Crohnin tauti ja Faecalibacterium prausnitzii -bakteeri suolistotulehdusmalleissa hiirillä - PDF\nCrohnin tauti ja Faecalibacterium prausnitzii -bakteeri suolistotulehdusmalleissa hiirillä\nDownload "Crohnin tauti ja Faecalibacterium prausnitzii -bakteeri suolistotulehdusmalleissa hiirillä"\n1 Helsingin Yliopisto Eläinlääketieteellinen tiedekunta Peruseläinlääketieteenlaitos/ mikrobiologia Institut national de la Recherche Agronomique (INRA) Centre de Jouy-en-Josas Unité d Ecologie et de Physiologie du Système Digestif (UEPSD) Bâtiment 440 Domaine de Vilvert Jouy-en-Josas cedex Elina Hirvonen Eläinlääketieteen lisensiaatin tutkielma Crohnin tauti ja Faecalibacterium prausnitzii -bakteeri suolistotulehdusmalleissa hiirillä Harjoittelun johtaja: Philippe LANGELLA, Airi PALVA Työnohjaajat: Airi PALVA, Harry SOKOL 2009\n2 1 TIIVISTELMÄ Tutkimamme bakteeri, Faecalibacterium prausnitzii kuuluu terveen aikuisen ihmisen normaaliin suoliston mikrobistoon yhtenä sen runsaslukuisimmista edustajista. Crohnin taudissa, johon liittyy suoliston mikrobiston epätasapainoa (dysbioosi), Clostridium leptum -ryhmään kuuluvan F. prausnitzii -bakteerin määrän on havaittu olevan normaalia alhaisempi. Kahdessa eri tutkimuksessa tavoitteenamme oli selvittää, miten F. prausnitzii -bakteerin tai sen aineenvaihduntatuotteiden tuominen ennakoivasti eläimeen vaikuttaa tulehduksen kulkuun ja vakavuuteen, sekä toimiiko hoito myös suolesta riippumatonta reittiä (intraperitoneaali-injektio) käyttäen. Mallintamiseen käytettiin trinitrobentseeni sulfonihappo- (TNBS) suolistotulehdusta hiirillä. Sekä Faecalibacterium prausnitzii -bakteerin että sen aineenvaihduntatuotteita sisältävän kasvuliuoksen (supernatantti) osoitettiin hillitsevät tulehdusta TNBStulehdusmallissa hiirillä. Käyttämiemme tulehduksen arvosteluperusteiden mukaan molemmat hoidot näyttivät edesauttavan normaalin terveydentilan saavuttamista. Ne hillitsivät esitulehduksellisten sytokiinien tuotantoa sekä vaikuttivat suotuisasti suolenontelon mikrobilajiston tasapainoon koehiirten suolistotulehduksessa. Supernatantti myös lisäsi tulehdusta lievittävän interleukiinin, IL-10 tuotantoa Hoidot tehosivat myös sovelletussa TNBS-mallissa intraperitoneaaliruiskeena: hoidettujen hiirten kuolleisuus väheni kontrolliryhmiin nähden merkittävästi. Näin ollen bakteerin tai siitä valmistetun supernatantin ei tarvitse olla suolenontelossa vaikuttaakseen tulehdusta hillitsevästi. 2\n3 2 AVAINSANAT Crohnin tauti (CD), tulehduksellinen suolistosairaus (IBD), suolistomikrobisto, Faecalibacterium prausnitzii (A2-165) 3 ALKUSANAT Harjoittelupaikkani varmistuessa Ranskan kansallisessa agronomisessa tutkimuslaitoksessa (L Institut national de la recherche agronomique, INRA) lähellä Pariisia, olin sekä riemastunut että kauhuissani. Syventävien opintojen jakso muuttui pakollisesta suorituksesta kertaheitolla joksikin mitä todella odottaa. Vaikka ulkomaille lähtö oli kutkuttava ajatus, olin toisaalta lähdössä johonkin täysin tuntemattomaan enkä tiennyt aihealuetta lukuun ottamatta projektista tai tulevista tehtävistäni yhtään mitään. Kielitaidon parantamisen ollessa yksi merkittävistä kannuksista lähteä, unohtuneet taidot myös huolettivat suuresti. Kaikki on kuitenkin mennyt niin hyvin kuin vain olen voinut toivoa. Olen työstänyt tätä projektia kolmesta eri näkökulmasta: tutkijaharjoittelijan, eläinlääketieteen opiskelijan ja potilaan. Tämä projekti on ensimmäinen kosketukseni tieteen maailmaan. Olen ensisijaisesti yrittänyt sisäistää mitä on hyvä tieteen harjoittaminen, opetella ajattelemaan kriittisesti ja tekemään päätelmiä sen pohjalta, mitä tiedän. Olen oppinut, että innovatiivisuus on eteenpäin vievä hyve, mutta kaiken tulee perustua olemassa olevaan tietoon eikä johtopäätöksiä voi toisaalta tehdä miten tahansa. Olen saanut harjoittelujaksoni aikana hyvän kuvan siitä, mitä tiede voi pahimmillaan tai parhaimmillaan olla. Melko kattavasti muiden tekstejä lueskellessani olen saanut jonkinlaisen käsityksen siitä, miten ja millaisia tieteen keinoja voi valjastaa erilaisiin tarkoituksiin tänä päivänä ainakin tällä yhdellä saralla ja miksi ylipäänsä tehdään tutkimusta, joka asiaan perehtymättömälle ihmiselle saattaa vaikuttaa 3\n4 merkityksettömältä. Olen kuitenkin oppinut myös sen, että kaikkeen ei saada vastauksia ja tieteellä on aina myös rajansa. Ensisilmäyksellä saattaa ihmetyttää mitä tekemistä eläinlääketieteen opiskelijalla voi olla täysin humaanilääketieteeseen kallistuvassa projektissa. Jos henkilökohtaisen kiinnostuksen jättää pois, jää edelleen tiede ja tieto: myös eläimillä tavataan tulehduksellisia suolistosairauksia ja niiden määrät ovat kasvussa. Valitettavasti aika, sivut ja energia loppuivat ennen kuin ehdin vertailla ihmisen ja eri eläinlajien IBDtiloja, kuten alkujaan oli tarkoitus. Matkan varrella tuli kuitenkin hieman vilkuiltua artikkeleita, joita on tehty eläinpuolella ja työskentely humaanipuolen tieteen tarkkaan kartoitetussa maailmassa herätti useita kysymyksiä, mm: Onko eläinten tulehduksellisista suolistosairauksista tehty minkäänlaista epidemiologista kartoitusta (pl. rotualttius)? Onko mahdollisia riskitekijöitä, kuten omistajan tupakointia koskaan selvitetty? Kuinka paljon yhtenevyyksiä ja eroja eri eläinlajien ja rotujen IBD-tiloista löytyy onko kyse täysin eri taudeista (kuten naudan Johnen tauti eli paratuberkuloosi todennäköisesti on), vai saman taudin eri ilmentymistä? Voisiko lopulta yhden lajin tutkimuksesta vetää johtopäätöksiä muiden lajien sairauksiin? Miksi kaikilla eläinlajeilla, muun muassa jyrsijöillä, ei tavata IBD-tiloja luonnostaan? Resursseja eläinmaailman tutkimukseen ei löydy samoin kuin humaanipuolelle, ja mm. siksi eläinlääketieteellinen tutkimus ei monessa yllä samalle tasolle. Eri lajien samankaltaisten sairauksien tutkiminen saattaisi kuitenkin hyödyttää kaikkia osapuolia. Esimerkiksi paratuberkuloosin saastuttaman lypsykarjanavetan kissoista, jotka tutkittiin, ei löydetty IBD-muutoksia, vaikka Mycobacterium paratuberculosis voitiin eristää (Palmer ym. 2005). Kun kyseinen bakteeri ei kissalla välttämättä johda IBD:n syntyyn, voisiko johtopäätöksiä vetää muihin eläinlajeihin tai ihmiseen? Työskentely tämän projektin parissa on varmasti ollut hyödyllinen tulevaa ammattiani ajatellen, ja varsinkin eettisen ajattelun kehittymiselle eduksi nähdä elävillä eläimillä toteutettavia kokeita ja myös osallistua niiden toteuttamiseen itse. 4\n5 Potilaana olen tyytyväinen, että olen pystynyt lisäämään yleissivistystäni sairaudestani ja minulla on nyt paljon uutta tietoa aihepiiristä: olen elänyt diagnoosini kanssa pari vuotta tietämättä taudista juuri mitään, vaivautumatta ottamaan selvää. On ollut kiehtovaa tutustua omakohtaiseen aiheeseen ja etsiä syitä kysymykseen miksi juuri minä. Vaikka tiedemaailmakaan ei vielä tunne vastauksia moneen mieltäni askarruttavaan kysymykseen, on hyvä olla perillä siitä mikä saattaa odottaa tulevaisuudessa ja kohdata se ilman sen suurempaa paniikkia. Onneksi lähdin tälle matkalle: Se on riskillä ruma, mutta onneksi kaunis on ihan yhtä todennäköinen vaihtoehto. Elina Hirvonen 5\n6 SISÄLLYSLUETTELO 1 TIIVISTELMÄ AVAINSANAT ALKUSANAT LYHENTEIDEN JA MERKKIEN SELITYS JOHDANTO kirjallisuuskatsaus aiheesta Mikä on Crohnin tauti yleiskatsaus Crohnin taudin epidemiologiaa Tulehduksellisten suolistosairauksien esiintyvyys ja ilmaantuvuus Tulehduksellisille suolistosairauksille altistavat isäntätekijät Ympäristötekijät Tulehduksellisten suolistosairauksien etiologiasta ja patofysiologiasta Genetiikka Elimistön puolustusjärjestelmän epätasapaino Suolistomikrobisto Kokeellisessa osuudessa käytetty hiirimalli TNBS-malli KOKEELLINEN OSUUS Projektin tavoitteet Aineisto ja menetelmät Eläimet Bakteeri Supernatantti TNBS-tulehdusmalli Sytokiinien määritys ELISA-menetelmällä Ulosteen mikrobilajien määritys Tilastokäsittelyt Tulokset ja johtopäätökset TNBS-malli I: koe nro TNBS-malli II YHTEENVETO KIITOKSET JA ERI TEKIJÖIDEN OSUUDET\n7 9 VIITELUETTELO LIITTEET\n8 4 LYHENTEIDEN JA MERKKIEN SELITYS AIEC APC ASA ASCA CD CDAI EFCCA IBD IL INF- MAP MDP NF- B NLR NOD PBS PCR PGN T h T reg TLR TNBS TNF- UC takertuva ja tunkeutuva Escherichia. coli (adherent-invasive E coli) antigeeniä esittelevä solu (antigen presenting cell) asetyylisalisyylihappo anti-saccharomyces cerevisiae vasta-aine Crohnin tauti (Crohn s disease) Crohnin taudin aktiivisuusluku (Crohn s disease activity index) European Federation of Crohn s & Colitis Association tulehduksellinen suolistosairaus (inflammatory bowel disease) interleukiini interferoni Mycobacterium avium subsp paratuberculosis muramyylidipeptidi tulehduksen välittäjäaineiden tuotantoon tarvittava transkriptiotekijä synnynnäisen puolustuksen reseptoriperhe (Nod like receptor) eräs synnynnäisen puolustuksen reseptori fosfaattipuskuroitu suolaliuos (phosphate buffered saline) polymeraasi ketjureaktio (polymerase chain reaction) peptidoglykaani T-auttajasolu säätelijä T-solu synnynnäisen puolustuksen reseptoriperhe (Toll like receptor) trinitrobentseeni sulfonihappo (trinitrobenzene sulfonic acid) tumor necrosis factor haavainen paksusuolentulehdus (ulcerative colitis) 8\n9 5 JOHDANTO kirjallisuuskatsaus aiheesta Tulehduksellisiin suolistosairauksiin (engl. inflammatory bowel disease, IBD) luetaan perinteisesti Crohnin tauti (engl. Crohn s disease, CD) sekä haavainen paksusuolentulehdus (engl. ulcerative colitis, UC). Molemmat ovat kroonisia ja eteneviä tautitiloja ja muistuttavat toisiaan siinä määrin, että niiden erottaminen toisistaan saattaa olla vaikeaa. Etenkin Crohnin taudin esiintyvyys, joskin myös diagnosointi, on vähitellen lisääntynyt ympäri maailman. Viime vuosikymmenten aikana näiden tautien syntymekanismeja ja kehittymistä on opittu ymmärtämään paremmin, mutta täydellistä käsitystä kummankaan luonteesta ei ole vielä onnistuttu saamaan. Tautiherkkyyden taustalla on monia tekijöitä, ja se mikä lopulta ratkaisee jommankumman tautitilan puhkeamisen, on toistaiseksi hämärän peitossa. 5.1 Mikä on Crohnin tauti yleiskatsaus Crohnin tauti on tulehduksen ruoansulatuskanavaan aiheuttava sairaus, joka voi ilmetä missä tahansa suusta peräaukkoon, mutta yleisimmin se tavataan ohutsuolen loppuosassa (n. 30 %), paksusuolesta (n. 30 %) tai molemmista (n. 40 %) (Corman 2005). Taudin esiintyminen Suomessa on karkean arvion mukaan yhden promillen luokkaa (Niemelä ym. 2005) ja useimmiten siihen sairastuvat nuoret aikuiset (Niemelä ym. 2005, Loftus ym. 1998), mutta murrosikäisten ja lapsipotilaiden määrä on lisääntymässä (Targan ym. 2003). Syytä tulehduksen syntyyn ja sen jatkumiseen ei tiedetä. Crohnin taudin kulku vaihtelee potilaskohtaisesti. Taudin kuvaan kuluu useimmiten ruoansulatuskanavan oireita, kuten ripulia, mahdollisesti myös verta ulosteessa, vatsakramppeja ja -kipuja (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003). Toisinaan nähdään lisäksi yleisoireita, esimerkiksi laihtumista, väsymystä sekä ajoittaista kuumeilua (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003). Ruoansulatuskanavan ulkopuolisia oireita (mm. ihon, silmien, nivelien) esiintyy myös (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003). Patologiset muutokset ovat tyypillisesti paikallisia ja rajoittuneita. Ne esiintyvät pälvinä terveellä limakalvolla (Kuva 1) (Targan ym. 2003). Suolen seinämä on paikoittain paksuuntunut, punoittava ja turvonnut (Targan ym. 2003). Haavaumat, jyväiskasvamat 9\n10 (granulooma), halkeamat sekä paiseet, joiden ulottuvuus vaihtelee suolen limakalvolta syvälle sen seinämään, ovat melko tavallisia (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003). Pahimmillaan muutokset voivat porautua sairastuneen suolen seinämän läpi toiseen suolen osaan, elimeen tai ulos iholle asti (fistelimuodostus) (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003). Myös ahtaumia voi muodostua muutosalueille (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003), jolloin ruoansulatuskanavan tukkeutumisen riski on olemassa (Corman 2005) Kuva 1. Endoskooppinäkymä Crohnin taudin haavaumasta paksusuolessa. Kuva: Endoscopic images copyright Atlanta South Gastroenterology P.C. Tyypillistä on vaihtelevan pituisten aktiivisten (relapsi) ja hiljaisten jaksojen (remissi) vuorottelu. Sairaus etenee aktiivisissa vaiheissaan. Taudin vaihe määritetään aktiivisuuslukuna (CDAI, Crohn s disease activity index), joka huomioi erilaisten oireiden määrän ja vakavuuden (LIITE 1) (Best ym. 1976). Aktiivisuuslukua käytetään erityisesti tutkimuksessa. Potilaan katsotaan olevan hiljaisessa vaiheessa, jos luku on <150, sairaus on keskivaikea välillä ja vaikea ollessaan tämän yli (Best ym. 1976). Crohnin tauti itsessään on harvoin kuolemaan johtava, mutta voi alentaa elämänlaatua (Targan ym. 2003). Molempiin tulehduksellisiin suolistosairauksiin liittyy myös kohonnut syöpäriski, erityisesti paksusuolessa (Targan ym. 2003), ja potilailla on keskimääräistä useammin myös autoimmuunisairauksia (Targan ym. 2003). Crohnin taudin määrittäminen voi olla ongelmallista pelkästään oireiden perusteella. Diagnoosi nojaa tällä hetkellä potilaan historian ja kliinisten oireiden lisäksi tähystykseen sekä sen yhteydessä otettujen kudosnäytepalojen histologiseen arvioon (Niemelä ym. 2005) mikroskoopilla; muutosten tunnistaminen paljaalla silmällä on hankalaa, eikä kaikkia muutoksia näin nähdä. Kudosleikkeet ovat usein myös ainoa keino tehdä erotusdiagnoosi IBD-tilojen välillä (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003). 10\n11 Hoito nojaa tällä hetkellä säännöllisten lääkärikäyntien ja tähystysten lisäksi lääkehoitoon (Niemelä ym. 2005). Tähystyksissä ei selvitetä ainoastaan Crohnin taudin tilannetta vaan suolta on hyvä tarkkailla myös syöpämuutosten varalta (Niemelä ym. 2005). Parannuskeinoa ei ole, mutta hyvällä hoidolla, järkevillä elämäntavoilla ja sopivalla lääkityksellä tauti voi pysyä hiljaisena (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003). Kuitenkin n. 70 % potilaista päätyy kirurgin pöydälle viimeistään 10 vuoden kuluttua diagnoosista, ja hoitotoimenpide joudutaan usein uusimaan myöhemmin (Bernell ym. 2000). Perinteinen lääkitys on tulehdusta hillitsevä tai puolustusjärjestelmää lamaava. Taudin aktiiviset jaksot taltutetaan yleensä kortikosteroidein jatkuvan lääkityksen rinnalla, joka usein pohjautuu 5-ASA-valmisteisiin (mesalatsiini) sekä hankalammissa tapauksissa atsatiopriiniin johdannaisineen (Niemelä ym. 2005). Antibiooteista häiriön hoidossa on suhteellisen vähän ja ristiriitaisia tutkimustuloksia (Marteau ym. 2003). Tällä hetkellä työn alla on uusien, tehokkaampien ja vähemmän haitallisten hoitomuotojen kehittäminen; tavoitteena on puolustusjärjestelmän puutteiden korjaus, sen toiminnan palauttaminen ja parantaminen sekä aktiivisen tulehduksen, kudostuhon ja epiteelisuojan häiriön vähentäminen (Strober ym. 2007). Uusimmat lääkkeet kohdistuvat esimerkiksi tulehduksen välittäjäaineisiin (anti-tnf, anti-il-12p40) (Niemelä ym. 2005, Targan ym. 2003). 5.2 Crohnin taudin epidemiologiaa Tulehduksellisten suolistosairauksien esiintyvyys ja ilmaantuvuus Tulehduksellisten suolistosairauksien esiintymisellä on keskenään vahva yhteys. Tautien esiintyvyys (prevalenssi) vaihtelee paljonkin maantieteellisen sijainnin mukaan. Lähes kaikkialla haavaista paksusuolentulehdusta esiintyy Crohnin tautia enemmän, ja sen esiintyvyys on yleensä vuotta Crohnin tautia edellä. (Targan ym ) Taudit ovat keskittyneet, etenkin aiemmin, tyypillisesti pohjoisiin ja kehittyneisiin teollisuusmaihin, kuten Pohjoismaihin ja Brittein saarille sekä Pohjois-Amerikan 11\n12 pohjoisiin osiin (Niemelä ym. 2005, Shivananda ym. 1996, Targan ym. 2003). Nykyään selvemmät esiintyvyyserot näyttävät kehittyneen lännen ja idän välille (Targan ym. 2003). Kanadassa on raportoitu eniten Crohnin tautia maailmassa ja koko väestöstä arvellaan peräti 0,5 % sairastavan tulehduksellisia suolistosairauksia: ilmaantuvuus vaihtelee välillä 8,8 20,2/ asukasta Crohnin taudissa (esiintyvyys / ) ja 9,9 19,5/ haavaisessa paksusuolentulehduksessa ( / ) (Bernstein ym. 2006). Vielä 1900-luvun vaihteessa tulehdukselliset suolistosairaudet olivat harvinaisia eikä niitä oikein tunnistettu (Targan ym. 2003). Ensimmäiset arviot esiintyvyydestä, niin Euroopassa kuin Yhdysvalloissa, on tehty vasta 1930 luvulla (Targan ym. 2003). Toisen maailmansodan jälkeen sekä tautien ilmaantuvuus (insidenssi) että myös sairaiden kokonaismäärä nousivat korkean esiintyvyyden maissa merkittävästi aina 1980-luvulle saakka (Loftus ym. 1998, Targan ym. 2003). Tämän jälkeen insidenssi on alkanut tasaantua näillä alueilla (Loftus ym. 2007, Targan ym. 2003), mutta kasvaa entistä enemmän mm. Etelä-Euroopassa, Afrikassa, Aasiassa ja Etelä-Amerikassa, joissa IBD:n esiintyminen on aiemmin ollut harvinaisempaa (Loftus ym. 2004, Shivananda ym. 1996). European Federation of Crohn s & Colitis Association -järjestön, EFCCA:n tilaston mukaan EFCCA:n jäsenmaiden vuoden 2006 tautimääristä arvioituna, tulehduksellisista suolistosairauksista kärsiviä ihmisiä on Euroopan alueella karkeasti 2,3 miljoonaa ja Crohnin tautia sairastavia noin miljoona. (EFCCA 2007.) Tilanne Suomessa Kansaneläkelaitoksen (Kela) vuoden 2007 sairausvakuutustilaston mukaan väestöstä 5,7 eli henkilöä, sairasti tulehduksellista suolistosairautta ( ). Tulehduksellisten suolistosairauksien yhteenlaskettu ilmaantuvuus Suomessa oli vuonna 2007 n. 30 sairastunutta/ asukasta (Kela 2006, Kela 2007) ja esiintyvyys 560 tapausta ihmistä kohden (Kela 2007). Crohnin tautiin sairastuu vuodessa 6 9 suomalaista asukasta kohden (Niemelä ym. 2005). Taudin esiintyvyys yksinään on keskimäärin tapausta asukasta kohti (Niemelä ym. 2005). EFCCA:n arvion mukaan Suomessa oli n\n13 Crohnin tautia sairastavaa henkilöä vuonna Tämä on 173 tapausta/ asukasta eli jopa 1,7 väestöstä (EFCCA 2007). Kuulumme kuitenkin maailmanlaajuisesti tautimääriä tarkastellen keskikastiin Tulehduksellisille suolistosairauksille altistavat isäntätekijät Vaikka tulehduksellisia suolistosairauksia laukaisevia tekijöitä ei hyvin tunnetakaan, on todennäköistä, että niitä on useampi ja tautitilanteen vaihtelu maantieteellisen sijainnin mukaan kertonee siitä, että geneettisen alttiuden lisäksi tietynlaiset ympäristötekijät ja elämäntavat edesauttavat näiden sairauksien ilmentymistä. Näyttäisi myös siltä, että globalisaatio ja länsimaistuminen ulottuvat IBD-tilojen esiintymiseen sairaiden määriä lisäävästi, samalla, kun ihmisten elintavat muuttuvat pikku hiljaa. Ikä Crohnin tauti voi alkaa oireilla missä iässä tahansa. Tyypillinen tulehduksellisten suolistosairauksien puhkeamisajankohta on vaihdellut eri väestöissä eri aikoina: kun ilmaantuvuus on matalalla, sairastuneet jakautuvat kaikkiin ikäryhmiin (Targan ym. 2003). Ilmaantuvuuden noustessa huippuajankohdan haitari osuu vuoden ikään, nuoriin aikuisiin (Loftus ym. 2002, Targan ym. 2003). Crohnin taudin esiintymisessä ikäryhmittäin havaitaan vähemmän merkittävä nousu n. 60 vuotiailla, mutta tästä on myös eriäviä mielipiteitä: mm. myöhäinen diagnoosi voi olla ilmiön taustalla (Targan ym. 2003). Viimeisen parin vuosikymmenen aikana lasten ja nuorten Crohn-diagnoosien määrä on kasvanut (Targan ym. 2003, Askling ym. 1999). Esimerkiksi Tukholman alueella CD on lapsilla yleistynyt, kun taas UC:n määrässä ei ole tapahtunut muutosta (Askling ym. 1999). Muualla Ruotsissa tilanne on tosin päinvastainen (Lindberg ym. 2000). Suomessa lasten IBD-diagnoosien määrä on vuosina lähes kaksinkertaistunut (Turunen ym. 2006). Sukupuoli Keskimäärin tulehdukselliset suolistosairaudet jakaantuvat melko tasaisesti molempien sukupuolten kesken. (Kela 2006). Monissa tutkimuksia Crohn-potilas on hieman 13\n14 useammin nainen kuin mies, mutta läheskään aina merkitsevää eroa tautien esiintymisessä ei ole sukupuolten välillä osoitettu (Targan ym. 2003). Haavaisen paksusuolen osalta miehet hallitsevat tilastoja pienellä erolla (Targan ym. 2003). Perhe, ihmisrotu ja etninen tausta Perimällä on tiettävästi suuri merkitys IBD:n tautiherkkyydessä ja sairastuneen perheenjäsenillä onkin tavallista suurempi alttius sairastua. Etenkin Crohnin tauti on perhesidonnainen, vaikka samassa perheessä voi esiintyä molempia tautitiloja (Targan ym. 2003). Esimerkiksi sisarusten suhteellinen riski sairastua on kertainen verrattuna taudin alueelliseen esiintyvyyteen (Orholm ym. 1991, Probert ym. 1993). Samanmunaisilla kaksosilla riski sairastua on vielä muuta perhettä korkeampi, jos toisella heistä on IBD, joskaan se ei ole lähelläkään 100 % (Tysk ym. 1988). Ympäristötekijöiden lisäksi perimän tärkeää merkitystä taudin kehittymisessä osoittaa muun muassa se, että molemmat puolisot harvoin sairastuvat tulehduksellisiin suolistosairauksiin, mutta kaukanakin toisistaan asuvilla sukulaisilla näitä sairauksia esiintyy hieman muuta väestöä useammin. (Targan ym ) Eroja sairastuvuudessa ihmisrotujen välillä ja etniseen taustaan perustuen on osoitettu monessa yhteydessä. Myös alkuperäisellä kotimaalla on merkityksensä IBD-alttiudessa. Juutalaisia on useissa tutkimuksissa pidetty tavallista herkempinä Crohnin taudille, mutta Keski-Euroopan juutalaisissa Crohnia esiintyy Puolan ja Venäjän juutalaisia enemmän (Roth ym. 1989). Lisäksi IBD:n kuva vaihtelee eri ihmisrotujen ja väestöjen välillä; esimerkiksi perhehistoria, ruoansulatuskanavan ulkoiset oireet sekä sairauden sijainti elimistössä vaihtelevat (Nguyen ym. 2006, Pinsk ym. 2007, Straus ym. 2000). On myös todettu, että korkean esiintyvyyden maiden maahanmuuttajat sairastuvat tulehduksellisiin suolistosairauksiin alkuperäisasukkaita harvemmin (Kurata ym. 1992). Etenkin sosioekonomiselta asemaltaan heikompien, tiettyjen etnisten vähemmistöjen sairastuvuus on muuta väestöä alhaisemmalla tasolla (Jayanthi ym. 1992, Karlinger ym. 2000, Odes ym. 1994). Erot näyttäisivät tosin hiljalleen kaventuvan myös tällä alueella (Calkins ym. 1984, Jayanthi ym. 1992). Vielä toistaiseksi valkoinen väestö näyttäisi sairastuvan muita ihmisrotuja useammin (Karlinger ym. 2000, Nguyen ym. 2006). 14\n15 5.2.3 Ympäristötekijät Sairauksien syntymekanismeihin on liitetty ajan mittaan lähes kaikki mahdollinen, mitä kehitys on tuonut tullessaan tautimäärien kasvaessa, tästä esimerkkinä hammastahna ja antibiootit. Infektiotaudit Tällä hetkellä yksi vahvimmista teorioista tulehduksellisten suolistosairauksien lisääntymisessä on sairastelu varhaislapsuudessa (Ekbom ym. 1990). Useat infektiot, mm. eri virusten aiheuttamina, ovat olleet epäilyksen alaisina (Targan ym. 2003). Varsinkin pysyvillä tai toistuvilla tulehduksilla on oletettu olevan vaikutusta kehittyvän puolustusjärjestelmän vasteisiin (Montgomery ym. 1999). Toistuvat ruoansulatuskanavan tulehdukset voivat lisäksi muokata suoliston mikrobiston koostumusta ja/ tai toimintaa sekä lisätä näin IBD-alttiutta (Halfvarson ym. 2006). Tulehduksella voi olla kauaskantoinen vaikutus, erityisesti varhaislapsuudessa sairastettuna, kun bakteeristo vasta kehittyy (Targan ym. 2003). Toisaalta vastasyntyneiden kuolleisuuden vähentymisen, hyvän hoidon ja hygienian ansiosta, on ehdotettu nostavan tulehduksellisten suolistosairauksien ilmaantuvuutta. Hypoteesin mukaan pikkulapset, jotka eivät menehdykään infektioihin tai heikon immuunipuolustuksen vuoksi, ovat niitä, jotka kehittävät Crohnin taudin myöhemmin elämässään. Maissa, joissa väestön lapsikuolleisuus on ollut suurempi, IBD:n myöhempi ilmaantuvuus väestössä on selvästi vähäisempää, kun taas maissa, joissa lapsikuolleisuus on pienempi, IBD:n esiintyminen kasvaa näiden lasten ehtiessä aikuisikään. (Montgomery ym ) Ruoka Köyhien maiden vaurastuminen ja elintason nousu näkyvät muun muassa ruokavalion muuttumisena ajan myötä. Myös tämä mitä todennäköisimmin vaikuttaa suolistobakteeriston kehittymiseen ja tasapainoon, joka muokkautuu pysyväksi varhaislapsuudessa. Tähän ruoansulatuskanavan mikrobiston muutokseen on liitetty tulehduksellisten suolistosairauksien, samoin esimerkiksi allergioiden maailmanlaajuinen lisääntyminen. (Targan ym ) 15\n16 Erilaisia ravintoaineita, etenkin maitotuotteita, kuituja ja sokeria samaten kolajuomia ja pikaruokaa on vuosien saatossa epäilty IBD:n aiheuttajiksi. Luotettavia tutkimustuloksia on kuitenkin vähän; sairastuminen saattaa muuttaa potilaan ruokavaliota, sillä monet voivat paremmin tiettyjä ruoka-aineita välttämällä. Vaikka suolen ja ravinnon vuorovaikutusta ei täysin tunneta, pidetään tulehduksellisten suolistosairauksien lisääntymistä tiettyjen ruoka-aineiden johdosta epätodennäköisenä (Targan ym ) Tupakointi Tupakointi on yksi harvoista yleisesti hyväksytyistä riskitekijöistä Crohnin taudille. Meta-analyysi 15 alkuperäisartikkelin vuosina antamista tuloksista, mahdollisimman homogeenisestä otoksesta, vahvisti jälleen tupakoinnin ja CD:n puhkeamisen välisen yhteyden todennäköisyyden (OR 1,76; 95 % luottamusväli 1,40 2,22). Niin säännöllisesti kuin satunnaisestikin polttavilla on tupakoimattomia suurempi riski sairastua Crohnin tautiin. (Mahid ym ) Jonkinlainen annosvaste on myös olemassa, sillä passiivinen tupakointi näyttäisi lisäävän riskiä jonkin verran (Persson ym. 1990). Entisellä tupakoitsijalla ja henkilöillä, jotka eivät ole koskaan tupakoineet, tilanne on kuitenkin sama luokkaa (Mahid ym. 2006). Haavaisen paksusuolentulehduksen osalta tilanne on kuitenkin päinvastainen: tupakointi suojaa siltä (Mahid ym. 2006). Psykologiset tekijät Mielenterveysongelmista ja tulehduksellisten suolistosairauksien yhteydestä on ollut paljon keskustelua, mutta viime aikoina on kallistuttu sille kannalle, että vaikka IBDpotilaan oireet voivat pahentua henkisen puolen kriiseissä (Mittermaier ym. 2004), nämä eivät liity tautien puhkeamiseen. Todettakoon, että kroonisesti sairaat ihmiset kärsivät keskimääräistä useammin muun muassa masennuksesta, sillä elämänlaatu on kärsinyt (Mikocka-Walus ym. 2007). 16\n17 5.3 Tulehduksellisten suolistosairauksien etiologiasta ja patofysiologiasta Vaikka tulehduksellisten suolistosairauksien käynnistymisestä, tulehduksen jatkumisesta sekä ylläpitämisestä vastaavan koneiston täydellinen ymmärtäminen on vielä työn alla, tällä hetkellä tärkeimpinä osatekijöinä pidetään neljää kokonaisuutta: perimää, limakalvon muodostaman rajavallin heikkoutta, häiriöitä puolustusjärjestelmän säätelyssä sekä suolistobakteereita (Kuva 2). Mikään näistä etiologisista/ patofysiologisista tekijöistä ei esiinny yksinään, vaan tekijät limittyvät ja vaikuttavat toisiinsa. Tulehduksellisille suolistosairauksille herkistävien geenien löytyminen on osoittanut epiteelin muodostaman suojan toiminnan häiriön ja sekä synnynnäisen että hankitun immuniteetin tärkeyden tautien synnyssä (Hugot ym. 2002, Ogura ym. 2001, Wehkamp ym. 2007, Xavier & Podolsky 2007). Ympäristötekijöistä juuri suolen pysyvä, kommensaali mikrobisto näyttäisi olevan tärkeässä osassa puolustusjärjestelmän suistamisessa epätasapainoon, vaikka patogeenien osallisuutta ei olekaan voitu sulkea pois (Seksik ym. 2006, Sokol ym. 2006, Subramanian ym. 2006) Genetiikka Alttiuden tulehduksellisiin suolistosairauksiin määrää ainakin joiltain osin geneettinen tausta (Targan ym. 2003). Perimän merkitystä on tutkittu paitsi eläinmalleilla, myös ihmisen genomia kartoittamalla. Useita geenejä ja geenialueita on yhdistetty Crohnin tautiin ja vielä useammat ovat työn alla (kokooma-artikkelista Xavier & Podolsky 2007): 17\n18 Tunnetut CD-herkkyyteen vaikuttavat geenit ja geenialueet; o NOD2 o IBD5 o IL23R o ATG16L1 o Chr 5p13.1 o Chr 5q33.1 (IRGM) Chr 10q21.1 Tutkimuksen alla olevat CD-herkkyyteen mahdollisesti vaikuttavat geenit ja geenialueet; o NCF4 o PHOX2B o PTPN2 o TNFSF15 o hr 16q24.1 (FAM92B) Perimä Puolustusjärjestelmän dysregulaatio IBD Limakalvoesteen Heikkous Suolen mikrobisto On hyvinkin mahdollista että IBD-sairaudet, siten kuin ne tällä hetkellä määritellään, sisältävät useita toisiaan muistuttavia tautitiloja. Tähtäimessä on genotyypin ja fenotyypin yhteensovittaminen sairauksien patofysiologian ymmärtämiseksi. Tämä parantaisi sopivampien hoitojen kehittämismahdollisuuksia. Kuva 2. Tulehduksellisten suolistosairauksien puhkeamisen taustalla vaikuttavia tekijöitä. EFCCA:n uutislehtisen (26/2007) kuvituksesta mukailtu. IBD1: CARD15/NOD2 Ensimmäisiin ja tärkeimpiin Crohnin tautiin yhdistettyihin geenivirheisiin kuuluu CARD15/NOD2-geenin kolme itsenäisesti tautiin liittyvää mutaatiota (Hugot ym. 2002, Ogura ym. 2001) (Kuva 3). Geeni sijaitsee 16. kromosomin IBD1:nä tunnetussa alueessa. Geeni on mutatoitunut % kaukasialaisista (vaaleaihoinen, ei-juutalainen) potilaista (Hugot ym. 2002, Ogura ym. 2001), eivätkä kaikki kantajat sairastu: homotsygooteilla suhteellinen riski on 20 40, heterotsygooteilla 2 4 kertainen (Strober ym. 2007). Näin ollen mutaatio ei ole välttämätön eikä yksin riittävä syy taudin synnylle, mutta sen läsnäolo nostaa sairastumisherkkyyttä selvästi. 18\n19 CARD15/NOD2-geenin koodaama NOD2-proteiini (nucleotide binding oligomerisation domain 2) kuuluu solunsisäiseen reseptoriperheeseen (Nod like receptor, NLR) (Fritz ym. 2006). Kuva 3. CARD15/NOD2-reseptori ja siinä sijaitsevat kolme Crohnin tautiin liittyvää geenivirhettä leusiinipitoisessa toistojaksossa (LRR) Lähde: UEPSD, INRA, Jouy-en-Josas, Ranska Kun normaali NOD2 toimii, tiettyjen bakteeriantigeenien (MDP) ärsytys laukaisee matalan tason NF- B-aktivaation antigeenejä esittelevissä soluissa (Abbott ym. 2004). NF- B on tulehduksen syntymiseen tarvittavien välittäjäaineiden transkriptiotekijä: sen sitoutuessa geenien promoottorialueelle, interleukiinien tuotanto käynnistyy (IL-8) (Abbott ym. 2004) (Kuva 4). Crohnin tautiin liittyvän geenimutaation johdosta NF- Btuotanto on huomattavasti noussut (Inohara & Nunez 2003). NF- B:n rooli tulehduskaskadissa Stimulus: NOD2/ TLR2 NF- B sytokiini tuotanto IL-8 APC:t, makrof. yms. heräävät IL-23, IL-12 T-solut reagoivat INF-, TNF-, IL Tulehdus Kuva 4. Tulehdukseen johtava sytokiiniketju: sytokiinien vaiheet ja vaikutukset. Epiteelin antibakteeristen aineiden tuotannon vähentymisen lisäksi (Wehkamp ym. 2004, Wehkamp ym. 2007) CD:n välittäjäaineiden määrät kasvavat NOD2:sta riippumatonta reittiä; bakteeriseinämän PGN vaikuttaa TLR2-tunnistusreseptoriin (Toll like receptor), johon NOD2:lla on estovaikutus toimiessaan normaalisti (Uehara ym. 2005) (Kuva 5). 19\n20 Useiden tutkimusten perusteella NOD2 näyttäisi toimivan ensisijaisesti bakteeripuolustuksessa. NOD2 -/- -hiiret eivät kehitä suolistotulehdusta spontaanisti, mutta ovat kontrollihiiriä herkempiä suun kautta saadulle Listeria -infektiolle (Kobayashi ym. 2005). Lisäksi tavallisimmassa Crohnin tautiin liittyvässä mutaatiossa on havaittu solunsisäisen Salmonella -bakteerin säilyvän hengissä epiteelisoluissa (Hisamatsu ym. 2003) ja NOD2:n homotsygootissa mutaatiossa LRR-alueella on todettu potilailta eristetyissä makrofageissa alentunutta vastetta MDP:lle (Li ym. 2004). Elimistön kyvyttömyys torjua tehokkaasti taudinaiheuttajia saattaa olla syy jatkuviin vasteisiin myös tulehduksellisissa suolistosairauksissa ihmisellä. Kuva 5. NOD2-reseptorin ansiosta bakteeriseinämän PGN:sta irronnut MDP aiheuttaa normaalitilanteessa vain kevyen NF- B aktivaation ja NF- B:stä riippumaton aktivaatioreitti pysyy hiljaisena. Kun NOD2 ei toimi kunnolla, PGN itsessään stimuloi TLR2-reseptoria, joka alkaa tällöin tuottaa ylen määrin NF- B:tä. Tämä johtaa esitulehduksellisten sytokiinien tuotantoon ja altistaa tulehdukselle. NOD2 tarvitaan myös ylläpitämään -defensiinien, suolenseinämän antimikrobisten aineiden tuotantoa. Kuva kokooma-artikkelista Strober ym Mekanismia, jolla NOD2-välitteiset toiminnot tukevat suoliston puolustusjärjestelmän tasapainoa, ei täysin ymmärretä. Siksi on myös vaikea käsittää, miten näiden toimintojen horjuminen tautiin liittyvää NOD-polymorfismia kantavilla yksilöillä liittyy kasvaneeseen taipumukseen kehittää Crohnin tauti. 20\n21 5.3.2 Elimistön puolustusjärjestelmän epätasapaino Tulehduksellisten suolistosairauksien on aiemmin uskottu puhkeavan yksilöissä, joilla on hyvä vastustuskyky. Vaikka elimistö näyttäisi ylireagoivan ärsykkeisiin, joita tulisi sietää, tauteihin liittyy myös puolustusjärjestelmän alisuoriutumista. Suolen limakalvon suoja- ja puolustusmekanismien toimiminen odotetulla tavalla on äärimmäisen tärkeää terveyden ylläpitämiseksi. Suolenontelon sisältö on elimistön ulkopuolista ainesta, joka muodostaa jatkuvan uhkan. Vaaran valvomiseen ja puolustustoimien aloittamiseen tarvittavat järjestelmät kattavat sekä synnynnäisen että hankitun immuniteetin keinot ja muodostavat monimutkaisen viestintäverkon. Vika missä kohtaa hyvänsä tässä vyyhdessä vaikuttaa kokonaisuuteen ja vaarantaa tasapainon. Limakalvon suojavalli ja tasapaino Limakalvon muodostama, limalla voideltu muuri on tärkeä elimistön suoja. Tämä ensimmäinen raja ulkomaailman ja oman järjestelmän välillä estää käsittelemättömien bakteerien ja makromolekyylien pääsyn elimistöön normaalioloissa. Fyysisen esteen tukena, puolustuksen etulinjassa on useita muitakin synnynnäisen immuniteetin keinoja taata elimistön koskemattomuus. IBD-sairauksissa vikaa voi olla samanaikaisesti monessa kohtaa näistä mekanismeista ja heikkoudet yhdessä johtavat vaikeuksiin. IBD-potilaiden limakalvonäytteiden epiteelisoluissa on todettu suojavallin toimintaa säätelevien reseptorien ja muiden tärkeiden rakenteiden tuotannon häiriöitä. Esimerkiksi solujen välisen kompleksin liitoksiin tarvittavien rakennemolekyylien synteesi on alentunut (Gassler ym. 2001). Joihinkin näistä puutteista liittyy myös geneettinen alttius (Libioulle ym. 2007). Niinpä Crohnin taudissa suolisto osoittaa epätavallisen suurta läpäisevyyttä ja sama ilmiö on havaittu myös potilaiden lähisukulaisissa, vaikka he eivät tautia sairastakaan (Buhner ym. 2006, Irvine & Marshall 2000, Söderholm ym. 2002). Tulehdus lisää limakalvon läpäisevyyttä vielä entisestään: muun muassa TNF-, IL-17 ja INF- vaikuttavat tiiviiden liitosten säätelyyn (Laukoetter ym. 2008). Suolen epiteeli ei kuitenkaan ole vain passiivinen suojamuuri: se viestii kahteen suuntaan ja myös jatkuvasti kerää tietoa molemmista suunnista. Tässä suolenontelon 21\n22 bakteereiden ja puolustusjärjestelmän solujen ristitulessa epiteelin on ilmennettävä mikrobeja tunnistavia reseptoreja, kuten TLR ja NOD, siinä missä elimistön sisäiseen viestintään tarvittavia molekyylejä (Hisamatsu ym. 2003, Cario ym. 2000, Yoshida ym. 2006). Kaikista saamistaan viesteistä epiteelisolut laskevat yhteen vallitsevan tilanteen ja aloittavat tarvittaessa NF- B-tuotannon, jonka herättäminen tai sammuttaminen näyttäisi olevan vasteiden laadusta määräävä tekijä tulehduksellisissa suolistosairauksissa (Xavier & Podolsky 2007). Kommensaaleilla bakteereilla on kyky aktiivisesti vähentää suolen tulehdusvasteita hillitsemällä epiteelin NF- B:n aktivoitumisketjua sekä nopeuttamalla sen kuljetusta tumasta geenin lukemisen päättämiseksi (Kelly ym. 2004). Toisaalta hiirimallissa, jossa sama ketju on täysin estetty, eikä NF- B voi toimia lainkaan, kehittyy spontaani tulehdus sen lisäksi, että antimikrobisten peptidien määrä on vähentynyt (Nenci ym. 2007). Epiteelin NF- B-signalointiverkosto on täten oleellinen suolen limakalvon normaalin tasapainon ylläpitämisessä ja välitettäessä patogeenikohtaisia vasteita, mihin viittaa myös Crohnin tautiin kytkeytynyt geenivirhe (CARD/NOD2, kts. yllä). Tämä NF- B:n kaksijakoisuus vaikeuttaa huomattavasti hoitomuotojen kehittämistä: sen tuotannon rajoittaminen olisi oleellista tulehduksen hallinnassa, mutta sitä ei voida helposti tehdä poistamatta myös suojaa antavaa vaikutusta. Suolen tavallisen epiteelisolukon joukkoon limittyy sitä suojaamaan erikoistuneita soluja. Esimerkiksi limaneritys hillitsee tulehdusta (An ym. 2007) sen lisäksi, että se muodostaa fyysisen esteen epiteelin pinnalle. Limaa tuottavien pikarisolujen tehtäviin kuuluu samoin limakalvon korjauksesta sekä puolustuksesta huolehtivien peptidien eritys (Mashimo ym. 1996, McVay ym. 2006). IBD-potilailla on havaittu liman tärkeän komponentin, MUC2-musiinin, tuotannon olevan poikkeuksellista (Hanski ym. 1999). MUC2 -/- -hiirillä ei ole pikarisoluja lainkaan ja tämän puutteen on todettu johtavan spontaaniin tulehdukseen (Van der Sluis ym. 2006). Ohutsuolen kryptojen pohjalla kasvaa myös Panethin soluja. Ne erittävät antimikrobisia peptidejä, kuten -defensiinejä. Näiden tuotannon ehtymisellä saattaa olla osuutensa Crohnin taudin puhkeamisessa sykkyräsuoleen ja/tai kehittymisessä potilailla, joilla on 22\n23 NOD2-mutaatio (Wehkamp ym. 2004, Wehkamp ym. 2005, Wehkamp ym. 2007) (Kuva 6). Kuva 6. Antimikrobisten peptidien tuotannon häiriintymisen seuraus Wehkamp ym mukaan. Terve, normaali epiteeli reagoi mikrobiärsykkeeseen ja paikallinen vaste käynnistää -defensiinien tuotannon, jolloin ärsykettä aiheuttavat bakteerit tuhoutuvat. Kun NOD2- reseptorin toiminta on heikentynyt, vaste ei tuota antimikrobisia peptideitä, bakteerit säilyvät limakalvolla ja ajan myötä niiden aikaan saama ärsyke käynnistää tulehduksen. Mikrobi Epiteeli Mikrobi Epiteeli Terve suolisto Paikallinen vaste Crohnin tauti Paikallinen vaste mm. DEFENSIINIT Antimikrobiset peptidit mm. DEFENSIINIT Antimikrobiset peptidit TULEHDUS Mikrobin tuhoaminen Mikrobin tuhoaminen Limakalvon valvontajärjestelmä Suolensisällön tarkkailemiseksi on kehittynyt hienojakoinen järjestelmä, joka kytkee synnynnäisen ja hankitun puolustuksen toisiinsa. Terveyden kannalta oleellista on puolustusjärjestelmän kyky päättää vaarallisen ja vaarattoman välillä sekä kehittää oikeanlaiset, riittävät vasteet tilanteen mukaan. Päätös siedettävän ja vastustettavan ärsykkeen välillä vaatii hyvää tasapainoa immuunipuolustukselta ja sen eri osien vankkaa yhteistyötä. Suolenontelon mikrobistoa vartioi useita erilaisia solutyyppejä, esimerkiksi M-solut. Nämä kuljettavat näytemateriaalia suolenontelosta lamina propriaan, antigeenejä esittelevien solujen (engl. antigen presenting cell, APC) ulottuville. Tämä on yksi tapa, jolla APC:t pääsevät käsiksi mm. bakteereihin, syövät ne ja muokkaavat esiteltävään muotoon. T- ja B-imusolut voivat tunnistaa esitellyt antigeenit kaikkialla missä APCsolut liikkuvat (Peyerin levyt, imusolmukkeet, lamina propria). Esittelytapahtuma käynnistää puolustustoiminnan, joka rajoittuu suolen lamina propriaan, jossa antigeeni pyydystettiin, ja limakalvon vasteet käynnistyvät (Coombs & Maloy 2007, Zaph ym. 2007). Suolen lamina proprian antigeenejä esittelevistä soluista tavallisin on monimuotoinen ja toiminnallisesti monipuolinen dendriittisolu. Sillä on elimistössä 23\n24 useita tärkeitä tehtäviä, mutta toisaalta myös ominaisuuksia, jotka voidaan yhdistää IBD:n patogeneesiin (Hart ym. 2005). Crohnin tautia sairastavilla monosyytti-makrofagit reagoivat tulehdusviestiin laiskasti (Marks ym. 2006). Myös fagosytoosi voi olla potilaalla puutteellista. Suoliston makrofagit lisääntyvät tavallista huonommin, eivätkä vastaa miltään taholta tuleviin ärsykkeisiin niille ominaisella hanakkuudella (Smith ym. 2005). Tupakointi saattaa entisestään huonontaa tilannetta, sillä sen on todettu heikentävän ainakin keuhkomakrofagien kykyä tappaa bakteereita (Matsunaga ym. 2001). Tupakointi on selvästi yksi taudille altistavista tekijöistä (Mahid ym. 2006) (Kuva 7). Bakteerisoluseinämän, ehkä mykobakteerien mannaanit CARD15/NOD2 -proteiinin muutos Tupakointi Fagosyyttien toiminnan häiriö Adherentti E. coli Epätäydellinen puhdistuminen makrofagien sisäisistä bakteereista Sisäänpääsy M-solujen kautta Granulooman-, paiseenja fistelinmuodostus Kuva 7. Teoria Crohnin taudin patogeneesista. Bakteerin soluseinän mannaanit, geenimutaatiot sekä tupakointi johtavat fagosytoosin häiriöön, jolloin bakteerit, kuten E. coli, pääsevät elimistöön M-soluissa, jotka esittelevät mikrobeja makrofageille. Kun heikentyneet makrofagit eivät puhdista limakalvoa epäpuhtauksista, ärsytys on otollinen granulomatoottisten leesioiden, paiseiden ja muiden CD:lle ominaisten muutoksen muodostumiselle. Kuva kokooma-artikkelista Subramanian ym Suurella osalla Crohnin tautia sairastavasta on myös kohonnut anti-saccharomyces cerevisiae vasta-ainepitoisuus (ASCA) veressä (Koutroubakis ym. 2001, Quinton ym. 1998, Targan ym. 2003). ASCA-tuotanto on vaste bakteerisoluseinämän mannaaneille ja sen käynnistyminen liitetään tiettyihin taudinaiheuttajiin. Esimerkiksi Mycobacterium paratuberculosis subsp. avium-bakteerilla on vasteen käynnistävä mannaaniepitooppi 24\n25 (Subramanian ym. 2006). Tämän taudinaiheuttajan yhteyttä CD:iin on pohdittu jo pitkään. Sairauksiin, joihin liittyy heikentynyt bakteerintappokyky fagosytoivien solujen puutteiden takia, liittyy Crohnin taudin kaltainen suoliston tila. Ainakin hiivan mannaanien on todettu hillitsevän fagosyyttisoluja tuhoamasta potilailta eristettyjä E. coli -bakteereja (AIEC) in vitro (Mpofu ym. 2005). Makrofageilla on todistettavasti osuus suoliston tulehdustilan synnyssä silloinkin, kun niiden toimia ei hillitä; esimerkiksi yleensä spontaanin suolitulehduksen kehittävä Il10 -/- -hiirimalli säästyy tulehdukselta, kun siitä poistetaan makrofagit ja niistä lähtöisin oleva hallitsematon IL-12- ja -23-sytokiinien tuotanto loppuu (Kamada ym. 2005). Ennen pitkää korostunut Th 1 -vaste tuottaa kroonisen paksu- ja ohutsuolen tulehduksen (Takeda ym. 1999). Tulehdustilassa synnynnäisen puolustusjärjestelmän solujen vaeltaminen kohdelimakalvolle on kiinni monista siihen kytkeytyvistä viestiaineista, ja solujen kutsuminen näitä viestiaineita käyttäen on tarkkaan ohjattua, sidoksissa sekä elimistön omiin että mikrobien lähettämiin merkkeihin. Dendriittisolut, makrofagit sekä neutrofiiliset granulosyytit vastaavat kutsuun ja virittyneinä nämä solut vahvistavat yleisesti paikallista tulehdusvastetta lamina propriassa. Niiden tuottamat reaktiiviset happimolekyylit ovat tärkeä syy tulehdukseen ja kudosvaurion syntyyn, lisäten myös kudoksen läpäisevyyttä. Luonnolliset tappajat, NK-solut puolestaan vaimentavat aktivoituneina tulehdusreaktioita, elimistön antimikrobisia tekijöitä parantaen (Fort ym. 1998). Paikallisessa tulehduksessa syntyvien, soluja houkuttelevien molekyylien tuotantoon puuttumalla voitaisiin mahdollisesti vaikuttaa taudin kulkuun tulehduksellisissa suolistosairauksissa. Vaikka synnynnäisen puolustusjärjestelmän mekanismeja säädellään ylhäältä käsin, itsenäisetkin, välittömät vasteet onnistuvat perustuen tiettyihin yleispiirteisiin taudinaiheuttajissa. Näitä piirteitä tunnustelemaan on kehittynyt useita reseptoriperheitä, joita monet solutyypit, muun muassa dendriittisolut, makrofagit ja suolen epiteelisolut, ilmentävät. Reseptorit mahdollistavat suolen mikrobiston kontrolloinnin sekä häiritsevien bakteerien laukaisemien tulehdusten rajoittamisen. Synnynnäisen puolustuksen reseptorien virheetön toiminta on terveyden kannalta välttämätöntä. Tästä 25\n26 esimerkkinä on eri reseptorimutaatioiden yhteys tulehduksellisiin suolistosairauksiin. Crohnin tautiin liittyvä NOD2-mutaatio (kts ) muuttaa limakalvon ja mikrobiston vuorovaikutusta, lisäksi bakteerikomponentteja tunnistavista TLR-reseptoreista on löydetty mutaatioita (Pierik ym. 2006, Torok ym. 2004). Kukin valvontajärjestelmä on itsenäisesti tärkeä limakalvon tasapainon säätelyssä, joskin niillä on myös vuorovaikutusta toistensa kanssa. Synnynnäinen ja hankittu immuniteetti kohtaavat; välittäjäaineet ja Crohnin tauti Vaikka synnynnäisen puolustusjärjestelmän lähettämät viestit ovat edellytys hankitun immuniteetin liioitellun vasteen käynnistämiseen, tulehduksellisissa suolistosairauksissa esiintyvä kudostuho on enimmäkseen jälkimmäisen vastuulla. Vasteiden toteutuminen riippuu tulehduspaikalla vaikuttavien pysyvien sekä sinne houkuteltujen solujen populaatioista. Tulehduksellisiin suolistosairauksiin liittyy T h 1/T h 2-vasteiden vääristynyt suhde, vaikka Th 2 -vasteen merkitystä IBD-tiloissa ei täysin olekaan ymmärretty (Targan ym. 2003). On kuitenkin ajateltu, että T-auttajasolujen Th 1 -vaste liittyisi Crohnin tautiin (Targan ym. 2003). Th 1 -vaste käynnistyy puolustuksen tavatessa pieneliöitä, jotka kiihdyttävät muun muassa. IFN- - ja IL-12 tuotantoa tiettyjä viestintäreittejä käyttäen (Mosmann ym. 1986, Murphy ym. 2005, Targan ym. 2003). Th 2 -vaste tarvitsee vastaavasti omat polkunsa solujen erilaistumiseen ja sytokiinien, esimerkiksi IL-4, IL-5 ja IL-13 tuotantoon. (Mosmann ym. 1986, Murphy ym. 2005, Targan ym. 2003). Tulehduksellisten suolistosairauksien luonne on kuitenkin huomattavasti monimutkaisempi ja niissä on päällekkäisyyksiä. Lisäksi on löydetty uusi solulinja, Th 17, joka näyttäisi olevan erittäin merkittävä Crohnin taudin synnyssä (Kuva 8). Th 17 -linjan aktivoituminen edellyttää jo olemassa olevien esitulehduksellisten välittäjäaineiden, erityisesti IL-6 läsnäoloa (Bettelli ym. 2007). Suotuisissa olosuhteissa, dendriitti- ja fagosyyttisolujen aktivoiduttuaan erittämä, IL-23-sytokiini on avain Th 17 - solulinjan kehittymiseen (Kastelein ym. 2007, Weaver ym. 2007) (Kuva 8). Se myös laajentaa ja ylläpitää linjan populaatiota (Bettelli ym. 2007). Auttajasolujen Th 1 ja Th 2 valmistamiseen tarvittavat transkriptiotekijät puolestaan lamaavat Th 17 -linjaa (Weaver ym. 2007). 26\n27 Solulinjan kehitykseen ohjaava viestiaine Transkriptiotekijä, signaaliproteiini tai -reseptori IFN Stat 4, Tbet IL-4 Gata 3, Stat 6 Th0 epäkypsä CD4+ solu + IL-6 Stat3, ROR t TGF IL-6 IL-10 TGF /IL-10 Kehittymiseen vaaditaan Kehittyvä solulinja IL12 IL4 IL23 solukontakti Th1 Th2 Th17 itreg indusoituva Tr1 FoxP3 + FoxP3 - Th3 FoxP3 +/- Erittyvä sytokiini IFN, IL-2 IL-4, 5, 13 IL-17, 6 TGF IL-10 toiminnaliset T-solut, tulehdusvaste TGF T-säätelijäsolut, tulehduksen hillitseminen Kuva 8. Th CD 4+ solujen erilaistumiseen ja kehittymiseen johtavat tekijät. Kuva on mukailtu kokooma-artikkelista Xavier & Podolsky 2007 (kuva: H. Sokol). IL-23 vaaditaan Th17 solulinjan kehittymiseen ja ylläpitoon. Linjan tuotannon käynnistyminen edellyttää myös esitulehduksellisia sytokiineja (IL 6), muuntavan kasvutekijän (Transforming growth factor beta, TGF ) läsnä ollessa (Bettelli ym. 2007). Th17 linjan kehitystä estävät Th1- ja Th2- linjojen transkriptiotekijät sekä IL-2. Kun tulehduksen välittäjäaineita ei erity, TGF edistää tulehdusta hillitsevien Foxp3+-T-säätelijäsolulinjojen kehitystä, joka puolestaan alentaa tulehdusvasteita (Kim & Rudensky 2006). Samoin tekee IL-2, joka voi lisäksi rajoittaa Th 17 -välitteistä tulehdusta tukemalla T- soluja säätelevien T reg -solujen toimintaa (Laurence ym. 2007). Th 17 -solujen lopputuotteita ovat muun muassa IL-17-, IL-21 ja IL-22-sytokiinit (Liang ym. 2006). IL-23 pystyy käynnistämään IL-17 tuotannon tulehdusolosuhteissa myös muissa kuin T-soluissa ja ainakin monosyyttisolut toimivat IL-17-lähteenä T-solujen rinnalla IBD-potilaan limakalvolla (Kolls ym. 2004). IL-17 sytokiinillä saattaisi olla tehtävä pieneliöitä tappavien peptidien tuotannon käynnistämisessä (Liang ym. 2006) ja se säätelee mahdollisesti myös tiiviiden liitosten muodostamaa raja-aluetta (Kinugasa ym. 2000). IL-17 osuutta tulehduksen syntymiseen ei ole vielä tutkittu. IL-23 ylläpitää Th 17 -vasteita solujen pinnalla olevan IL-23-reseptorin (IL-23R) kautta, mutta sen toimintamekanismia in vivo ei kovin hyvin tunneta. IL-23-reseptorin geenialueen muunteluun on todettu liittyvän vähentynyttä riskiä tulehduksellisille suolistosairauksille ja lisäksi useat tämän alueen muutoksista liittyvät itsenäisesti sairastumisalttiuteen (Duerr ym. 2006). 27\n28 Myös hiirikokeet vahvistavat IL-23R-välityksen tärkeyden taudinaiheutuksessa. Risteytettäessä Il-10 -/- -hiiriä sellaisten hiirten kanssa, jotka eivät tuota IL-23-sytokiinia, ei jälkeläisille kehitykään spontaania suolistotulehdusta (Hue ym. 2006, Yen ym. 2006). IL-23 IL-23R-viestinvälitys näyttäisi kaiken kaikkiaan olevan avainasemassa synnynnäisten ja hankittujen tulehdusvasteiden johtamisessa suolen limakalvolla. T- ja B-soluja säätelevillä soluilla on merkittävä osansa tasapainon ylläpitämisessä (Izcue ym. 2006, Mizoguchi & Bhan 2006). Soluvälitteisen puolustuksen valvojan, T reg - solun tehtäviin lamina propriassa epäillään kuuluvan ainakin vasteiden rauhoittaminen suolen pysyvää, kommensaalia mikrobistoa vastaan (Izcue ym. 2006). Niillä voisi olla myös merkitystä taudin vakavuuden asteelle. Vasta-ainevälitteistä puolustusta hillitsevät B reg -solut nähdään vasta tulehduksen jo käynnistyttyä ja ne ennemminkin hidastavat sen kehitystä kuin estävät syntymistä, ainakin tulehdusmallissa (Mizoguchi & Bhan 2006). Kun tulehduksen välittäjäaineita ei ole liikenteessä, muodostetaan tulehdusta hillitseviä T reg solupopulaatiota (Kim & Rudensky 2006). Sitä vastoin IL-6 erityksen noustessa osittain sama koneisto omistautuukin Th 17 -solulinjan erilaistumiseen (Kuva 8). Niiden tekijöiden Tällaisten moneen kohtaan vaikuttavien tekijöiden keskinäiset suhteet saattavat osaltaan tukea mekanismeja, jotka käynnistävät tulehdusprosessin, sekä ylläpitävät sitä että johtavat relapsiin IBD:ssä Suolistomikrobisto Ihmissuolen bakteerimäärä on valtava ja on pieni ihme, ettei tällainen määrä vieraita soluja automaattisesti aiheuta ongelmia. Molempien osapuolten hyvinvointi on kuitenkin eduksi, sillä suolistobakteerien ja ihmisen välinen suhde on muokkautunut mutualistiseksi (Bäckhed ym. 2005); mikrobisto on ihmiselle sopiva, välttämätön kumppani yhteisen evoluution myötä. Nykyään suolesta tavattavat lajit ovat pitkällisen valinnan tulos. Mikrobisto moninkertaistaa solu- ja geenimäärämme ja sillä on tärkeitä tehtäviä, joihin ihmiselimistö ei itsenäisesti kykene. Bakteerit ovat tärkeä osa ruoansulatustapahtumaa ja energiataloutta oman osuutensa aineenvaihdunnastamme hoitaen. 28\n29 Siinä missä kommensaali mikrobisto normaalitilanteessa vakauttaa suolen olosuhteita ja antaa isännälleen toiminnallista sopeutuvuutta ja joustavuutta, sen osuudesta tulehduksellisten suolistosairauksien taudinaiheutuksessa on kertynyt vahvaa näyttöä. On vielä epäselvää ovatko mikrobiston epätasapaino ja muutokset syy vai seuraus taudille, mutta mikrobisto on joka tapauksessa merkittävästi muuttunut sairastuneilla terveisiin ihmisiin verrattuna, samoin mikrobien ja isännän suhde. Pitkään vallalla olleet teoriat eri taudinaiheuttajien, etenkin Mycobacterium avium subsp paratuberculosis -bakteerin, osuudesta taudinaiheutuksessa ovat näytön puutteessa kallistuneet yhä useammin yksilölle ominaisen suolistomikrobiston kannalle sekä dysbioosiin ja mikrobiston muutoksiin tulehduksellisissa suolistosairauksissa. Terveen suoliston mikrobisto Jokaisen aikuisen ihmisen arvioidaan majoittavan, pääosin suolistoonsa, noin tuhat eri bakteerilajia (Bäckhed ym. 2005). Niiden tiheys on suurimmillaan paksusuolen loppuosassa, jossa se on arviolta bakteeria grammaa kohden suolen sisältöä (Corthier ym. 2007, Targan ym. 2003). Molekyylibiologisten menetelmien käytön syrjäytettyä lähinnä viljelyyn nojaavat suolistomikrobiston määrittämismenetelmät, on selvinnyt, että noin kaksi kolmasosaa ulosteen hallitsevista mikrobilajeista on kullekin yksilölle ominaisia (Eckburg ym. 2005, Suau ym. 1999). Vaikka ihmissuolistossa mahdollisesti elävien bakteerilajien määrä vaikuttaa valtavalta, mikrobiston koostumuksen taksonominen analyysi kuitenkin paljastaa, että lähes kaikki löydetyt lajit kuuluvat kolmeen pääjaksoon: Firmicutes, Bacteroidetes ja Actinobacteria (Kuva 9). Firmicutes, gram-positiivisine bakteereineen, on aina vahvasti edustettuna. Pääjakson alaisuuteen kuuluu Eubacterium rectale Clostridium coccoides -ryhmä, joka on usein prosentuaalisesti merkittävin ihmisulosteessa (14 31 %) (Rigottier-Gois ym. 2003, Seksik ym. 2003, Sghir ym. 2000), käsittäen muun muassa bakteerisuvut Eubacterium, Clostridium, Ruminococcus ja Butyrovibrio. Toinen tärkeä ryhmä on Clostridium leptum -ryhmä ja siihen kuuluvat ulosteessa runsaina esiintyvät lajit: Faecalibacterium prausnitzii, Ruminococcus albus ja Ruminococcus flavefaciens (Lay ym. 2005). Ryhmän jäseniä löytyy ulosteesta keskimäärin % (Lay ym. 2005, Seksik ym. 2003). 29\n30 Bacteroidetes -pääjakson, Bacteroides -ryhmään kuuluvia sukuja edustavat Bacteroides, Prevotella ja Porphyromonas. Tutkimuksesta riippuen niiden määrä ulosteessa vaihtelee huomattavasti, 9 42 % välillä (Corthier ym. 2007). Acinobacteria -pääjakson sukujen edustajia on hieman harvemmin tavattu hallitsevien lajien joukossa, keskimäärin niitä löytyy kuitenkin muutaman prosenttiyksikön verran kokonaisbakteerimäärästä, mm. Bifidobacterium-suvun lajien osuus vaihtelee 0,7 10 % ja Collinsella-Atopobium 0,3 3,7 % välillä. Enterobakteereja löytyy harvemmin, samoin kuin laktobasilleja ja streptokokkeja (Lay ym. 2005). Toisin sanoen huomattavasta lajien vaihtelusta ja runsaudesta huolimatta, ihmisen suolistobakteerilajistot ovat hyvinkin konservatiivisesti rajatut näihin tiettyihin pääjaksoihin ja fylogeneettisiin ryhmiin. Kullekin meistä kehittyy kuitenkin henkilökohtainen mikrobisto, jossa lajit voivat myös vaihdella tietyissä raameissa toiminnallisen tarpeen mukaan. Atopobium Fusobacterium Lactobacillus Streptococcus Lactococcus Staphylococcus Bifidobacterium Leuconostoc Eubacterium cylindroides group Bacteroides/ Prevotella Bacteroides distasonis Porphyromonas Enterobacteria Clostridium histolyticum group BACTEROIDETES ACTINOBACTERIA FIRMICUTES 10 % Clostridium lituseberense group Clostridium ramosum C. coccoides/e. rectale group Clostridiumleptum group Veillonella subgroup Kuva x. I hmissuolen mi krobioston valtar yhmät esitt ävä fylogeneetti nen puu ribos omaalisen RNA:n 16S-alayksi kön geenisekvenssien perusteella. PÄÄJAKSOT j a ryhmät on merkitty vahvistetulla tekstillä. Kuva L échelle9. indique Ihmisen selon l axe horizontale suolistomikrobiston une divergence de séquence valtaryhmät de 10% pour une esittävä comparaison d environ fylogeneettinen 1000 nucléotides puu ribosomaalisen homologues (dérivant RNA:n d un même nucléotide 16S-alayksikön ancestral). Les PHYLA geenisekvenssien et groupes dominants les perusteella. plus prévalents sont PÄÄJAKSOT indiqués en caractères ja gras. ryhmät on merkitty vahvistetulla tekstillä. Lähde: UEPSD, INRA, Jouy-en-Josas, Ranska 30\n31 Todisteita kommensaalin mikrobiston vaikutuksesta suolistosairauksissa Tyypillisten patologisten muutosten on tulehduksellisissa suolistosairauksissa monesti havaittu kehittyvän alueille, joilla bakteerien tiheys on suurimmillaan (Marteau ym. 2003, Seksik ym. 2006). Lisäksi useat eri tutkimusryhmät ovat toisistaan riippumatta havainneet, että siinä missä tavalliset koehiiret, joilla on hiirelle ominainen suolen mikrobisto, kehittävät eri malleissa suolistoonsa tulehduksen, näin ei yleensä tapahdu pieneliöistä vapaalle hiirikannalle (Bhan ym. 1999, Taurog ym. 1994). On myös todettu, että suolen kommensaali mikrobisto ei ole vakio, vaan sen lajeissa tapahtuu merkittävää vaihtelua, erityisesti isännän suoliston terveydentilan mukaan (Sokol ym. 2006). Tavallisesti limanalainen alue paksusuolessa on suhteellisen vapaa bakteereista, mutta Crohnin taudissa bakteerit (etenkin E. coli) valtaavat sen (Darfeuille-Michaud ym. 1998, Darfeuille-Michaud ym. 2004). Tämä ei suoraan tarkoita suolistobakteereilla olevan patogeenisiä ominaisuuksia, vaan isännän vasteet joissain tapauksissa edistävät tavallisten bakteerien muuttunutta käyttäytymistä. Lisäksi Crohnin taudissa hankitun puolustusjärjestelmän vasteet suolistomikrobistoa kohtaan ovat kohollaan, taudin komplisoituneeseen muotoon liittyy jopa useita vasta-aineita (Dubinsky ym. 2006). Crohnin taudissa havaittuja vasta-aineita: ASCA (anti-saccharomyces cerevisiae antibody) (39 61 %), (Koutroubakis ym. 2001, Quinton ym. 1998) OmpC (E. coli outer membrane porin C) (55 %), (Landers ym. 2002) I2 (superantigeeni Pseudomonas fluorescens -bakteeria vastaan) (50 %) (Landers ym. 2002) Vaikka kaikki antibiootit eivät toimikaan IBD-sairauksien hoidossa, tietyillä mikrobilääkkeillä on selvää terapeuttista merkitystä: esimerkiksi imidatsoliantibiootit pitävät hyvin Crohnin taudin poissa leikkauksen jälkeen (Rutgeerts ym. 2005), ja myös siprofloksasiinilla ja metronidatsolilla on todettu myönteinen vaikutus (Sartor 2004). Probioottisten bakteerien, kuten Lactobacillus casei (Llopis ym. 2005) ja Escherichia coli Nissle 1917-kanta (Schultz ym. 2004) tai probioottisekoituksen (Madsen ym. 2001) on todettu lievittävän tulehdusta koeolosuhteissa hiirillä. Niillä on tehoa myös ihmisessä, ainakin joissain erityistilanteissa, kuten J-pussin tulehduksessa (pouchitis) (Gionchetti ym. 2003) ja UC:n relapsien ehkäisyssä (Kruis ym. 2004). CD:n remissin 31\n32 ylläpidosta probiooteilla operaation jälkeen on saatu vain vähän merkittäviä koetuloksia (Seksik ym. 2006). On myös huomionarvoista, että juuri bakteereja tunnistavien mekanismien toimiminen on suoliston tasapainolle oleellista hiirimalleissa (Rachmilewitz ym. 2004, Rakoff- Nahoum ym. 2004). Samaan viittaa NOD2- ja TLR-reseptorien geneettisen polymorfismin yhdistäminen kohonneeseen tautiriskiin ihmisellä (Hugot ym. 2002, Ogura ym. 2001, Pierik ym. 2006, Torok 2004, Wehcamp ym. 2004). Suolistomikrobisto ja Crohnin tauti Ulosteen mikrobisto Useat ryhmät ovat, toisistaan poikkeavia menetelmiä käyttäen, osoittaneet, että Crohnpotilaiden mikrobistossa esiintyy n. 30 % epätavallisia bakteereita terveisiin verrattuna (Mangin ym. 2004, Seksik ym. 2003, Sokol ym. 2006). Tämä pätee niin aktiiviseen tautiin kuin sen hiljaiseen vaiheeseen. Lisäksi potilaiden mikrobisto on epävakaa. Huomattavaa vaihtelua tapahtuu muun muassa taudin vaiheen perusteella, aktiivisuudesta riippuen (Seksik ym. 2003). Jopa vallitsevissa lajeissa on havaittu ajan kuluessa muutoksia enemmän kuin terveillä, mukaan lukien ne, joiden tauti ei tutkimuksen aikana ollut aktiivinen (Scanlan ym. 2006). Tämä ajan kuluessa havaittava mikrobiston epävakaus on suolen ekosysteemin toiminnan häiriö, jolla voi hyvinkin olla osuus Crohnin taudin aktiivisen vaiheen käynnistämisessä. Toinen tyypillisesti tulehduksellisia suolistosairauksia leimaava piirre on suoliston mikrobiston vähentynyt lajikirjo (Mangin ym. 2004, Scanlan ym. 2006). Tämän menetyksen takana on ennen kaikkea huomattava laadullinen ja määrällinen vähentyminen terveiden Firmicutes -pääjakson Clostridium leptum -ryhmässä, joka on tärkeä osa terveiden mikrobiostoa (Manichanh ym. 2006, Scanlan ym. 2006, Sokol ym. 2006). C. leptum -ryhmään kuuluu useita voihappoa eli butyraattia tuottavia bakteereita, kuten Faecalibacterium prausnitzii, yksi ryhmän yleisimmistä bakteereista, (Barcenilla ym. 2000, Suau ym. 1999, Suau ym. 2001). Butyraatti, kuten muutkin lyhytketjuiset rasvahapot, on paksusuolen epiteelisoluille tärkeä ravinnonlähde. Sillä saattaa olla lisäksi myönteinen vaikutus elimistön 32\n33 puolustusjärjestelmään sekä tulehdusta ehkäiseviä/ hillitseviä ominaisuuksia (Böhmig ym. 1997, Klampfer ym. 2003, Segain ym. 2000). Näin ollen butyraatin tuotannosta vastaavien C. leptum -ryhmän bakteerien vähentyminen saattaa vaikuttaa myös Crohnin tautiin. Myös muiden hyödylliseksi luokiteltujen bakteerien, nimittäin Lactobacillus- ja Bifidobacteria -sukujen, vähentyminen on joissain tutkimuksissa yhdistetty Crohnin tautia sairastaviin (Seksik ym. 2003). Ulosteen mikrobistosta tavataan keskimääräistä enemmän Enterobacteria -suvun lajeja Crohnin tautiin liittyen, etenkin sen kliinisesti aktiivisessa vaiheessa (Seksik ym. 2003, Giaffer ym. 1991). Erityisesti enteroadherentti, eli suoliston seinämään takertuva Escherichia coli on yhdistetty tautiin (Giaffer ym. 1992). Myös Bacteroides -ryhmässä on havaittu tapahtuvan muutoksia, mutta näistä muutoksista on ristiriitaisia tuloksia. Limakalvoon liittyvä mikrobisto Limakalvon mikrobisto muokkautuu ulosteen mikrobivirrasta. Sitä on sikäli hankala luotettavasti arvioida, että näytteet otetaan enimmäkseen tähystysten yhteydessä ja tätä edeltävä suolen tyhjennys saattaa vaikuttaa lopputulokseen (Mai ym. 2006). Kirurgisia näytteitä on saatavilla harvemmin. Myös näytteiden käsittely on kovin kirjavaa, mikä osaltaan vaikeuttaa tutkimusten vertailua. Menetelmällisistä eroista huolimatta, IBDtaudeista on saavutettu usean eri tekijän suhteen yhtenevä mielipide. Limakalvon kokonaisbakteerimäärä on lisääntynyt Crohnin taudissa terveisiin verrattuna (Schultsz ym. 1999, Swidsinski ym. 2002, Swidsinski ym. 2005). Tämä pätee niin anaerobisiin kuin fakultatiivisiinkin bakteereihin (Gophna ym. 2006, Prindiville ym. 2004). Bakteeritiheyden muuttuminen voisi olla sidoksissa suolen muodostaman rajavallin heikkenemiseen suolen sisällön ja elimistön välillä. Erityisesti antibakteeristen aineiden, kuten -defensiinien tuoman suojan on todettu rakoilevan Crohnin taudissa (Wehkamp ym. 2004, Wehkamp ym. 2005, Wehkamp ym. 2007). Tämä puute saattaisi mahdollistaa suolen pieneliöiden tunkeutumisen limakalvolle, mikä on osoitettu joissain tutkimuksissa (Kleessen ym. 2002, Swidsinski ym. 2002), tai jopa suolen kryptojen valloittamisen (Swidsinski ym. 2002, Vasquez ym. 2007). Kaikissa tutkimuksissa ei suoraan limakalvoon kiinnittyneitä tai solunsisäisiä bakteereita ole kuitenkaan havaittu (Schultsz ym. 1999, Vasquez ym. 2007). 33\n34 Taudin ilmentyminen paikallisina muutoksina terveen limakalvon keskellä on houkutellut monia tutkimaan mikrobiston eroja potilaiden muuttuneen ja normaalin limakalvon välillä. Merkkejä paikallisesta mikrobiston tasapainohäiriöstä eli dysbioosista, joka suosisi limakalvon muuttumista Crohnin taudissa, ei kuitenkaan yleensä ole löydetty (Gophna ym. 2006, Prindiville ym. 2004, Martinez-Medina ym. 2006, Seksik ym. 2003). Kuten ulosteen, myös limakalvon mikrobiston lajikirjon on todettu kaventuneen Crohnpotilailla (Ott ym. 2004). Tulokset muutoksista ovat samansuuntaisia kuin ulosteen osalta: Firmicutes -pääjakson edustajien merkittävä vähentyminen myös limakalvolla on havaittu liittyvän Crohnin tautiin (Gophna ym. 2006, Frank ym. 2007). Tässäkin tapauksessa erityisesti F. prausnitzii on normaalia alhaisemmalla tasolla (Martinez- Medina ym. 2006), jopa yksi kaikkein aliedustetuimmista lajeista IBD-potilailla terveisiin verraten (Frank ym. 2007). Tutkimustulokset Bacteroidetes -pääjaksosta ovat jälleen ristiriitaisia. Enterobakteereiden määrän taas on selvästi osoitettu nousseen Crohnin taudissa (Kotlowski ym. 2007, Martinez-Medina ym. 2006, Swindsinski ym. 2002). Etenkin E. coli -kannoista on oltu kiinnostuneita. Kiinnittymiskykyinen E. coli -bakteerilöydös kirurgisesti poistetun ileumin kroonisista muutoksista (Darfeuille-Michaud ym. 1998) innosti lisätutkimuksiin ja sittemmin on kerätty näyttöä siitä, että adherenttiinvasiivinen E. coli (esimerkiksi AIEC, kanta LF82) löytyy erityisen usein Crohnpotilaan sykkyräsuolesta (Darfeuille-Michaud ym. 2004), jonka soluihin se myös hyvin kiinnittyy, toisin kuin terveeseen kontrollisoluun (Barnich ym. 2007). Lisäksi ärhäköitä B2+D-E. coli -ryhmiä on tavallisemmin Crohn-potilaalla kuin verrokilla (Kotlowski ym. 2007). Löydetyillä ryhmillä näyttäisi olevan myös virulenssitekijöitä, jotka mahdollistavat suolen limakalvon vaurioittamisen. Tämä tekee ne tärkeäksi ehdokkaaksi tulehduksellisten suolistosairauksien patofysiologialle. Erityisten taudinaiheuttajien osuus E. coli -bakteerin lisäksi monia muitakin taudinaiheuttajia on tutkittu Crohnin taudin yhteydessä. Listeria ja Mycoplasma ovat olleet epäilyn alaisina, mutta niiden osuutta tulehduksellisissa suolistosairauksissa ei ole tiiviistä tutkimisesta huolimatta onnistuttu todistamaan. Mycobacterium avium subsp paratuberculosis eli MAP-bakteerin osuuden 34\n35 on myös oletettu olevan erittäin tärkeä (Autschbach ym. 2005, Romero ym. 2005). Se kantaa rakenteissaan muun muassa mannaania (Subramanian ym. 2006). Tämä epitooppi voi laukaista ASCA-erityksen, joka on ominaista suurelle osalle Crohnpotilaista (Koutroubakis ym. 2001, Quinton ym. 1998, Targan ym. 2003). MAPbakteereja, joita esiintyy runsaasti myös ympäristössä, on itse asiassa löydetty monissa tutkimuksissa myös Crohnin tautia sairastavilta vertailuryhmää enemmän (Autschbach ym. 2005, Romero ym. 2005). On kuitenkin paljon tuloksia, jotka eivät löytöjä tue (Baksh ym. 2004, Kanazawa ym. 1999). Lisäksi on seikkoja, jotka puhuvat Mycobacterium avium subsp paratuberculosis - bakteerin taudinaiheutusta vastaan. Vaikka joidenkin tutkimusten mukaan MAPbakteeria vastaan suunniteltu hoito tehoaisi Crohnin tautiin, on niiden toteutuksessa usein puutteita, muun muassa lääkeaine, joka ei tehoa bakteeriryhmään, (Goodgame ym. 2001, Thomas ym. 1998) tai rinnakkainen kortikosteroidien antaminen tutkittaville (Goodgame ym. 2001, Leiper ym. 2000). Kahden vuoden huolellisesti tehty tutkimus antaa kuitenkin päinvastaisen tuloksen MAP-hoidon tehosta Crohnin taudissa (Selby ym. 2007). Tiedetään myös, että hoitomuotona anti-tnf- (Infliksimab) tulisi aiheuttaa yleistynyttä tuberkuloosia vaikuttaessaan soluvälitteiseen puolustukseen, mikäli taustalla olisi MAP-infektio, mutta lääke on auttanut potilaita vaikeassa Crohnin taudissa ja kuuluu hoitosuosituksiin (Niemelä ym. 2005). Ja lopulta laajaan 16Sgeenikirjastoon perustuvassa tutkimuksessa MAP-bakteereja ei ole löydetty Crohnin tautia sairastavilla (Frank ym. 2007). 5.4 Kokeellisessa osuudessa käytetty hiirimalli Jyrsijämallit ovat erittäin oleellinen ja välttämätön osa IBD:n parissa tehtävää tutkimusta. Ne auttavat monesti ymmärtämään asioita, joihin ei potilaiden kohdalla millään päästä käsiksi ja muun muassa mallien ansiosta tutkimus on viime vuosina edennyt suurin harppauksin. Tautien aikaisen vaiheen tutkimus sekä joidenkin hoitomuotojen kehittely on harvoin mahdollista käyttämällä ihmistä testisubjektina. Tulehdusmalleja on äärimmäisen paljon, kullekin etiologian tutkimushaaralle omansa. Limakalvon läpäisevyyttä lisäävät ja synnynnäistä tai hankittua immuniteettia muuttavat tulehdusmallit aiheutetaan yleisimmin kemikaaleilla, puolustussolujen siirtämisellä tai 35\n36 geenimuokkauksella. Huomioiden tulehduksellisten suolistosairauksien monimutkaisuuden rinnalla mikään yksittäinen malli ei kuitenkaan ole täydellinen. Tutkimustuloksen ja todellisuuden väliin jää paljon sellaista, mistä ei ole tarkkaa tietoa TNBS-malli Trinitrobentseenisulfonihappo aiheuttaa kerta-annoksena, suoleen peräaukon kautta annettuna, sille herkässä eläimessä kroonistuvan paksusuolentulehduksen (Morris ym. 1989). TNBS on hapteeni eli "pieni antigeeni", joka liittyneenä isompaan rakenteeseen ärsyttää puolustusjärjestelmän hyökkäämään sitä vastaan: kemikaali sitoutuu joko suolen tai mikrobien proteiineihin. TNBS sekoitetaan etanoliin, joka tarvitaan limakalvosuojan murtamiseen vasteen parantamiseksi. Suolen seinämän fosfolipidikerros vaurioituu ja vesipakoisuus vähenee TNBS:n vaikutuksesta, jolloin seinämä herkistyy vesiliukoisille, ärsyttäville aineille sekä bakteereille (Tatsumi & Lichtenberger 1996). TNBS-muutoksina nähdään kroonisia haavaumia limakalvossa, jonka alle tulehdussolut ovat levittäytyneet koko kudosseinämän paksuudelta, jopa herakalvolle asti (Morris ym. 1989, Yamada ym. 1992). Myös suolen ahtautumista ja kiinnikkeitä ympäristöön voidaan tavata samoin suolen seinämän sisäinen tulehdus ainoana kemiallisista malleista (Yamada ym. 1992). T-solujen (CD4+) vasteet limakalvoilla ovat merkittävässä osassa kroonisessa TNBStulehduksessa (Dohi ym. 2000). Muun muassa solujenvälisen sytokiinin erityksen, limakalvotoleranssin sekä immunologisten hoitojen mallintaminen TNBS:lla on käytännöllistä. Syöjäsolujen on todettu tuhoavan TNBS:n muuttamia soluja in vitro (Kunin & Gallily 1983), mutta TNBS:lla on myös suora vahingoittava vaikutus epiteeliin (Yamada ym. 1992): solukerroksen kuolioituminen näyttäisi käynnistävän tulehdusreaktion mallissa. Myös suolenontelon mikrobistolla on osuutensa tässä (García-Lafuente ym. 1997). 36\n37 6 KOKEELLINEN OSUUS Faecalibacterium prausnitzii (Kuvat 10 ja 11) on gram-negatiivinen, ehdottoman anaerobinen sauvabakteeri. Se on kohtalaisen suuri, pitkulainen (fusiforminen) ja vaihtelevan pituinen sekä toisinaan hieman käyrä. Bakteeri luokiteltiin aiemmin osaksi Fusobacterium -sukua, mutta sen on huomattu sittemmin muistuttavan enemmän grampositiivisia bakteereita ja sijaitsevan fylogeneettisessa puussa Clostridium leptum - ryhmässä (Duncan ym. 2002). Kuten aiemmin todettiin, Crohnin tautia sairastavan ja terveen suolistomikrobiston lajit poikkeavat merkittävästi toisistaan. Erityisesti Faecalibacterium prausnitzii -bakteerin osuuden, joka terveen ulosteessa on huomattava, nähdään sairaalla romahtaneen. Siksi tutkimusryhmää kiinnosti, mitä tapahtuu, kun Faecalibacterium prausnitzii -bakteeria tuodaan tulehdusmalliin ennen tulehduksen aiheuttamista. Luotettavien tuloksien tuottamiseksi kokeet on pyritty toistamaan (perinteinen TNBSkoe neljästi), vaikka tässä ei jokaista koetta erikseen kuvatakaan. Ennen varsinaisen tutkimuksen aloittamista työryhmä on lisäksi tehnyt kokeita tarkoitukseen sopivan tulehdustason löytämiseksi kemikaaleilla. Kokeissa on pyritty noudattamaan hyväksi havaittuja sekä yleisesti hyväksyttyjä ohjeita ja menetelmiä. Perinteinen TNBS-malli (nro I) on toteutettu Folignén ja kollegojen suositusten mukaan (Foligné ym. 2006). Tutkimuksessamme ainoastaan TNBS-koeasetelma II on suoritettu vain yhden kerran, ex-tempore, hyvien tulosten innostamana. Asetelma on luotu sen tiedon pohjalta, mitä Foligné ja kollegat ovat kirjoittaneet kirjeessään (Foligné ym. 2005). 6.1 Projektin tavoitteet Tutkimuksen tarkoituksena oli tarkastella Faecalibacterium prausnitzii -bakteerin, sen osien tai aineenvaihdunnan tuotteiden vaikutusta tulehduksen kulkuun TNBStulehdusmalleissa. Oletuksena oli, että Faecalibacterium prausnitzii -bakteerilla (F prau A2-165) on tulehdusta hillitsevä vaikutus. Tutkimus toteutettiin hiirillä: tutkittava bakteeri ei kuulu luonnostaan niiden vallitsevaan mikrobistoon. 37\n38 6.2 Aineisto ja menetelmät Eläimet Eri tahojen toteuttamien kokeiden tulosten vertailukelpoisuuden parantamiseksi projekteihin valitaan yleensä tiettyjä, geneettisiltä ominaisuuksiltaan tunnettuja laboratorioeläimiä. Me käytimme kokeissamme BALB/c-uroksia (Janvier, Le Genest Saint Isle, Ranska), geneettisiltä ominaisuuksiltaan tavallisia hiiriä, joita käytetään paljon tulehduksellisten suolistosairauksien mallintamiseen. Kokeiden alkaessa ne olivat 7 8 viikon ikäisiä. Saapuessaan hiiret punnittiin ja jaettiin kokoryhmiin. Erikokoiset hiiret jaettiin tasaisesti häkkeihin, kokeesta riippuen viiden tai kymmenen hiiren ryhmiin. Perinteiseen kokeeseen (TNBS-koejärjestely I) hiiret myös merkittiin yksilöllisesti. Häkit eristettiin huoneilmasta laittamalla ne yhteen tai kahteen eristyskupuun (Texler-type isolator: La Calhène, Vélizy, Ranska). Perinteisessä kokeessa niitä oli kaksi: molempiin eristäjiin tuli yksi häkillinen kunkin koeryhmän edustajia, aina puolet yhteensä kymmenestä hiirestä, joille kokeen aikana annosteltiin samaa ainetta. TNBS-koejärjestelyssä II käytettiin vain yhtä eristyskupua, sillä hiiriä laitettiin kymmenen jokaiseen häkkiin. Ennen kokeiden alkamista hiiriä pidettiin laboratoriossa tarkkailussa viikon karenssiajan mahdollisten infektioiden tai muiden koetuloksia vääristävien tekijöiden poissulkemiseksi. Koko laboratoriossa oleskelunsa ajan hiiret saivat sekä vettä että ruokaa vapaasti. Tarjottu ruoka oli vakioitua pellettiravintoa jyrsijöille (UAR, Villemoisson, Ranska) ja häkkien kuivikkeena käytettiin sahanpurua. Huoneessa, jossa häkkejä pidettiin, noudatetaan 12 tunnin valoisa-pimeä sykliä lämpötilan ollessa 21 ºC tila on vakioitu olosuhteiltaan ja ainoastaan koe-eläimiä varten. Kaikissa eläimiin liittyvissä toimissa on noudatettu niistä säädettyjä Ranskan kansallisia lakeja ja ohjeita. 38\n39 6.2.2 Bakteeri Kaikissa kokeissa on käytetty Faecalibacterium prausnitzii -bakteerin kantaa A2-165 (DSM 17677), joka on alun perin ostettu laboratorioon, säilötty pakastimeen ja sittemmin ylläpidetty viljelemällä. Kuva 10. F. prausnitsii, elektronimikroskooppikuva (kuva: H. Sokol) Kasvatusolosuhteet Koska F. prausnitzii on herkkä hapelle, se kasvatetaan tarkkaan säädellyissä olosuhteissa, erityisessä hapettomassa kasvatuskaapissa (Freter chamber). Kaapissa on enimmäkseen typpikaasua (N 2 ), joka täyttää 90 % ilmatilasta, pienellä lisällä hiilidioksidi- (CO 2 ) ja vetykaasua (H 2 ), 5 tilavuusprosenttia kutakin. Hapen (O 2 ) määrä pidetään pienempänä kuin 8 ppm; Kloori-palladium katalysaattori muuntaa kaappiin mahdollisesti pääsevän happikaasun vedeksi, joka imeytyy säännöllisesti vaihdettaviin väri-indikaattorisilikaattikiteisiin. Hapen määrää siis kaapin toimivuutta valvotaan värikontrollin (fenosafraniini indikaattori kasvatusliuoksessa) sekä happimittarin (O 2 % ja H 2 %) avulla. Bakteeri vaatii kasvuolosuhteiltaan paljon ja tarvitsee kasvaakseen LYHBHI (Lipid, Yeast extract, Hemine, Brain Heart Infusion)- kasvatusliuokseensa sellobioosi- ja maltoosisokerilisät (molempia sokereita 0,1 ml/10 ml, 10 % liuoksina kasvatusliuokseen) sekä kysteiiniä (pitoisuus 50 mg/ml: 0,1 ml/10 ml kasvatusliuosta). Bakteeria kasvatetaan kokeita varten 24 tuntia 37 C lämpökaapissa, joka kasvatuskaappiin on asennettu. Kuva 11. F. prausnitsii -bakteereita, elektronimikroskooppikuva (H. Sokol) 39\n40 Kokeessa käytetyn, elävän bakteeriseoksen valmistaminen Bakteeria varastoidaan -80 C pakastimessa, pienissä 1 ml putkissa, josta ne tarvittaessa otettiin kasvatusliuokseen (60 ml) n. vuorokautta ennen valmistettavan bakteeriliuoksen käyttämistä. Yön yli lisääntynyt kasvusto sentrifugoitiin (5000 rpm, 5 minuuttia), supernatantti kaadettiin pois ja putkien pohjalle muodostunut bakteerisakka sekoitettiin uudestaan 6 ml PBS-liuosta. Näin saatiin kymmenkertainen bakteeripitoisuus ja valmis käyttöliuos annosteluja varten. Päivittäisen bakteeriannoksen laskeminen Jokaisen päivän jaettavan annoksen bakteerimäärä laskettiin käyttäen yksinkertaistettua MPN-menetelmää (Most Probable Number). Samasta yön ylitse lisääntyneestä bakteerikasvustosta, josta käyttöliuos valmistettiin, tehtiin laimennossarja (-2, -4, -6, -7, -8, -9 ja -10), joka laitettiin jälleen yöksi lämpökaappiin. Seuraavana päivänä putket tarkastettiin silmämääräisesti: laimennoksessa yksikin lisääntymään lähtenyt bakteeri, muuttaa sen sameaksi. Viimeinen positiiviseksi tulkittu putki antaa näin ollen pesäkettä muodostavien yksiköiden (CFU) suuruusluokan, tavoitteena saada se välille 1x10 9 1x10 10 käyttöliuoksessa. Lopuksi kasvatusliuos mikroskopoitiin ja sen kasvuston puhtaus varmistettiin kontaminanttibakteerien poissulkemiseksi Supernatantti Supernatantti on soluton bakteerin viljelyliemi, joka saadaan sentrifugoimalla tutkittava bakteeri pohjaan kasvatuksen jälkeen. Tutkimuksessamme käytetty väkevöity, PBSliuokseen pohjautuva supernatantti sisältää bakteerin viljelyliemen ja aineenvaihduntatuotteiden lisäksi mahdollisesti myös bakteerin rakenneosasia. Sen tarkkaa koostumusta on vaikea arvioida. Väkevöidyn supernatantin valmistus Bakteerin kasvettua LYHBHI-liuoksessa vuorokauden, viljelmä sentrifugoitiin: 20 ml liuosta laitettiin pienempiin putkiin pyörimään 5000 g, 10 minuutin ajan. Supernatantti kerättiin pois, jäädytettiin nestetypessä ja pakastekuivattiin (laite: Virtis Company inc, Gardinier NY 12525). Muodostunut tuote resuspensoitiin, mutta sen pitoisuuden vahvistamiseksi vain 2 ml PBS-liuosta, jolloin saatiin kymmenkertainen konsentraatio. Tämä uute laitettiin pakastimeen, -80 ºC odottamaan annostelua hiirille. 40\n41 6.2.4 TNBS-tulehdusmalli Kemikaalit TNBS, 2,4,6-trinitrobentseenisulfonihappo (C 6 H 3 N 3 O 9 S, Kuva 12) on kemikaali, jonka avulla luodaan Crohnin tautia muistuttava, Th 1 -välitteinen tulehdustila koe-eläimen paksusuoleen. Tutkimuksessa käytettiin 1-molaarista liuosta (Sigma-Aldrich, Ranska), josta valmistettiin käyttöliuos oheisten laskujen mukaan. TNBS-liuoksen valmistaminen koetta varten (esimerkki, ): TNBS alkuperäisliuoksena; väkevyys: 1 mol/l molekyylipaino: 293,17 g/mol, 293,17g/l annosteluohje: 100 mg/kg = 0,1 mg/g Kuva 12. TNBSmolekyylin rakenne Käytännössä liuosta tarvitaan kuitenkin kaksinkertainen määrä, koska sitä tuhlaantuu prosessin aikana: käytetään siis lukemaa 0,2 mg/g. keskimääräinen paino: 25,8 g hiiriä 60: 60 x 25,8 g = 1548 g kulutus/ 60 hiirtä: 0,2 mg/g x 1548 g = 0,3096 g tilavuutena: 0,3096 g/293,17 g/l = 1056 µl Liuos ruiskutetaan hiiriin keittosuola-etanoliseokseen (50:50) lisättynä siten, että kuhunkin hiireen saadaan annosteltua 50 µl hiiri. Liuosta tarvitaan 60 hiirelle (kaksinkertaisella annoksella): V(tot) = 60 x 50 µl x 2 = 6000 µl 41\n42 Edellisten laskujen mukaisesti on tästä TNBS-liuosta 1056 µl, loppuosuus jaetaan keittosuolan ja etanolin kesken: 6000 µl 1056 µl = 4944 µl 4944 µl/2 = 2472 µl 2472 µl (NaCl 0,9 %) 2472 µl (etanoli 50 %) Viljelemätöntä bakteerin kasvatuslientä annettiin tässä mallissa hiirille liemen vaikutusten tarkkailemiseksi se toimi siis yhtenä kontrolleista. Muuten valmistelut tehtiin aivan kuten väkevöidyn supernatantin kohdalla, vertailun mahdollistamiseksi, mutta steriiliä LYHBHI-liuosta ei tarvitse sentrifugoida. Kasvatusliemi siis jäädytettiin nestetypessä ja pakastekuivattiin (laite: Virtis Company inc, Gardinier NY 12525). Lopulta tuote resuspensoitiin uudestaan, kymmenen kertaa alkuperäistä tilavuutta pienempään määrään PBS-liuosta, jolloin konsentraatio saatiin vahvistettua kymmenkertaiseksi. Tämän jälkeen tuote voitiin jakaa hiirille. Isofluraanikaasua käytettiin hiirten anestesian aloittamiseen ja ylläpitoon TNBSliuoksen ruiskuttamisen yhteydessä. Ilman virtauksen perustasona pidettiin 0,6 l/min. Aloittamisvaiheessa, nukuttamiseen käytettiin isofuraanikaasun virtausnopeutta 3 l/min, anestesian ylläpidossa käytettiin 1,5 l/min kaasunvirtausta. Koeasetelma I Koejärjestelyissä oli viisi kymmenen BALB/c-hiiren ryhmää. Tutkittavista ryhmistä toinen sai elävää Faecalibacterium prausnitzii -bakteeria sekä TNBS:a, toinen ryhmä F praun supernatanttia ja TNBS:a. Bakteerin kasvatusalustan mahdollinen vaikutus tulehdukseen kontrolloitiin antamalla sekä sitä että TNBS:a yhdelle ryhmälle. Positiivisena kontrolliryhmänä toimivat hiiret, jotka saivat puskuriliuosta (PBS) sekä TNBS:a ja negatiivisena kontrolliryhmänä hiiret, joille annettiin puskuriliuosta (PBS) sekä fysiologisen suolaliuoksen (0,9 % NaCl) ja etanolin 50 % seosta (suhde 50:50). Kokeen ensimmäinen päivä (päivä -5) alkoi kunkin hiiren yksilöllisellä punnitsemisella. Sitä seurasi annosten jakaminen, mitä jatkettiin aina kokeen loppuun asti: yhteensä seitsemän päivää, päivinä Annokset jaettiin ohuella, ruiskuun kiinnitetyllä 42\n43 katetrilla suoraan mahalaukkuun, käyttäen kullekin liuokselle omia välineitä. Elävää bakteerikantaa saavalle ryhmälle annettiin päivittäin 1x10 9 1x10 10 kpl bakteeriannos, konsentroitua bakteerimassaa lisättynä PBS-liuokseen, yhteensä 500µl. Toiselle ryhmälle tehtiin vastaava toimenpide, mutta bakteerien sijasta hiiriin ruiskutettiin 500µl elävästä bakteerimassasta saatua supernatanttia. Kasvatusliemiryhmä sai tämän ajan vastaavan määrän kasvatusliemestä konsentroitua uutetta ja muut kontrolliryhmät saivat 500µl pelkkää PBS-liuosta (Kuva 13). Lopetus F. prausnitzii, supernatantti, kasvatusliuos Päivittäinen annos, 500 µl TNBS Positiivinen kontrolliryhmä Päivittäinen annos: PBS, 500 µl TNBS Negatiivinen kontrolliryhmä Päivittäinen annos: PBS, 500 µl NaCl - alkoh. D -5 D 0 D +2 Kuva 13. Kaavakuva TNBS-tulehdusmallin toteutuksesta Kuudentena päivänä kokeen aloittamisesta (päivä 0) ryhmät saivat suunnitelman mukaan joko tulehduksen aiheuttavan TNBS-annoksen (100mg/kg) tai vaihtoehtoisesti suolaliuos-etanoliseosta (negatiivinen kontrolliryhmä). Myös tässä yhteydessä, ennen muita toimenpiteitä, hiirten painot kirjattiin ylös. Liuokset ruiskutettiin suoleen peräaukon kautta, n. 4 cm etäisyydelle peräaukosta 3.5 kokoisella, taipuisalla muovikatetrilla (French catheter, Solomon Scientific, Ranska). Ruiskeen jälkeen hiiriä pidettiin hännästä ylhäällä n. 40 sekuntia, jotta liuos ei valuisi ulos liian aikaisin ja ehtisi vaikuttaa. Koehiiret nukutettiin tämän toimenpiteen ajaksi isofuraanikaasulla (ilmanvirtaus 0,6 l/min, isofuraani: nukuttamiseen 3 l/min ja ylläpitoon 1,5 l/min). Seitsemäntenä päivänä (päivä +1) hiiret saivat ainoastaan päivittäisen annoksensa. TNBS-ruiskeelle annettiin kahden vuorokauden vaikutusaika: 48 h kuluttua sen antamisesta (päivä +2) hiiret lopetettiin saattamalla kaularanka sijoiltaan (kervikaalinen 43\n44 dislokaatio), kun punnitus oli ensin suoritettu. Tämän jälkeen koehiirille tehtiin ruumiinavaus ja niistä otettiin tarvittavat näytteet. Normaali Ameho 1-2 Näytteet ja kerätty tieto Kokeen kuluessa suoritetut hiirten painonmittausten lukuarvot syötettiin tietokoneelle, taulukoitiin ja tilastoitiin. Erityisen kiinnostuksen kohteena oli muutos hiirien painossa TNBSruiskeen antamishetkestä kokeen loppuun (48 h). Kun punnitukset oli suoritettu, kokeen jatko sokkoutettiin: häkkien tunnukset muutettiin siten, etteivät tutkijat tienneet mikä hiiriryhmistä kulloinkin oli käsillä. Ameho 3-4 Ameho 5-6 Kuva 14. Ameho-asteikko visuaalisesti, TNBS-malli. (Kuva: H. Sokol) Ruumiinavauksen yhteydessä paksu- ja ohutsuoli otettiin talteen ja laitettiin kuivumisen ehkäisemiseksi lasille asetetulle, PBS-liuoksella kostutetulle paperille. Paksusuolen pituus mitattiin tarkoin, sitten suoli leikattiin auki pituussuuntaan ja myös sen leveys mitattiin proksimaali-, keski-, ja distaaliosassa. Suolen pinnalta kaavittiin pumpulipuikolla mahdollisimman suuri ulostenäyte, jota säilöttiin näytteiden oton aikana jäämurskassa (ruuvikorkkinen Starstedt 2 ml putki), kunnes ne vietiin -80 pakastimeen odottamaan mikrobiston koostumuksen arvioimista (real time PCRmenetelmä, DNA:n eristämisen jälkeen). Tämän jälkeen limakalvo puhdistettiin PBS-liuoksella ja vauriot arvioitiin silmämääräisesti Wallacen asteikolla (Wallace ym. 1989) arvottaen (pisteytys 0 10), kahden tutkijan toimesta. Tämä makroskooppinen tarkastelu on erittäin vakiintunut ja luotettava hiirikokeissa (LIITE 4), jopa mikroskooppiseen tarkasteluun verraten (Foligné ym. 2006). Se kuvaa tulehduksen ankaruutta, limakalvon paksuuntumista sekä haavaumien levinneisyyttä. 44\n45 Paksusuolesta otettiin myös kudosnäytteet histologista arviointia varten: 1cm kaikkein tulehtuneimmasta kohdasta käärittiin tikun ympäri ja laitettiin PBS:lla puskuroituun, 4 % huoneen lämpöiseen formaliiniin kiinnittymään ja upotettiin parafiiniöljyyn. Näytepalasten eri kohdista tehtiin kaikki kerrokset kattavia, 4µm paksuisia kudosleikkeitä, jotka värjättiin hematoksyliinillä ja eosiinilla mikroskopointia varten. Myös mikroskooppiset kudosvauriot arvioitiin sokkona valmiilta laseilta, tarkkaan määritellyin perustein (Ameho ym. 1997, LIITE 4). Asteikolla 0 6 arvioidaan tulehduseritteiden tunkeutumisen laajuus kudoksessa ja arvioidaan onko epiteelissä kulumia, haavaumia tai kuolioitumista sekä arvotetaan vaurioiden syvyys ja pinta-ala (Kuva 14). Histologisten näytteiden jälkeen paksusuolesta otettiin vielä n. 0,5 1 cm pala jäämurskaan haudattuun Eppendorf-putkeen, jossa oli 1000 µl proteaasiestäjää sisältävää PBS-liuosta (Protease Inhibitor Cocktail Tablets, Roche ). Kudos homogenisoitiin lasijauheen kera Bead-Beater -käsittelyllä limakalvon entsyymien ja sytokiinien vapauttamiseksi. Seoksesta sentrifugoimalla (30 min, 4 C, rpm) saatu supernatantti laitettiin -80 pakastimeen. Myöhemmin siitä määritettiin ELISAmenetelmää hyödyntäen tulehduksen tasosta kertovat sytokiinipitoisuudet (TNF, IFN, IL-10, IL-12). Koeasetelma II Tämä koeasetelma sai alkunsa yhteistyötä kanssamme tekevän tutkimusryhmän tuloksista (ei vielä julkaistu). Taustalla oli myös tarve selvittää täytyykö Faecalibacterium prausnitzii -bakteerin olla nimenomaan suolenontelossa tulehdusta hillitsevän vuorovaikutuksen syntymiseksi puolustusjärjestelmän kanssa. Tähän perustuen koeasetelma toteutettiin muunneltuna tavalla, jonka on todettu toimivan probioottien tehon mittaamisessa (Foligné ym. 2005). Koeryhmät ja niiden saamien injektioiden sisältämät kemikaalit: Koeryhmä I sai elävää F. prausnitzii -bakteeria (10 9 bakteeria/annos) pistoksena vatsaonteloon (intraperitoneaalisesti, i.p.) ja TNBS-liuosta (100mg/kg) peräsuoleen (intrarektaalisesti, i.r.). 45\n46 Koeryhmä II sai pistoksena väkevöityä supernatanttia i.p. ja TNBS-liuosta (100mg/kg) i.r. Kontrolliryhmä I sai pistoksena elävää L. salivarius -bakteeria (kanta Ls-33) annoksella 4x10 9 kpl/ injektio i.p. ja TNBS-liuosta (100mg/kg) i.r. Kontrolliryhmä II sai pistoksena kortisoniliuosta (deksametasoni, 5 mg/kg) i.p. ja TNBS-liuosta (100mg/kg) i.r. Kontrolliryhmä III sai pistoksena voihappoa eli butyraattia (40 mmol/l) i.p ja TNBSliuosta (100mg/kg) i.r. Positiivinen kontrolliryhmä sai 0,9 % NaCl pistoksena i.p. ja TNBS (100mg/kg) i.r. Negatiivinen kontrolliryhmä sai 0,9 % NaCl pistoksena i.p. ja 0,9 % NaCl:n sekä 50 % etanolin seosta (tilavuudet 50:50) i.r. Koetta varten varattiin kullekin aineelle kymmenen hiiren ryhmä. Tutkimuksen ensimmäisenä päivänä jokaiselle hiirelle annettiin vatsaonteloon (i.p.) 200 µl pistos ainetta, joka määräytyi edustettavan ryhmän mukaan. Tunnin päästä pistoksesta hiirille aiheutettiin suolistotulehdus TNBS liuoksella noudattaen täsmälleen samaa tapaa kuin perinteisessä mallissa käytettiin: hiiret nukutettiin isofuraanikaasulla ja niiden peräsuoleen, n. 4 cm syvyyteen vietiin ohut, taipuisa katetri, jonka avulla hiiriin ruiskutettiin 500 µl haluttua liuosta (i.r.) (Kuva 15). TNBS-liuoksen valmistaminen ja annostelu i.r. on esitetty tarkemmin, kts Pistos, 200 µl F. prausnitzii, L. salivarius, supernatantti, deksametasoni, voihappo TNBS Positiivinen kontrollityhmä: suolaliuospistos TNBS Negatiivinen kontrolliryhmä: suolaliuospistos NaCl alkoh. T-1 T 0 h Kuoleman odottelua Kuva 15. Kaavakuva sovelletun TNBS-mallin toteutuksesta. 46\n47 Liuosten valmistaminen pistoksia varten Koeryhmä I, F. prausnitzii -ryhmä: Elävän F. prausnitzii -bakteerin PBS-liuokseen pohjautuva suspensio, joka valmistettiin kuten muita kokeita varten (6.2.2). Koeryhmä II, supernatanttiryhmä: Supernatantti valmistettiin, kuten muita kokeita varten (6.2.3) Vertailuryhmä I, probioottiryhmä: Tämä ryhmä sai suspensiota, joka sisälsi elävää Lactobacillus salivarius -bakteeria (kanta Ls-33). Ls-33 on tunnustettu probioottinen bakteeri ja sen tulehdusta hillitsevät ominaisuudet tunnetaan hyvin. Tästä johtuen bakteeria käytettiin positiivisena kontrollina probioottikokeessa. Bakteeripesäkkeitä kaavittiin kasvualustalta ja laitettiin vuorokaudeksi 37 C MRSliuokseen, joka on erityisesti laktobasilleille koostettu kasvatusliuos. Viljelmästä 60 ml sentrifugoitiin 5500 rpm, 10 minuutin ajan neljässä asteessa. Saatu solusakka sekoitettiin 3 ml PBS-liuosta, jolloin saatiin käyttöliuos koetta varten. Liuoksen bakteeripitoisuus (CFU) mitattiin spiraalimenetelmällä (Spiral Plate Method); annoksessa, joka hiiriin ruiskutettiin (200 µl), oli 4x10 9 bakteeria. Annostus osoittautui liian suureksi, sillä seuraavana aamuna kaikki tämän ryhmän hiiret olivat kuolleet (<24 h). Vertailuryhmä II, kortisoniryhmä: Deksametasoni on kortisolijohdannainen, joka antaa puolustusjärjestelmää lamauttamalla voimakkaasti tulehdusta hillitsevän vasteen. Kortisoneja käytetään yleisesti tulehdusten taltuttamiseen, tulehdukselliset suolistosairaudet mukaan lukien niiden aktiivisessa vaiheessa. Kortisoni palvelee siten hyvänä vertailukohteena, kun arvioidaan muiden aineiden tulehdusta hillitsevän vaikutuksen tehoa. Käytetty annostus oli 5 mg/kg ja hiirten keskimääräinen paino oli 25,1 g, joten niille valmistettiin kortisoniliuos, joka 200 µl annoksena sisälsi 125,5 µg deksametasonia. 47\n48 Vertailuryhmä III, butyraattiryhmä: Butyraatilla eli voihapolla on ainakin suolen epiteelillä tulehdusta hillitsevä vaikutus (Segain ym. 2000). Se on Faecalibacterium prausnitzii -bakteerin aineenvaihduntatuote, jota bakteeri muodostaa kasvuolosuhteiden ollessa edulliset. Butyraattia on siten myös bakteeriviljelmän supernatantissa. Voihappo liitettiin osaksi koetta ja sitä annosteltiin hiiriin sellaisena pitoisuutena, jonka tiedetään supernatantissa olevan (määritetty kaasukromatografialla). Tällöin voidaan tehdä paremmin oletuksia supernatantin tehon ja siinä olevan butyraatin yhteydestä. Kokeessa käytettiin butyraattiliuosta, jonka pitoisuus oli 40 mmol/l. Tämä vastaa väkevöidyn supernatantin butyraattipitoisuutta. Positiivinen/ Negatiivinen kontrolli: Käytimme steriiliä, fysiologista suolaliuosta, jolla ei oleteta olevan minkäänlaista positiivista eikä negatiivista vaikutusta hiirien terveyteen. Pistosten antamista varten hiiret pidettiin paikallaan niskanahasta kiinni pitäen, pistoskohta puhdistettiin 90 % alkoholilla ja ruiskutettavat aineet annettiin vatsaonteloon 27G½ neulalla, yhden millin ruiskuun kiinnitettynä. Näytteet ja kerätty tieto Tässä mallissa ei kerätty näytteitä, ainoastaan seurattiin hiirten vointia päivittäin. Lopettamisen sijaan vertailtiin tulehduksen edistymistä eri ryhmissä ja laskettiin kuolleet hiiret päivittäin. Arvosteluperusteena hoidon teholle, yleisen hyvinvoinnin tarkkailun lisäksi, käytettiin eri ryhmien edustajien selviämistä hengissä TNBS ruiskeen annosta eteenpäin (T = 0 h), sekä kuolleiden määrää eri päivinä: menettelytapa esti subjektiivisen tulosten käsittelyn Sytokiinien määritys ELISA-menetelmällä Proteiinipitoisuuden selvittäminen Bradfordin menetelmällä Ennen varsinaiseen tulehduksen välittäjäaineiden (sytokiinien) määrittämistä kustakin näytteestä tuli selvittää sen proteiinipitoisuus. Tähän käytettiin Bradfordin menetelmää (Bradford 1976). Lyhyesti, näytteistä tehtiin laimennossarjat joita, kulloisenkin suunnitelman mukaan, pipetoitiin 100 µl levyn kaivoihin (96 kaivoinen, tasapohjainen 48\n49 ja läpinäkyvä polystyrolilevy). Kullekin levylle tehtiin myös naudan seerumin albumiiniin (BSA) pohjautuva verrokkisarja (arvot 0, 2, 4, 6, 8, 10). Juuri ennen lukulaitteeseen (Tecan i-control infinite 200) syöttämistä, kaivoihin lisättiin vielä 100 µl vaikutusliuosta (Bradford reagent, Sigma) ja arvot luettiin 5 ja 10 min kohdalla. Tulosten erittely tehtiin niiden arvojen pohjalta, joiden vertailusarjasta muodostettu suora oli parempi ja vain tälle vakiosuoralle osuvat lukuarvot hyväksyttiin. Tulosten erittelyyn käytettiin Excel-ohjelmaa ja lopputuloksena saatiin proteiinin määrä näytteessä, yksikössä µg/ml. Enzyme linked immunosorbent assay, ELISA Saadaksemme tietoa eri hiiriryhmien kokeen aikana kehittämistä tulehdusvasteista, näytteistä selvitettiin neljän välittäjäaineen pitoisuudet: tumor necrosis factor (TNF- ), interferoni (IFN- ) sekä interleukiinit 10 ja 12 (IL-10, IL-12). Näistä IL-10 on tulehdusta hillitsevä ja siltä suojaava (anti-inflammatorinen) vaikutus, muut mitatut välittäjäaineet edustavat tulehdusketjuun osallistuvia preinflammatorisia sytokiineja (Kuva 16). Kullekin määritettävälle sytokiinille oli hankittu seuraavat kaupalliset testivalmiit pakkaukset (e-bioscience): - Mouse TNF- ELISA Ready-SET-Go! - Mouse IFN- ELISA Ready-SET-Go! - Mouse IL-10 ELISA Ready-SET-Go! - Mouse IL-12 p70 ELISA Ready-SET-Go! TNF- IL-12 INF- IL-10 Menetelmä on kuvattu yksityiskohtaisesti, kts. LIITE 2. Kuva 16. Välittäjäaineiden epätasapaino suolistotulehduksessa. Tilanne on tyypillinen myös Crohnin taudille Ulosteen mikrobilajien määritys Nähdäksemme sekä tulehduksen että päivittäisen F. prausnitzii -annoksen vaikutuksen ulosteen vallitsevaan mikrobistoon, ulosteesta oli selvitettävä tärkeimpien mikrobilajien esiintyminen ja niiden määräsuhteet. Tämä toteutettiin eristämällä ulosteesta ensin DNA ja monistamalla valittujen alukkeiden avulla tiettyjä bakteerigeenijaksoja. Tämä 49\n50 suoritettiin reaaliaikaiseen polymeraasiketjureaktioon perustuvalla menetelmällä (real time PCR-menetelmä). DNA:n eristäminen Käytimme soveltaen ohjetta, joka kuuluu Kit G NOME-valmispakkaukseen (BIO 101, La Jolla, CA). DNA:n saostusprosessi on esitelty yksityiskohtaisesti LIITTEESSÄ 2. Muut kuin valmiista tarvelaatikosta löytyvät liuokset valmistettiin LIITTEEN 3 ohjeiden mukaan. Reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio (real time PCR) PCR-tekniikka on kehitetty haluttujen nukleotidiketjujen erottamiseksi ja monistamiseksi alkuperäisestä DNA:sta, olettaen, että etsitty kohdealue eli templaatti on läsnä tutkittavassa näytteessä. Reaaliaikaisessa polymeraasiketjureaktiossa kohde-dna:n monistumista seurataan jokaisen monistussyklin jälkeen. Standardisuoran avulla voidaan laskea templaatin määrä alkuperäisessä näytteessä suhteellisen helposti; lukulaite mittaa tuotetta havainnoivan merkkiaineen fluoresenssia ohjelman kierrosten aikana ja mitä enemmän etsittävää templaattia on näytteessä alun perin, sitä vähemmällä syklimäärällä muodostuu detektoitava määrä tuotetta. Työssä käytettiin sekä monistamiseen että tuotteiden havaitsemiseen soveltaen TaqMan Kit-valmispakkausta, 96 kaivon levyille: TaqMan universal PCR 2X master mix (Applied-Biosystems) sekä SYBR-Green PCR 2X master mix. Määritykset, ryhmä- ja lajikohtaiset 16S-rRNA:han kohdistuvat alukkeet ja tunnistimet löytyvät Taulukosta 1. Koska reaaliaikainen polymeraasiketjureaktio on äärimmäisen herkkä menetelmä, sen onnistumista täytyy seurata ja säädellä eri työvaiheiden aikana (kontrollit). Siksi ennen varsinaisen PCR-määrityksen aloittamista tarkistettiin näytekohtainen sisäinen positiivinen säätely (internal positive control, IPC). Tämän tarkoitus on saada erottumaan näytteiden antamat todelliset negatiiviset tulokset (ei templaattia) niistä vääristä negatiivisista tuloksista, jotka aiheutuvat eri häiriötekijöiden heikentäessä polymeraasiketjureaktiota tai sammuttaessa sen. Yksityiskohtainen menetelmän kuvaus, kts. LIITE 2. 50\n51 Taulukko 1. Kokeessa käytetyt ryhmä- ja lajispesifit 16S rrna-geeniin kohdistuvat alukkeet ja koettimet. Koettimet on paksunnettu. (Taulukko: Harry Sokol) Kohdebakteeri, menetelmä Aluke ja koetin Sekvenssi 5-3 Kaikki bakteerit (TaqMan) F_Bact 1369 R_Prok1492 P_TM1389F CGG TGA ATA CGT TCC CGG TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT T 6FAM-CTT GTA CAC ACC GCC CGT C C. leptum Clept 09 CCT TCC GTG CCG SAG TTA Clostridium leptum R. albus, R. Clept 08 GAA TTA AAC CAC ATA CTC CAC TGC TT (TaqMan) flavefaciens F. prausnitzii P-Clep 01 6FAM-CAC AAT AAG TAA TCC ACC Bifidobacterium (TaqMan) Bifidobacterium suku F_Bifid 09c R_Bifid 06 P_Bifid CGG GTG AGT AAT GCG TGA CC TGA TAG GAC GCG ACC CCA 6FAM-CTC CTG GAA ACG GGT G Clostridium C. coccoides Ccoc 07 GAC GCC GCG TGA AGG A coccoides Eubacterium ryhmä Ccoc14 AGC CCC AGC CTT TCA CAT C (TaqMan) Butyrivibrio ryhmä P_Erec482 VIC-CGG TAC CTG ACT AAG AAG Bacteroides (TaqMan) Bacteroides ryhmä Prevotella ryhmä Bacter 11 Bacter 08 P_Bac303 CCT WCG ATG GAT AGG GGT T CAC GCT ACT TGG CTG GTT CAG VIC-AAG GTC CCC CAC ATT G Escherichia coli E.coli F CAT GCC GCG TGT ATG AAG AA (SYBR-Green ) E.coli R CGG GTA ACG TCA ATG AGC AAA Faecalibacterium prausnitzii (SYBR-Green ) F. prausnitzii Fprau 07 Fprau 02 CCA TGA ATT GCC TTC AAA ACT GTT GAG CCT CAG CGT CAG TTG GT Lactobacillus/ Leuconostoc (SYBR-Green ) Lacto 05 Lacto 04 AGC AGT AGG GAA TCT TCC A CGC CAC TGG TGT TCY TCC ATA TA 51\n52 6.2.7 Tilastokäsittelyt Tulosten analysoinnissa käytetyt tilastolliset menetelmät olivat Student t-testi parittamattomalle tulosaineistolle ja epäparametrinen Mann-Whitney. Erot, joiden p<0,05 tulkittiin tilastollisesti merkitseviksi eroiksi. 6.3 Tulokset ja johtopäätökset Tulehdusmalleissa ilmeni ryhmien välillä tilastollisesti merkitseviä eroja, jotka on merkitty osiossa esitettyihin kuviin seuraavalla tavalla: p<0,05 = *; p<0,01 = **; p<0,003 = ***; p<0,001 = **** TNBS-malli I: koe nro 4 Makroskooppinen paksusuolen limakalvovaurioiden arviointi (Wallace) Kaksi tutkijaa arvioi sokkona Wallacen asteikolla paksusuolen limakalvon muutokset: pisteiden määrä kertoo tulehduksen voimakkuudesta. Merkittävä ero muodostui sekä Faecalibacterium prausnitzii -ryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän (p=0,007) että supernatanttiryhmän ja positiivisen kontrolliryhmän (p=0,02) välille (Kuva 17). Molemmat tutkimusryhmät jäivät välille 1 2, kun positiivisen kontrollin vauriot pisteytettiin välille 4 5. Viljelemättömällä kasvatusliuoksella ei ollut vaikutusta tulehduksen hillitsemisessä Histologinen arviointi (Ameho) Myös kudosleikkeet arvioitiin sokkona. Sekä elävä F. prausnitzii -bakteeri että sen supernatantti hillitsivät merkittävästi kudosvaurioita (p<0,01) positiiviseen verrokkiryhmään nähden (Kuva 17). Molemmissa tutkimusryhmissä jäivät kudosvauriot noin arvoon kaksi, kun taas vertailuryhmässä vastaava luku oli viisi. Viljelemättömällä kasvatusliuoksella ei ollut tehoa. 52\n53 Wallace score ** * Ameho score ** ** 0 F prausnitzii Supernatant Media Positive control Negative control F prausnitzii Supernatant Media Positive control Negative control Kuva 17. TNBS koemalli I:n koetuloksia. Vasemmalla on esitetty makroskooppisten vaurioiden arvioinnin tulos (Wallace), oikealla mikroskooppisen arvioinnin tulos (Ameho). Kuvan on laatinut Harry Sokol. Suolen pituuden muutos Suolen pituus on hyvä ja objektiivinen arvosteluperuste: tulehtunut kudos menettää joustavuutensa ja paksuuntuu. Sairas suoli menettää siis pituuttaan terveeseen verrattuna. Tässä tutkimuksessa mitattiin normaalin suolen pituudeksi keskimäärin 9,5 cm, positiivisen kontrollin tulos oli n. 7,5 cm. Käytettäessä tätä tulehduksen arvosteluperustetta, ainoastaan elävällä bakteerilla oli merkittävä myönteinen vaikutus positiiviseen kontrolliin nähden (pituus keskimäärin 8 cm, p=0,04). Supernatantin tai kasvatusalustaliuoksen ei sen sijaan voida katsoa vaikuttaneen suolen pituuteen (Kuva 19). Suolen tulehdusmuutoksia on havainnoitu Kuvassa 18. A B C D Kuva 18. Tulehduksen vaikutus suoleen. Kuvassa A on terveen hiiren pitkä suoli, jossa papanat näkyvät siistinä helminauhana. Kuvassa C on sama suoli avattuna. Kuvassa B nähdään TNBSaltistuksesta tulehtunut suoli, jossa uloste on löysää, jos sitä on lainkaan. Suolen loppuosassa nähdään raju tulehdusmuutos (nuoli). Sama suoli on avattuna kuvassa D. Tulehduksessa suoli myös lyhenee ja sen seinämä paksuuntuu. Valokuvat: H. Sokol, toteutus: E. Hirvonen 53\n54 Painon menetys Vapaalla ruokinnalla olevien 7 8 viikon ikäisten hiirten painon tulisi kasvaa normaalitilanteessa, kuten negatiivinen vertailuryhmäkin osoittaa (Kuva 19). Tulehdus on elimistöä voimakkaasti rasittava tila, ja puolustusjärjestelmän toimimiseksi tarvittavien välittäjäaineiden tuotanto kuluttaa energiaa. Lisäksi siinä missä normaali, terve eläin syö hyvällä ruokahalulla, kipeä eläin syö vähemmän, tai pahimmillaan lakkaa syömästä. Tämän lisäksi raju ripuli edesauttaa painonlaskua. Sairailla eläimillä paino putoaakin radikaalisti jo lyhyessä ajassa. Vaikka F. prausnitzii onnistui kaikkien muiden arvosteluperusteiden mukaan lievittämään tulehdusvaurioita positiiviseen kontrolliin verrattuna, hiirten painon menetystä se ei onnistunut estämään. Kahdessa päivässä ryhmän eläimet olivat keskimäärin hieman alle 9 % keveämpiä. Odotetusti pelkkä kasvatusliuos ei myöskään hyödyttänyt. Supernatantilla sen sijaan oli positiivinen vaikutus (p=0,02) ja se puolitti painonmenetyksen verrokkiryhmään nähden (Kuva 19). P N P N Colon length (cm) * Weight loss (%) F prausnitzii Supernatant Media Positive control Negative control F prausnitzii Supernatant * Media Positive control Negative control Kuva 19. Suolen pituuden vaihtelut (vasemmalla) ja painonkehitys eri koeryhmissä hiirillä TNBS I mallissa. Kuvan on laatinut Harry Sokol. 54\n55 Yhteenveto Faecalibacterium prausnitzii sekä sen supernatantti hillitsevät paksusuolentulehdusta TNBS-suolistotulehdusmallissa hiirellä. Merkittävää parannusta tapahtui monien arvosteluperusteiden kohdalla. Samaa ei voida sanoa puhtaasta kasvatusliuoksesta, joka oli bakteerikasvua lukuun ottamatta täsmälleen samoin valmistettu kuin supernatantti. Ryhmän aiemmin tekemät kokeet ovat osoittaneet myös, ettei UV-säteilyllä tapettu F. prausnitzii, bakteerin DNA tai sen solukalvot vaikuttaneet tulehdusta estävästi. Paksusuolen sytokiinit TNF- Sekä elävä F. prausnitzii -bakteeri että sen supernatantti vähensivät merkittävästi paksusuolen tuottaman TNF- -sytokiinin määrää positiiviseen vertailuryhmään nähden (Kuva 20). Pelkällä kasvatusliuoksella ei ollut vastaavaa vaikutusta. IL-12 Tulehduksen käynnistyttyä välittäjäaineiden määrien huomattava kasvu (NF- B:n toimesta) lisää tulehdusketjun välityksellä IL-12-tuotantoa synnynnäisen puolustusjärjestelmän soluissa. Tutkimus osoitti sekä F. prausnitzii -bakteerilla että sen supernatantilla olevan IL-12-sytokiinin eritystä hillitsevä vaikutus, verrattuna niin positiiviseen kontrolliryhmään kuin kasvatusliemiryhmäänkin (Kuva 20). Positiivisen kontrolliryhmän ja kasvatusliemi-kontrollin välille ei merkittävää eroa muodostunut. INF- Tässä kokeessa ainoastaan supernatantin ja negatiivisen kontrolliryhmän välille muodostui merkittävä ero. Pienistä eroista huolimatta elävää F. prausnitzii-bakteeria, kasvualustaliuosta ja positiivista kontrollia edustavien ryhmien sytokiinituotannon voidaan katsoa olevan samalla tasolla, eikä merkittävää poikkeamista myöskään näiden ja negatiivisen verrokin välille muodostu (Kuva 20). IL-10 Poiketen muista tarkasteltavista sytokiineistä, IL-10 suojaa tulehdukselta. Negatiivisen, positiivisen sekä kasvatusliemiryhmän tulos on samalla tasolla. Faecalibacterium prausnitzii vaikutti IL-10-eritykseen sitä lievästi lisäten, mutta ero muihin ryhmiin ei 55\n56 ole merkittävä. Sitä vastoin supernatantin ja kaikkien muiden, paitsi F. prausnitzii - bakteerin, välille syntyneet erot olivat merkittäviä (Kuva 20). TNF (pg/ g) *** 600 * IL-12 (pg/ g) **** 600 ** *** * IFN (pg/ g) 200 F. prausnitzii Supernatant 1500 ** Media Negative control Positive control IL-10 (pg/ g) 200 F. prausnitzii Supernatant Media Negative control ** *** *** Positive control F. prausnitzii Supernatant Media Negative control Positive control F. prausnitzii Supernatant Media Negative control Positive control Kuva 20. Paksusuolen sytokiinien esiintyminen koehiirillä TNBS I-mallissa. Kuvan on laatinut H. Sokol. Yhteenveto Faecalibacterium prausnitzii ja siitä valmistettu supernatantti vähentävät tulehdusta edeltävien sytokiinien TNF- ja IL-12 määrää. Lisäksi supernatantti lisäsi tulehdusta hillitsevän IL-10 sytokiinin tuotantoa TNBS-suolistotulehdusmallissa hiirellä. Siinä missä positiivinen verrokkiryhmä lisäsi tulehduksen välittäjäaineiden tuotantoa, ei IL-10 tuotanto juuri eronnut negatiivisesta kontrollista. Sitä vastoin koeryhmien proinflammatoristen sytokiinien tuotanto laski kohti normaalia, paitsi INF- osalta, joka 56\n57 ei eronnut positiivisesta kontollista. IL-10 tuotanto nousi selvästi F. prausnitzii- ja supernatanttiryhmissä. Mikrobistomuutokset Faecalibacterium prausnitzii -bakteeri kuuluu ihmisen suolistoon yhtenä mikrobiston tärkeimmistä lajeista (Suau ym. 2001) ja juuri tämän mikrobin väheneminen aiheuttaa Clostridium leptum ryhmän osuuden pienenemisen Crohnin taudissa (Martinez-Medina ym. 2006): C. leptum -ryhmässä on havaittu suurimmat muutokset Crohnin tautia sairastavilla ja ryhmää edustavien bakteerien määrä on tavallista alhaisempi (Frank ym. 2007). Kuten ihmiselläkin, hiirellä tämän ryhmän edustajat kuuluvat vallitsevaan mikrobistoon (Wilson ym. 2006), vaikka F. prausnitzii ei esiinnykään valtalajina. Clostridium coccoides -ryhmä on C. leptum -ryhmän lisäksi toinen tärkeä Firmicutes - pääjakson edustaja (Kuva 9). Sen lajien on todettu merkittävästi vähenevän ihmissuolessa haavaista paksunsuolentulehdusta sairastavilla terveisiin nähden (Sokol ym. 2006). Toisin kuin ihmisen paksusuolessa, laktobasillit kuuluvat hiirellä vallitsevaan mikrobistoon, mikä tekee kyseisen ryhmän mittaamisesta järkevää käytetyssä mallissa (Wilson ym. 2006). Ihmisen mikrobiston koostumusta tutkittaessa Bacteroides -ryhmän osuus on osoittanut kaikkein suurinta vaihtelua niin terveellä kuin sairaalla (Corthier ym. 2007, Manichanh ym. 2006, Scanlan ym. 2006, Seksik ym. 2003). Myös hiiren suolistossa ryhmän bakteereja elää runsaasti (Wilson ym. 2006). Crohnin taudissa sekä ulosteen että limakalvon enterobakteerien määrä on noussut selvästi terveeseen nähden (Darfeuille-Michaud ym. 2004, Giaffer ym. 1992, Kotlowski ym. 2007). Siksi myös E. coli on valittu tutkimuskohteeksi. 57\n58 Tulokset Bakteerien kokonaismääriä mitatessa ainoastaan positiivisen ja negatiivisen kontrolliryhmän välille muodostui tilastollisesti merkittävä ero (p<0,01: Kuva 21). Tulehduksessa bakteerien kokonaismäärä nousee. Myös tutkimusryhmissämme bakteerien määrä on lievästi koholla negatiiviseen kontrolliin nähden, mutta ero ei ole tilastollisesti merkittävä. Ero ei ole merkittävä myöskään positiiviseen kontrolliryhmään verrattuna. All bacteria (log10) Positive control ** Negative control F. prausnitzii Supernatant Kuva 21. Kokonaisbakteerimäärät eri koeryhmissä. (H. Sokol) Tutkimustuloksen (PCR) perusteella minkään ryhmän välille ei Lactobacillus -bakteerin kohdalla muodostunut tilastollisesti merkittävää eroa (Kuva 22). Lactobacilli(log10) Mallissamme tulehdus on bakteerimäärän alentuman sijaan nostanut bakteerimäärää Clostridium leptum - ryhmässä, ja kontrolliryhmien välillä on suuri ero (p<0,003: Kuva 23). Myös supernatanttiryhmän ja negatiivisen verrokin välille syntyy tilastollisesti merkittävä ero (p < 0,05). Muiden ryhmien kesken ei eroja muodostu. F. prausnitzii ja sen supernatantti oikaisevat hieman TNBS:n aiheuttamaa vinoumaa. Bacteroides -ryhmän bakteereita mitattaessa: positiivisen ja negatiivisen vertailuryhmän väliin jää selvä tilastollinen ero (p<0,001), samoin molempien koeryhmien (samalla tuloksella) ja negatiivisen verrokin välille (p<0,05). Tulehdus siis lisäsi bakteeriryhmän edustajien määrää. Eroa tulehtuneen hoitamattoman sekä hoitoa saaneen suolen välille ei kuitenkaan muodostu (Kuva 24). C. leptum (log10) 9 Positive control Negative control F. prausnitzii Supernatant Kuva 22. Lactobacillus -bakteerin esiintyminen eri koeryhmissä. (H. Sokol) Positive control *** Negative control * F. prausnitzii Supernatant Kuva 23. Clostridium leptumryhmän bakteerien esiintyminen eri koeryhmissä. (H. Sokol) 58\n59 Tässä mallissa jokainen ryhmä on antanut suurin piirtein saman tuloksen Escherichia coli -bakteerin määriä mitattaessa (Kuva 25), eikä ainakaan TNBS:n aiheuttama tulehdus näyttäisi vaikuttavan E. coli - määrään. Bacteroides (log10) **** p=0.06 * * Tässä mallissa hoitamaton tulehdus on vaikuttanut Clostridium coccoides -ryhmän bakteereihin nostamalla niiden määrää merkittävästi terveisiin verrattuna (p<0,01). Muiden ryhmien välille eroja ei muodostu. (Kuva 26) 8 Positive control Negative control F. prausnitzii Supernatant Kuva 24. Bacteroides -ryhmän esiintyminen eri koeryhmissä. (H. Sokol) Bifidobakteerin kohdalla (Kuva 27) positiivisen ja negatiivisen vertailuryhmän tulos on likipitäen sama, eikä merkittävää eroa ole. Myös elävää bakteeria saaneiden hiirten tulos on samaa luokkaa. Sitä vastoin tilastollisesti merkittävä ero syntyy supernatantti-ryhmän ja kaikkien muiden ryhmien välille Bifidobacterium -bakteerimäärän suhteen. Merkittävin on ero positiiviseen kontrolliin (p<0,003), hieman pienempi F. prausnitzii -ryhmään (p<0,01) ja pienin negatiiviseen kontrolliin (p<0,05) verrattaessa näiden ryhmien tuloksia supernatanttiryhmän tuloksiin. Myös hiiren suolessa F. prausnitzii -bakteeria esiintyy jonkin verran, mutta se ei kuulu tärkeimpiin edustajiin. Kuvasta 28 nähdään, että tulehdus on pienentänyt F. prausnitzii -osuutta ja ero on merkittävä terveeseen suoleen verrattuna: p<0,05 negatiivisen ja positiivisen kontrolliryhmän välillä ja bakteerien määrässä havaitaan 15-kertainen lasku tulehduksesta johtuen. Positiivisen kontrolliryhmän E.coli (log10) Positive control Negative control F. prausnitzii Supernatant Kuva 25. Escherichia coli -bakteerin esiintyminen eri koeryhmissä. (H. Sokol) C. coccoides (log10) 8 ** 7 6 Positive control Negative control F. prausnitzii Supernatant Kuva 26. Clostridium coccoidesryhmän esiintyminen eri koeryhmissä. (H. Sokol) 59\n60 ja elävää bakteeria saaneen ryhmän välille muodostuu myös merkittävä ero (p<0,05) ja bakteerimäärissä on 10-kertainen ero. Supernatantin tulos on jonkin verran parempi kuin positiivisen kontrollin, mutta ei tilastollisesti merkittävä. Yhteenveto Käsittely Faecalibacterium prausnitzii -bakteerilla tai sen viljelmästä valmistetulla supernatantilla pyrkii tasapainottamaan tulehduksesta johtuvaa mikrobiston epätasapainoa (dysbioosi) TNBS-suolistotulehdusmallissa hiirellä. Bifidobacteria (log10) Positive control Negative control *** F. prausnitzii Supernatant Kuva 27. Bifidobacteriumbakteerin esiintyminen eri koeryhmissä. (H. Sokol) * ** Näiden tulosten perusteella vaikeassa tulehduksessa kokonaisbakteerien määrä nousee, myös C. leptum-, Bacteroides- ja C. coccoides -ryhmien osalta (positiivinen kontrolli). Sitä vastoin eroa negatiiviseen kontrolliin ei muodostunut Lactobacillus - ryhmän tai Escherichia coli -bakteerin osalta. Ainoastaan F. prausnitzii väheni tulehduksen vaikutuksesta. Koeryhmille annetulla hoidolla oli pyrkimys vastustaa tulehduksen aiheuttamaa vääristymää (dysbioosia) mikrobistossa. Etenkin käsittely elävällä F. prausnitzii -bakteerilla toi kyseisen bakteerin määrää lähemmäs normaalia. Jostain syystä supernatanttiryhmässä bifidobakteerien ja E. coli -bakteerin määrä väheni. F.prausnirzii (log10) 8 * * Positive control Negative control F. prausnitzii Supernatant Kuva 28. F. prausnitziibakteerin esiintyminen eri koeryhmissä. (H. Sokol) Pohdintaa Tässä mallissa elävällä F. prausnitzii -bakteerilla on selvästi tulehdukselta suojaava vaikutus TNBS-kemikaalilla aiheutettua tulehdusta vastaan hiirellä: teho näkyy taipumuksena tuoda mitattuja muuttujia kohti normaalia (negatiivinen kontrolliryhmä) lähes kaikissa arvosteluperusteissa. Myös supernatantilla on selvä myönteinen vaikutus, joskin hieman heikompana, kuin elävällä bakteerilla. 60\n61 Suoliston hyvinvoinnissa mikrobiston koostumus on oleellinen: se määrää suolen ekosysteemin toiminnallisen tasapainon, jolla on suuri merkitys myös isännälle. Tähän vaikuttavat muun muassa lajien keskinäiset suhteet, määrät ja eritetyt aineenvaihduntatuotteet. Suhde toimii myös toisin päin: tiettyjen aineenvaihduntatuotteiden läsnäolo muokkaa mikrobiston ekosysteemiä. Näin ollen mikrobiston epätasapaino saattaa johtaa lajien määrälliseen ja laadulliseen vinoumaan, jolloin isännän kannalta vääränlaiset bakteerit saavat liikaa elintilaa. Tämä voi johtaa suolen ongelmiin, jopa vaurioitumiseen, tai vaikeuttaa suolen parantumista, mikäli se on vaurioitunut. Faecalibacterium prausnitzii -bakteeri tuottaa suolen epiteelille tärkeitä aineita, kuten butyraattia. Se sekä suojaa että ravitsee soluja. Lisäksi se vaikuttaa suoliston mikroympäristöön ja siten muokkaa sen ekosysteemiä. Myös TNBS-mallissa tällä saattaa olla merkitystä. Siinä missä Crohn-potilaan mikrobistossa on todettu epätasapainoa ja alentunut F. prausnitzii -bakteerin määrä (Scanlan ym. 2006, Seksik ym. 2003, Martinez-Medina ym. 2006), sama ilmiö toistui tulehdusmallissa hiirellä. F. prausnitzii oli ainoa bakteerilaji, joka väheni tässä mallissa tulehduksen vaikutuksesta. Sitä vastoin tulehdus on nostanut bakteerimäärää Clostridium leptum -ryhmässä, johon F. prausnitzii kuuluu. Myös Clostridium coccoides -ryhmän toinen tärkeä Firmicutes - pääjakson edustaja bakteereiden määrä on mallissa lisääntynyt: hoitamaton tulehdus on vaikuttanut ryhmän bakteereihin nostamalla niiden määrää merkittävästi terveisiin verrattuna. Hiiren normaalissa suolistossa runsas Bacteroides-ryhmän edustus on samoin tulehduksen vaikutuksesta selvästi kohollaan. Epäilyttäviä, mahdollisesti tulehdukseen liittyviä Escherichia coli -kantoja on löytynyt Crohn-potilailta useita (Darfeuille-Michaud ym. 2004, Kotlowski ym. 2007), mutta hiirimallissa tulehduksella ei ollut vaikutusta E. coli -määrään. Verrattuna hoitamattomaan tulehdukseen (positiivinen kontrolliryhmä), päivittäinen elävän F. prausnitzii -bakteerin annostelu lisäsi tämän bakteerin määrää ja toi myös muita tutkittuja, joko hiiren tai ihmisen suolistolle tärkeitä, bakteeriryhmiä tai -lajeja lähemmäs negatiivisen kontrollin tuloksia. Myös bakteerin aineenvaihduntatuotteilla (supernatantti) oli samansuuntaisia vaikutuksia. 61\n62 TNBS-suolistotulehdusmallissa hankitun immuniteetin soluilla on tärkeä osuus tulehduksen aiheuttamisessa ja etenkin jatkumisessa: ne tuottavat muun muassa esitulehduksellisia sytokiineja. F. prausnitzii ja sen supernatantti antoivat hyviä tuloksia joidenkin sytokiinien kohdalla, mutta vaikutusta INF- -eritykseen ei ollut tässä mallissa. IL-12-sytokiinin viesti lisää INF- -eritystä. Sikäli on erikoista, että IL-12 määrän vähentymisestä huolimatta F. prausnitzii ja sen supernatantti eivät vähentäneet INF- määrää. Ottaen huomioon hoidon menestyksen juuri tässä mallissa, on mahdollista, että F. prausnitzii ja/ tai sen aineenvaihduntatuotteet hillitsisivät tulehdusta suoraan puolustusjärjestelmään vaikuttaen. Itse asiassa viitteitä tästä on jo saatu muun muassa butyraatin osalta, jota konsentroidussa supernatantissa on suuret määrät. Myös tutkimusta elävän bakteerin vaikutuksista in vitro on aloiteltu lupaavin tuloksin. Lopulta niin bakteerin kuin supernatantinkin vaikutukset näyttäisivät perustuvan bakteerin erittämiin aineenvaihduntatuotteisiin ja/ tai muuhun vuorovaikutukseen puolustusjärjestelmän sekä suoliston mikrobiston kanssa. Sitä mikä lopulta tehon antaa, ei tiedetä varmuudella. Kuva 29. Kokeen henki. (Valokuvat: H. Sokol) TNBS-malli II Tuloksia Vatsaontelon pistoksen ja peräsuoleen annettavan TNBS-annoksen jälkeen tärkein arvosteluperuste mallissa oli eri koeryhmien hiirten selviäminen hengissä (Kuva 31). 62\n63 Samalla tarkkailtiin myös ryhmän edustajien yleiskuntoa (Kuva 30). Aluksi myös ryhmien keskimääräinen paino mitattiin kolmen vuorokauden välein, mutta tästä luovuttiin, sillä jo koeasetelma itsessään aiheutti vinoumaa tuloksiin: heikoimpien yksilöiden kuollessa paino mitattiin aina ryhmään jäävistä, vahvimmista yksilöistä. Koetta jatkettiin, kunnes ryhmiin viimeisinä jääneet yksilöt näyttivät lopulta selviävän hengissä, eikä kuolleita hiiriä ilmaantunut muutamaan päivään missään ryhmässä. Koetta ylläpidettiin yhteensä 20 vuorokauden ajan. Negatiivisen kontrolliryhmän kaikki edustajat säilyivät hyvissä voimissa viimeiseen päivään. Sitä vastoin positiivisen kontrolliryhmän hiiristä vain yksi, alusta asti muita paremmin tulehdusta vastustanut yksilö, kesti loppuun asti. Ryhmän jäsenet alkoivat kuolla kolmannesta päivästä alkaen ja viidentenä päivänä jo 40 % oli menetetty. Tämän jälkeen kuolemien määrä alkoi tasoittua, mutta viimeinen hiiri kuoli vielä yli kahden viikon jälkeen, 17. päivänä. (Kuva 31.) Kuva 30. Silmämääräinen ero huonokuntoisen (vasemmalla) ja hyväkuntoisen hiiren välillä. Eroa karvan kunnossa kuvasta ei ole helposti havaittavissa. (Valokuvat: H. Sokol) Elävää Faecalibacterium prausnitzii -bakteeria saaneet hiiret kestivät positiivista vertailuryhmää paremmin: siitä menehtyi kokeen aikana puolet. Ensimmäinen hiiri kuoli päivänä viisi ja vielä päivänä 10 ryhmästä oli jäljellä 80 %. Tämän jälkeen, aika yllättävästi ryhmän jäsenten alkaessa jo näyttää terveemmiltä viimeiset kolme yksilöä heikkenivät ja ne menetettiin tasaisesti päivinä 11, 13 ja 16. Supernatanttiryhmän jäsenet puolestaan voivat hienosti alusta loppuun. Yksikään hiiri ei kuollut, ja sekä niiden vireystila että ulkonäkö olivat parissa päivässä negatiivisen kontrolliryhmän tasolla. (Kuva 31.) Selvittääksemme butyraatin osuuden supernatantin tehosta, sitä annettiin erikseen yhdelle ryhmälle (samana pitoisuutena kuin F. prausnitzii viljelmän supernatantissa). Tulokset eivät juuri poikenneet positiivisen kontrolliryhmän käyrästä, tosin ensimmäisinä päivinä hiiret kuolivat vieläkin nopeammin: päivänä viisi jo puolet 63\nWHO:n Antimikrobinen resistenssi viikko 16-22.11.2015\nWHO:n Antimikrobinen resistenssi viikko 16-22.11.2015 WHO:n Strategia & Tavoitteet Antimikrobisesta resistenssistä (AMR) Bakteerien, loisien, virusten, sienien hoitoon käytettyjen antimikrobisten lääkkeiden\nPesässä on aina yli 20 C ja sikiöinnin aikana yli 30 C, suhteellinen kosteus sikiöalalla on yli 90 %\nMehiläiset ja taudit Mehiläispesässä on runsaasti hiilihydraatteja, valkuaisia ja rasvoja Lisäksi siellä on suuri joukko tiiviissä kosketuksessa toisiinsa olevia toukkia ja aikuisia mehiläisiä Sama hengitysilma