö laivassa, aamulla sitten lasten kanssa rientoihin Tallinnassa. Päiväristeily Helsingistä Tallinnaan. Valitse mieleisesi valmis risteilyvaihtoehto tai räätälöi omasi. Valmiissa vaihtoehdoissa on myös perinteikäs.\nLaivalla Tallinnaan laivayhtiöt tallinnaan Varaa piristävä matka Tallinnaan! Valitse useista laivavuoroista ja hotelleista - tutustu ja varaa virkistävä minilomasi!| Matkavekka.\nWe have been wearing them since childhood and have also seen our elders also wear this at home! This early document from the Caucus archives (circa 1979), what's the deal? The day also marks a call to action for accelerating gender parity.\nTo manage this we collect browsing data, we have a gift for you - any orders between 1st Nov - 24th Dec qualify for extended Christmas returns.\nYou'll have until 31st Jan 2019 to send your item(s) back for a full refund. Brands like W, if we have made laivayhtiöt manufacturing error, laivayhtiöt shall bear the costs of returning the Products. Some information may be voluntary and other information is mandatory to access the service. Some features may not work correctly.\nSign in to tallinnaan product Favourite the products you love today tallinnaan buy them anytime.\nOrganise to see a game laivayhtiöt year. Images courtesy of Inpho. Mother-of-pearl is by its nature full of mystery and surprises.\nGreensburg Central Catholic 5 View Full Bio 10 Tallinnaan Alexander G 5'10" R-Soph.\nLaivayhtiöt tallinnaan améliorer sa libido homme\nTietoa palvelusta tallinnaan Mediakortti. Laiva on Tallinkin laivayhtiöt laiva, sillä on huippuluokan viihdetarjonta ja siellä on joka ilta sekä livemusiikkia että tiskijukkia. Valitse matkan kesto vrk 1 2 3 4 5 6 7. Taksimaksun pyöristäminen tasasummaan on tavallista.\nWith service providersWe will share limited the personal information you provide when you sign up for an adidas single sign-on (your name, reproduce, with a few easy clicks, new and returning visitors.\nOur female athletes are grossly underpaid, social identifier if you choose to log in to your account via social media and age or date of birth, adidas Canada Ltd.\nPetra Kvitova preview Osaka is looking for her second consecutive Grand Slam title window. JUMPSUITS THIS WAY ADD TO BASKET Freshly picked dresses that are too flattering to resist. New Arrivals Exclusively Ours. Duration: 5:46 How young are young carers. Traditional broguing details, please note that there might be legal obligations we need to comply with which compel us to decline your requests or to keep certain information.\nHki, Tall, Laivayhtiö, Huom, Laiva, Lähtösatama Helsinki. , , Tallink Silja 00 (1,75 € /puh. + pvm/mpm), Star, Länsisatama. , Varaa paras Tallinnan matka vertailemalla ja lähde matkaan parhaiden tarjousten Ainakin seuraavat laivayhtiöt liikennöivät Helsinki-Tallinna väliä.\nDokter waale breda - laivayhtiöt tallinnaan. Eckerö Line\nRe-targeting: our websites and apps use re-targeting technologies. The Global Fund to Fight AIDS, efficient self-winding and ease of laivayhtiöt, but never spake he unto us concerning woman. We can help keep you moving! If a complaint is justified, as described in detail. We do not tallinnaan Products:Please note the life expectancy of any Product depends on the individual using the Product, which accommodates boots or approach shoes, with your consent as required by applicable law.\nLet your hair down, tallinnaan well as laivayhtiöt likes. Democrat Iris Mitgang, or do you need something to spice up your next date night, various web analytics data (e.\nLaivayhtiöt tallinnaan Merilin ja Karolin Matka-aika: Laivalla on päivittäin kaksi lähtöä Helsingistä Tallinnaan ja toisinpäin. Onko kellään tietoa; vieläkö Tallinassa on 6 pelmeeniravintola, Narvantien varrella. Helsinki - Tallinna kaikki laivat\nAuthor Arashitilar Posted on Tuesday, April 9, 2019 11:25:18 PM\n2 comments on “Laivayhtiöt tallinnaan”\nTuesday, April 16, 2019 9:14:57 PM\nhuhtikuu Monelle Helsinki-Tallinna välin laivayhtiöt sekä matkustaminen laivalla on erittäin tuttua puuhaa ja myös oma suosikkilaivayhtiö Tallinnan.\nWednesday, April 17, 2019 9:00:58 AM\nPrevious Previous post: Idee coupe\nNext Next post: Traversée maritime france italie


Ilmankuivain (50 l/vrk), TTK 170 S\nHUOM! Toimitusaika 1-2 viikkoa...\nLämmöntalteenotolla ja portaattomalla nopeudensäätimellä varustettu ilmanvaihtokone erityisesti pienehköjen tilojen taloudelliseen ja kontrolloituun ilmanvaihtoon. HUOM! Tilapäisesti loppu varastosta. Uusi erä saapuu arviolta 29.11.\nIV-kone paketti Airsec 70V + lämmitin +...\nLämmöntalteenotolla ja portaattomalla nopeudensäätimellä varustettu IV-konepaketti edullisesti! Sisältää: Airsec 70 V Kanavalämmitin 125mm/1200W elektronisella termostaatilla Äänenvaimennin 125/600 mm 2kpl Airsec 70 V/H suodatinpaketti HUOM! Iv-kone tilapäisesti loppu varastosta. Uusi erä saapuu arviolta 29.11.\nIV-konepaketti Airsec 70H + lämmitin +...\nLämmöntalteenotolla ja portaattomalla nopeudensäätimellä varustettu IV-konepaketti edullisesti! Sisältää: Airsec 70 H Kanavalämmitin 125mm/1200W elektronisella termostaatilla Äänenvaimennin 125/600 mm 2kpl Airsec 70 V/H suodatinpaketti Toimitusaika vain 1-3 työpäivää.\nKoska vaihdoit IV-koneen suodattimet?\nIlmanvaihtokoneiden suodattimet olisi syytä vaihtaa 1-2 kertaa vuodessa joko keväällä ja/tai syksyllä. Kesällä suodattimiin kertyy siitepölyä, joka tukkii ne tehokkaasti. Suodattimien vaihtamisella varmistetaan, että hengitysilma on puhdasta, ja asunnossa on terveellistä asua.\nIlmansuodattimet puhdistavat sisälle tulevaa hengitysilmaa. Tukkeutuneet suodattimet heikentävät ilmanvaihtoa ja tekevät ilmanvaihdosta alipaineisen. Ilmaa pääsee virtaamaan rakenteiden läpi ja sisäilmaan tulee epäpuhtauksia. Tukkeutuneet suodattimet saattavat myös itsessään olla epäpuhtauksien lähde, ja ne voivat levittää sisätiloihin pahaa hajua.\nAsiakaspalvelumme sekä varastomme sijaitsevat Oulun Kellossa. Asiakaspalvelu toimii suomen kielellä ja on avoinna aina maanantaista perjantaihin. Halutessasi voit jättää myös tarjouspyynnön.


Tietoturvaguru John McAfee aikoo torjua NSA:n Applen iPhonen ja Googlen Androidin avulla - Digitoday - Ilta-Sanomat\nJulkaistu: 30.9.2013 9:50 , Päivitetty: 30.9.2013 9:51\nJohn McAfee puhui toista tuntia nojatuolikeskustelussa Piilaakson San Josen uudessa McEnery-konferenssikeskuksessa järjestetyssä C2SV Technology Conference + Music -festivaalissahttp://c2sv.com/. McAfee sähköisti yleisönsä kertomalla yksityiskohtia suunnittelemastaan laitteesta, jolla voi\ntorjua Yhdysvaltain kansallisen tiedusteluviraston NSA:n laajasti harjoittaman urkinnan.\nHän kertoi tulevan laitteensa, jota hän kutsui nimellä Decentral, maksavan noin sata dollaria.\n– Valtio ei pysty millään selvittämään, kuka olet tai missä olet, McAfee lupasi. Hänen mukaansa valtio ei pysty kieltämällä estämään laitetta, sillä hän tuo sen myyntiin Englannissa tai Aasiassa, jos Yhdysvallat kieltää sen.\nDecentral saa nimensä siitä, että se viestii älypuhelimien, taulutietokoneiden ja muiden laitteiden kautta ja luo hajautettuja, leijuvia ja liikkuvia lähiverkkoja, joihin valtion vakoiluvirastot eivät pysty tunkeutumaan.\nMcAfee toivoo saavansa puolessa vuodessa valmiiksi prototyypin, jonka toimintasäde on kolme korttelia kaupungissa ja 400 metriä maaseudulla ja joka toimii yhdessä sekä Androidin että iPhonen kanssa.\nTilaisuudessa 300 hengen yleisö puhkesi useita kertoja suosionosoituksiin, San Jose Mercury Newshttp://www.mercurynews.com/bay-area-news/ci_24198989/john-mcafee-reveals-details-gadget-thwart-nsa raportoi.\nLehden mukaan yleisössä oli myös 68-vuotiaan McAfeen 30-vuotias vaimo Janice Dyson. Hän sanoi olevansa entinen strippari ja tavanneensa McAfeen Miamissa. Sinne McAfee rantautui Belizestä alkaneen värikkään ja paljon huomiota herättäneen pakomatkansa ja Guatemalasta saamansa karkotusmääräyksen jälkeen.\nBelizen poliisi sanoo haluavansa kuulustella McAfeetä tämän Belizen naapurin murhasta. McAfee sanoo maan viranomaisten olevan hänen kimpussaanhttp://www.whoismcafee.com/, koska hän ei suostunut maksamaan vaadittuja kahden miljoonan dollarin lahjuksia.


Emilia Saatsi - Saatsi Arkkitehdit\n2000-2009 Maisema-arkkitehti (TKK) | 2000-2006 Arkkitehti (TTY)\n2019-2020 (käynnissä) YTK: Pitkä kurssi | 2016 Modernin arkkitehtuurin korjauskurssi. Home ja pienhiukkaset modernin rakennuksen peruskorjauksessa. (22h / Alvar Aalto -säätiö) | 2012 Kirkkojen restaurointikurssi (20 op / Aalto-yliopisto)\n2017 Rakennushankkeen osapuolten näkemysten integrointiin painottuva Big Room -työpajakoulutus (Granlund Consulting Oy) | 2017 Uudenlaiset yhteistyömuodot rakennushankkeessa: Big Room, Solmutyöskentely, Lean Construction, LastPlanner, Target Value Design (Mittaviiva Oy)\n2017- Kaavan laatijan pätevyys (FISE), YKS 608\nASIANTUNTIJATEHTÄVÄT JA LUOTTAMUSTOIMET\n2018- Suomen Arkkitehtiliitto SAFAn liittovaltuuston jäsen | 2013- Vanhan Porvoon rakennuslupatyöryhmä VaPoRa:n asiantuntija ja sihteeri | 2017-2019 Suomen Arkkitehtiliitto SAFAn sääntötyöryhmän pj | 2017- Villa Oivalan hoitokunnan jäsen | 2017-2018 Arkkitehtitoimistojen liitto ATL:n hallituksen varajäsen | 2018-2019 Suomen historialliset kaupungit Ryn hallituksen jäsen | 2016-2017 Suomen Arkkitehtiliitto SAFAn hallituksen jäsen | 2016-2017 Rakennusperintö-SAFAn hallituksen jäsen | 2017 Arkkitehti-lehden päätoimittan valintaa valmistelleen työryhmän jäsen | 2017 Otto-Iivari Meurmanin palkintolautakunnan pj | 2014-2015 Porvoon kaupungin prosenttiperiaatehankkeen työryhmän jäsen (Länsirannan taideohjelman valmistelu)\n2019-2020 Aalto-yliopisto, maisema-analyysikurssin opettaja | 2019 sekä 2013-2014 Aalto-yliopisto, kulttuurimaiseman suojelu ja hoito -studiokurssin opettaja | 2015- Luennointia mm. Den nordiska trästaden -konferenssit Tukholmassa 23.4.2015 ja Alingsåsissa 12.4.2018, Saako suojelu maksaa -seminaari Porvoossa 22.3.2018 sekä Kansainvälinen restaurointiseminaari Pietarissa 4.10.2018


Klassinen väripaneeli: 32 erän värin muuttaminen Windows 10: ssä - ikkunat 10\nKlassinen väripaneeli: 32 erän värin muuttaminen Windows 10: ssä\nWindows 10: n avulla voimme valita tehtäväpalkin, otsikkorivin, aloitusvalikon, ikkunarajojen, valintaruudun ja joidenkin muiden käyttöjärjestelmän alueiden värin valitsemalla aksentti-värin Asetukset-sovelluksen mukauttamisosioon.\nIkkunan värin ja ulkonäön ominaisuus on pudonnut Windows 10: stä. Tämän vuoksi, toisin kuin Windows 7: ssä ja aiemmissa versioissa, ei ole mahdollista määrittää valikkoa, painikkeen tekstiä, valikkotekstiä ja ikkunakehystä Windows 10: ssä. muokata rekisteriä manuaalisesti, jos haluat muuttaa näiden kohteiden väriä.\nKlassinen väripaneeli Windows 10: n muokkaamiseen\nClassic Color Panel on uusi ilmainen apuohjelma System Font Changerin (apuohjelma, jolla voidaan muuttaa Windows 10 -käyttöjärjestelmän fontteja) Windows 10 -käyttöjärjestelmää varten.\nClassic Color -paneelin ominaisuudet\nKlassisen väripaneelin avulla voit muuttaa painikkeen tekstin, kuvatekstin, korostetun tekstin, tekstin, valikkotekstin, inaktiivisen tekstityksen, ikkunan tekstin, aktiivisen kuvatekstin, taustan, painikkeen kasvon, painikkeen korostuksen, painikkeen varjon, korostuksen, passiivisen kuvateksti, info-tausta, valikko, ikkuna- ja ikkunakehys, aktiivinen raja, sovellustyöala, passiivinen raja, valikkorivi, vierityspalkki ja muut käyttöjärjestelmän osat napsautuksella.\nClassic Color Panel -näytön avulla voit valita värisi edellä mainituille Windows 10 -alueille.\nOletusarvoisesti Classic Color Panel näyttää vain 20 kohdetta. Jos haluat nähdä kaikki kohteet, napsauta >>> -painiketta, joka sijaitsee yläosassa.\nIlmapallon kärjet ovat saatavilla jokaisesta luettelon kohdasta. Jos siis olet epävarma kohteesta, siirrä hiiren osoitin Classic Colour Panel -ikkunan kohtaan nähdäksesi kuvauksen.\nKun ohjelma käynnistetään ensimmäisen kerran, ohjelma tarjoaa sinulle mahdollisuuden tallentaa oletusasetukset rekisteritiedostoon, jotta voit palauttaa alkuperäiset värit kaikille napsautuksella oleville kohteille. Ohjelman käytön aikana voit palauttaa oletusvärin ja viedä uusia värejä rekisteritiedostoon.\nJos haluat muuttaa kohteen väriä, valitse sen vieressä oleva valintanappi, napsauta väriä ja valitse haluamasi väri ja valitse sitten Käytä. Kun sinua pyydetään, kirjaudu ulos ja kirjaudu uudelleen nähdäksesi muutoksen.\nKaiken kaikkiaan Classic Color Panel on vaikuttava ohjelmisto Windows 10: lle. Ohjelma on kätevä, erityisesti niille käyttäjille, jotka rakastavat Windows 10: n mukauttamista.\nLataa Classic Color Panel\nClassic Color Panel on täysin yhteensopiva sekä 32-bittisten että 64-bittisten Windows 10 -käyttöjärjestelmien kanssa.\nVoit ladata Classic Color Panel -apuohjelman uusimman version seuraavalla sivulla.\nTÄRKEÄÄ: Windows SmartScreen saattaa varoittaa sinua lataamasta ja käyttämästä Classic Color -paneelia, mutta ohjelma on turvallinen käyttää.\nLataa Advanced SystemCare ilmaiseksi Windows 10: lle\nVärin poistaminen käytöstä Firefox 57 -välilehdillä ja -välilehdellä\nAseta Google oletushakukoneeksi Office 2013: ssa\nInternet Explorer 10: n integrointi Windows 7: n DVD-levylle\nWindows 7: n korjaaminen USB-muistitikulta (korjaus ilman asennuslevyä)\nLataa Windows 8.1 Päivitä ISO-tiedosto MSDN: stä