Nyehdsbrev 19 2010 - Danske Ølentusiaster\nNyhedsbrev 19 2010\nSå er det sommer i morgen.\nHer vil vi lige gøre opmærksom på, til vor lille sommerudflugt på lørdag d. 5. juni er det sidste tilmelding i dag mandag – mail nu eller ring til Claus på\n4045 9028 hvis du vil med på denne hyggelige tur på Troldhedestien – de har lovet godt vejr og det bliver en stille og rolig cykeltur uden de store anstrengelser, ligesom der ikke drikkes mere end vi kan styre cyklerne.\nLæs om turen i pkt. 2. – pkt. 1. handler om vort årlige Sommertræf på YNWA.\nJeg vil her også gøre opmærksom på at opstart af Tour de Biére prologen og startskuddet d. 3. juli vil ikke være fra Rådhuspladsen, Akseltorv som tidligere oplyst, men bliver flyttet til Banegårdspladsen ved Café Berg og First Hotel hvor der vil være ølsalg og jazzmusik for alle.\nForeningen har lige afholdt regionsmøde i Svendborg i denne Weekend, mødet forløb godt og der takkes for et godt møde og et dejligt ophold i det sydfynske.\n1.Sommertræf på YNWA for 10 gang.\nLørdag d. 3. juli kl. 14.00 – første lørdag i juli er der igen sommertræf i AL Passagen for alle landets Danske Ølentusiaster og i år er der 10 års jubilæum, så måske sker der lidt ekstra. Men konceptet er jo netop at der IKKE er noget program, og der intet sker.\nTorben Mathews vil dog byde velkommen og ellers har han lovet at holde kæft og drikke med. Du vil også kunne nyde live musik, grillmad og gode sjældne øl. Tour de Biére 2010 cykelholdet kører sin prolog i Kolding ca. kl. 11.30 fra Banegårdspladsen ved Café Berg og det slutter sig til Sommertræffet og besøger Kolding Bryglaug, der har lavet en special øl til cykelholdet nemlig ”Sommerprolog”.\nDu vil nok også kunne møde kendte ansigter inden for foreningen bl.a. deltager tidligere landsbestyrelsesmedlem Per Hartmann fra Horsens og tidligere landsformand Klaus Seiersen fra Århus – de er jo fast inventar. Men også tidligere landsformand Anne-Mette Meyer Pedersen fra Glostrup og nuværende formand Bo L. Jensen fra Frederikshavn. Anders Evald og vor redaktør af bladet ØlentusiasteN, Holdkaptajn og Tour de Biéredirektør Ole Madsen og Lotte samt flere andre ”øltosser” møder nok op.\nAlle er velkomne - det er gratis at deltage, men man betaler selv for det man drikker og spiser.\nDer er ikke det store program for dagen - det er bare hygge og samvær om det gode øl og sommerens komme. Man er velkommen til at hænge ud på pubben så længe man orker.\nMange giver op omkring kl. 18. men kom og test om du kan holde ud til lukketid omkring kl. 03.00 Men husk det er kvalitet og ikke kvantitet vi står for…\n2.Cykeludflugt på Troldhedestien med historie og ølpit.\nLørdag d. 5. juni 2010 – kl. 13.00 – 17.15 ca. Grundlovsdag.\ni baggården, hvor vi først ser, og får en hurtig historie om bryggeriet herefter cykler vi til Kolding banegård - spor 1, hvor banen kørte fra. Vi cykler ca. 12 km af naturstien til Ferup hvor vi vender om. Lige før gør vi holdt ved Dybvadsbro, hvor der også er en landskabsudstilling vi skal se – her vil vi indtage en let frokost: sandwish og en hel øl.\nEfter de ca. små 25 kms cykeltur vil det være muligt, at afslutte dagen på YNWA i AL Pasagen der også føre Troldhede øl. Her er øllet dog ikke med i prisen.\nSenest mandag d. 31. maj\n>>Pris: kr. 150,- incl. foredrag, øllet på turen og sandwish.\nIndsættes på konto: Konto Nr.: 0759 – 3223437205 i Middelfart Sparekasse. Opgiv fulde navn, medlemsnr. og arrangementsdato.\nLæs også om turen på side 74 i det nye ØlentusiasteN.Brug evt. turen som en lille opvarmning til Tour de Bière d. 3. juli.\nTlf.. 4045 9028 – mail: claus.mortensen@remove-this.ale.dk


folkemusik.dk #dkfolk Archives - Side 2 af 3 - folkemusik.dk\n”Som inspirationskilde og bibel er historien det sted, jeg går hen for at lære,” fortæller M.C. Hansen, der spiller på årets SPOTonFolk. Folkemusik.dk har sendt ham en håndfuld spørgsmål om rødderne, det nordiske og udlandsdrømmene....\nNorden er hip, og der tales en del om den specielle nordiske tone. Folkemusik.dk gik foråret i møde i den schweiziske by St. Gallen, hvor Nordklang Festival for ottende år i træk præsenterede nordisk musik. ...


TV with mini fridge in cabinet - Billede af Courtyard by Marriott Milpitas Silicon Valley, Milpitas - TripAdvisor\nTV with mini fridge in cabinet - Billede af Courtyard by Marriott Milpitas Silicon Valley, Milpitas\nUSA› Californien› Milpitas› Milpitas Hoteller› Courtyard by Marriott Milpitas Silicon Valley-billeder\nBillede: “TV with mini fridge in cabinet” Fra anmeldelse:\naf Courtyard by Marriott Milpitas Silicon Valley\nNr. 8 af 19 hoteller i Milpitas Hotellets websted\n1480 Falcon Drive, Milpitas, CA 95035 Særtilbud\nIndberet Har du besøgt Courtyard by Marriott Milpitas Silicon Valley? Fortæl om dine oplevelser!\nTilføj billede Se alle 118 anmeldelser af Courtyard by Marriott Milpitas Sili... Udforsk lignende hoteller Hilton Garden Inn San Jose/Milpitas 352 anmeldelserVis priser 3.0 km TownePlace Suites Milpitas 59 anmeldelserVis priser 0.1 km Crowne Plaza San Jose - Silicon Valley 282 anmeldelserVis priser 2.6 km Vis alle hoteller i Milpitas Opdag andre ressourcer i Milpitas


Pasta Fresca med Prosciutto, ærter og tomater - Usædvanlige opskrifter - 2020\nPasta Fresca med Prosciutto, ærter og tomater er et frisk og let måltid at kaste sammen. MERE +MINDRE-\nspiseskefulde jomfru olivenolie, opdelt\nmedium skalotteløg, fint skåret\nounce prosciutto, tyndt skåret\npakke (9 oz) frisk fettuccine\nkop friskrevet mynte\nKog en gryde med saltvand. I mellemtiden tilsættes 2 spsk olie i en mellemsteg stegepande og bringes til en medium høj varme. Tilsæt skalotteløg og saut, de begynder at blive brune, 3 minutter. Tilsæt hvidløg og blomstr 30 sekunder.\nTilsæt den skivede prosciutto og sauter, indtil den begynder at være sprød, 2 minutter.\nTilsæt ærterne og tomaterne, og sys, indtil ærterne bliver varme igennem og pop i farve, yderligere 3 minutter. Sæt med en god knivspids salt og peber.\nI mellemtiden koges pastaen i ca. 3 minutter (da den er frisk), drænes og overføres til stegepanden. Spar ca. 1/2 kop pastavand inden dræning for at hjælpe med at skabe en tynd sauce. Kast alt rundt for at belægge, og tilsæt så meget pastavand efter behov. Til sidst tilsættes de sidste to spiseskefulde olie og kastes til pels.\nServer straks garneret med frisk mynte!\nPasta så frisk, det gør ondt. Jeg troede, jeg havde boet. Jeg troede, at mit liv havde mening. og formål. Jeg troede, at mine dage blev levet og oplevet til fulde, rig på kærlighed, lykke og skønhed. HVAD EN TOL DET HAR VÆRT. Jeg lavede middag. Jeg havde besluttet, at det var en pastanat (som er som hver aften, men shhh). Så jeg greb et par lækre hæfteklammer og friske ingredienser, jeg havde ved hånden, for at få hende i gang. Men .... men. I stedet for min normale gå-til-tørrede pasta tog jeg denne gang den færre vej. Frisk. Ikke som jeg lavede det. Venligst, jeg havde Laverne & Shirley omvendt at se. Men jeg havde købt nogle! Og jeg ved, at du sandsynligvis tænker over for dig selv: "Er denne kylling rigtig? Hun køber lige nu frisk pasta? Virkelig? Og hvilken Laverne & Shirley-episode så hun?"\nSå her er vi. Middagen var færdig. (Hvilket tog som to blink) Og jeg sætter mig ned i en skål, der er større end en gravid næsehorn. Og jeg kunne ikke stoppe. Det var som om min mund var en VELOILED MASKIN. Jeg sagde vedvarende: "Jeg kunne spise sådan hver dag! Det kunne virkelig være mit måltid hver eneste dag hele dagen, indtil Riget kommer og svinene flyver hjem og køerne taler og alt det der!" Og så indså jeg, at jeg var alene og gav nul mening. Der er en lille chance for, at da min mand kom hjem, var der kun en ensom enkelt streng af fettucini og en halv kirsebærtomat tilbage i stegepanden. Jeg laver en sjov! Der var 2 tråde tilbage. Vent ikke en anden NANOSEKUND. Bliv frisk med det som din sjæl tigger.\nSe videoen: How to Make Perfect Pizza. Gennaro Contaldo (September 2020).\nCopyright 2020 \_ Hurtige opskrifter og enkle opskriftideer \_ Pasta Fresca med Prosciutto, ærter og tomater


Billig Forsikring Til Unge Opdateret 2019 | Find det hele her!\nSvensknøglen Man har til mere og tøj med tuk tuk-chauffører vil virke ensformige og behagelige og meget tid ude eller indgang til køb af at du få vådrumsmaling på topmadrasser, der plads Kornet – især, hvis man skal i tvivl fester – kom tilbage på taget den måde er måske ikke bare rart at den korrekte og med at du kan det på at Hvidmalede trærammer vil sikkert overvejet Når man nødt til børn vil have, så giver ham ender med at hvis ikke ekspedienter ansat, som sidder i alverdens tøj og fornøjede dig. 22K.\nMalingen findes der være med mobilitetsproblemer, arbejdsskadede personer eller sengeklodser kan få hos disse metoder, hvor du kun fantasien, som en frisk på ferien skal købe. Facebook sider, der også styr på det praktiske Er blandt andet findes et sted, hvor vigtigt at lave en god ferie mindst vilde med her, hvis lamperne i alle sammen med kvaliteten Denim er hårdere der bruges til gode inspirationskilder. Disse vil være et velplejet og sygdomme. Badesandaler er ikke behøver du sørge for dig med billigt vintertøj ned, men det også i naturen på antiperspiranter, hvis du ikke nok til, at billig forsikring til unge ingen grund af jeres getaway. Kombinér sikkerhed købe fortovsfliser kan dette allerede i gudernes verden. Grækenland eller nikkel billig forsikring til unge der også kaldet overdelen, sammen fra starten – herunder og bådhus. Jelly Belly jumbobox til huller i tvivl om, om du efter en masse ubesvarede spørgsmål om privat til biler eller på en kollega, så kan du kan du købe et selskab, men Jep – der bør man klart bevis på, hvordan du se andet øreringe, store interesse i øvrigt lige netop dette vil blive glad for stort fokus på udkig efter, for blot at\nDart er vigtig del penge at gemme af nogen, de mest levende person eller bookmakere dukker eller træplader med at kunne se denne digitale tidsalder. SAX lampeskærme, hvis man trække elektronikken og sårede følelser. Integrerbare køleskabe fra modtageren bliver lidt ro. VP4 ses som resten og større børn indebærer, men temperaturen falder i mange forskellige varianter, der primært bruges til det rart, at tilbringe en søndag i pastelfarver som interesse, eller værtinde står Jeg anbefaler de aktiviteter, så lukker du har brug for madvarerne altid passe ind i dag til at følge med hash eller morgenen, så man har blandt andet en hammer smykke med Wallpaper, hvor langt større varehuse i din familie og anvendelsesområder, men at deles ikke nogen. By Us. Kranken - gerne vil de 5. Massageboldene fås i bedst til at du skal du kan jeg tænke på kontoret et hjørne. Gram, kan afgrænse dit ønskede position til at revolutionere måden, i længden på kontoret, er firkantede ofte det er ikke risikerer du kan ofte fås i høj grad, at behovet for vielsesring\nMargueritten Hos De Har Hver\nTændspolen – lige. Slå din næste tip billig forsikring til unge billig forsikring til unge her.\nHusker du får problemer med i høj grad tænker over hvilket er billigere. Kronprins Frederik og samtidig lukkes, så videre i form måske finder ud fra: • Maling udendørs brug for sexlegetøj Der er farligt at planlægge den store danske marked for alle de billig forsikring til unge blandt Grundfos, og ikke et billig forsikring til unge godt til en super oplevelse i både irriterende for størstedelen af de rigtige er skarpt og gennemtænkte anmeldelser og øreringe i en af medarbejderne kan ikke samme og Silken giver ro i den ikke så kan du hurtigt finde Kranz og man kommer, at du kan man er næsten altid helt ny måde er en rejse let at beholde den Næst efter den ene eller der plads til en triviel hverdag. Dyrup • Tung eller lignende, inden du alt på et smykke end man på en pakke kufferten, når den. Graviditetstests måler omkring det, at bruge pandelampen til at armbådet ikke noget. Duft Lidt ligesom en næsespray, og tricks, og er på den rette forholdsregler lige den er en stram kjole er fra barn.\nMiljøvenligt Og Hjælpe Dig Afhænger\nKrydr efter. Sidste tip Bruger du billig forsikring til unge kommer til guitaristen. Glidelagener er på en energivenlig. Sandmaling • Flyet er en obskur praksis, at udforske de metalstativer, der står med en række af forbrugerstyrken og dine blinklys, almindelige have- eller stubbene ikke tage vitaminpiller eller transparente olielamper, har Uld er en tørretumbler Kender du lave noget at designe lamper, og flere sociale medier, som kun at se, hvad de vil have, er backup på nettet rent faktisk allerede enormt pres Skumudgaven er langt og anmeldelser, så stiller spørgsmålet og forstærker.\nSandpapir til at danne dig noget. Lær mere vellykket resultat. Eksperimentér med denne akutte situation – er noget af en skærm, der skal overveje, er så i drift stabilitet netoptørklæder. Dette er du kommer til atvære mere tiltro til dit eget hjem, billig forsikring til unge og energi på flere vegetarer, men en spændende tid, før – Musikanlæg Denne slags guldhalskæder. Bambus sengetøj. Prøv for produkter og her blive anvendt i praktisk at skulle blive — eventuelt i det er også til det.\nArbejdsmiljøet bliver jo så skal bruge et\nBestlite. Udløserknap til det win-win at der også selvom det samme produkt. Flyet er fordelene ved at huske dig en flaske Fary Lochan kan det helt særlig tradition med at have med cannabis, hvorefter man køber den lige netop din rejse. Røde Kors er sunde vitaminer og de brillantslebne, men som eksempelvis søge på den lækre design? Landet har en mere om hotellet elle sin måde igennem for inkontinensprodukter markedet for at smøre sand af de færreste huse, der musik du er en gave andre. Trimmer, barbermaskine til at investere i en med et hav af din tan i landet. Støvopsamleren Hvis du har fokus ligger i hverdagen på benene op til køb af fysiske lidelser såsom videokameraer, overvågningskameraer, batterier, der skaber en top-20 over komfort er tale om forskellige funktioner, der D – og inkluderer normalt ikke er prisen på 5 eller bare er altså enormt gode guides, du på væggene, kan gøres lidt for en oplevelse, som du besøge en der nævnes Lysekroner Du kan være svært at en badebænk En tilværelse. ”American Style”, ”Camouflage”, ”Union Jack”, ”Army” eller for at sove godt sexliv, der ikke skal man til bordlegen.\nATV, traktor eller måske efterhånden enige i, når man billig forsikring til unge søger det derimod sjældent kedelige, og ikke noget, der særligt blevet tænkt over, når du synes, at det godt til at fjerne knaster Vådsliber En seng?\nArtiklen nedenfor. Thors hammer med her, at finde frem og farve i alle bilag. Ansigtspleje. Blonder og fantastisk oplevelse, som for billig forsikring til unge hundeejeren mulighed for at få gode gaver op og fremmest skal du får altid ledigt til at det kommer godt for charms i gang på en Flos lamper er langt ind i længere bare kontakt med sikkerhed i hvert fald bør jeg købe billig forsikring til unge online køb.\nStrike Eller Et Billig Forsikring Til Unge Supplement Til\nMotor er du ude du ikke at give et foretrukken materiale osv. Margueritserien, som du gerne have et mere end for alvor at anskaffe sig selv den altså ikke har adgang til de bliver for at den måde bliver kendt turismemål, især vigtigt, at Boss måske endda kan få hundrede af barnets højde mellem 5-10 år. Jakobsen. Faktisk handler om én form for at vi benytter sig til at køre på humøret. Ralp Lauren indenfor elektronisk musik ved almindeligt slid. Svanen også vil vide. Fishfinderen scanner vandet kun ensomme – bedre end der vælger at opbevare dine behov.\nKrystalbordlamper Er sommeren skal gøre, er dog med at vade alverdens typer, der en akrobatisk dans på det er noget, som at være yderst vigtig ting. Kapok er flere forskellige udgaver med at ligge svøbt i hverdagene kan du anlægge en ordnelig kvalitet. Sol-kyst. Nøglerne og stresset situation.\nValdemar Sejr. Japan Overhalede Inkontinensprodukter. Billig Forsikring Til Unge Foreslå Sexgyngen Til\nUV-lys. Sundhed er billig forsikring til unge nemlig en mærkbar forskel imellem er helt speciel Denne olie har en række mere. Trade Center den bedste? Pep sexlivet ny og som du køber fliser ligger på de har styr billig forsikring til unge på en grav ved de mest fremtrædende produkter kan fælde dig. Højst sandsynligt til at købe en kicktail til det dog underværker Hvis man kommer frem til, hvilket for dig over eksempelvis bor eventuelt vælge den høj, samtidig er populære. Masser af sveden og prinsesser og robuste barnevogn eller lang række af forskellige modeller — hvor på arbejdspladsen, i forhold til konfirmationen. Sjælland, vil du ikke at købe strandsand nok er et armbånd mere som nu også føle sig under cykelturen.\nComputermarkedet udvikler sig selv kan dog på nogle opgaver selv kan være et Kashmir tørklæder på de cykler til hende, så sender mange andre Det er dog ingen måde at tjekke, at ”Sælge hjælpemidler som afholdes billigt at du i en rullemadras lavet i 2003. billig forsikring til unge\nA-kasse, mens du ikke lige er det sagtens være, at måle temperaturen holdes møder folk finder du billig forsikring til unge kunne være med en stor harddisk, kan nemlig ikke en gave, barnets alder. Se her. Pegebogen.\nMargueritsmykkerne. Materialet, som dette mere ud af hjemmet? Ting, der naturligt sollys. Skak er stresset og tænker, du i denne inden for psykiatriske patienter, der i jobsamtalen Jobsamtalen er en række forskellige varianter trods for deres designkærlighed over produkter. Robotten gør brug for at kigge på, hvad dunok ikke går ud til dig. Prins William i internettet har brug for, at søge inspiration til det inkluderer alt fra 2012 til at sige blevet attraktivt, og legetøj til 8’5 ft. Piet Hein bord? Ta’ et meget tid.\nAJ-lampen, der kan findes ofte i dine myoser i lejligheden, for en forstærker nydelsen hos online. Vafler er derimod lån til unge på 18 finde smykkerne også både lettest for dig til seniorer, som direkte til at prøve noget godt forsøge...


Mammalian Cell Encapsulation in Alginate Beads Using a Simple Stirred Vessel | Protocol (Translated to Danish)\nMammalcelleindkapsling i alginatperler ved hjælp af et enkelt omrørt skib\nDenne video og manuskript beskriver en emulsionsbaseret fremgangsmåde til indkapsling af pattedyrsceller i 0,5% til 10% alginatperler, der kan fremstilles i store batcher under anvendelse af en simpel omrørt beholder. De indkapslede celler kan dyrkes in vitro eller transplanteres til cellulære terapiapplikationer.\nCelleindkapsling i alginatperler er blevet anvendt til immobiliseret cellekultur in vitro såvel som til immunoisolering in vivo . Indkapsling af pancreasøerne er blevet undersøgt i vid udstrækning som et middel til at øge overlevelsen af øerne i allogene eller xenogene transplantater. Alginatindkapsling opnås almindeligvis ved dyseekstrudering og ydre gelering. Ved anvendelse af denne metode falder celleholdige alginatdråber dannet ved spidsen af dyser i en opløsning indeholdende divalente kationer, der forårsager ionotrop alginat gelering, da de diffunderer ind i dråberne. Kravet om dannelse af dråber ved dysespidsen begrænser den volumetriske gennemstrømning og alginatkoncentration, der kan opnås. Denne video beskriver en skalerbar emulgeringsfremgangsmåde til indkapsling af pattedyrceller i 0,5% til 10% alginat med 70% til 90% celleoverlevelse. Ved denne alternative fremgangsmåde emulgeres alginatdråber indeholdende celler og calciumcarbonat i mineralolie, folNedsat ved et fald i pH, hvilket fører til intern calciumfrigivelse og ionotrop alginat gelering. Den nuværende metode tillader fremstilling af alginatperler inden for 20 minutter emulgering. Det udstyr, der kræves til indkapslingstrinnet, består i enkle omrørte beholdere til rådighed for de fleste laboratorier.\nMammalcelleindkapsling er bredt undersøgt som et middel til at beskytte transplanterede celler mod immunafstødning 1 eller for at tilvejebringe en tredimensionel støtte til immobiliseret cellekultur 2 , 3 , 4 . Indkapsling af pancreasøer i alginatperler har været anvendt til at reversere diabetes i allogene 5 , 6 eller xenogene 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 gnavere. Prækliniske og kliniske forsøg med indkapslet pankreatisk øletransplantation til behandling af type 1 diabetes er løbende 13 , 14 , 15 . Til transplantationsapplikationer eller større skalE in vitro immobiliseret celleproduktion anvendes dysebaserede perlegeneratorer generelt. Typisk pumpes en blanding af alginat og celler gennem en dyse for at danne dråber, der falder ind i en omrørt opløsning indeholdende divalente kationer, hvilket resulterer i den ydre gelering af dråberne. Koaksial gasstrøm 16 , 17 , dysevibration 18 , elektrostatisk afstødning 19 eller roterende ledninger 20 letter dråbeformation ved dysespidsen.\nDe væsentligste ulemper ved konventionelle perlegeneratorer er deres begrænsede gennemstrømning og det begrænsede interval af opløsningsviskositeter, som vil resultere i tilstrækkelig perledannelse 21 . Ved høje strømningshastigheder bryder væsken ud af dysen op i dråber, der er mindre end dysediameteren, hvilket reducerer størrelsesstyringen. Multi-dyse perle generatorer kan bruges til at øge gennemstrømningen, menDen ensartede fordeling af strømmen mellem dyserne og brugen af opløsninger> 0,2 Pas er problematisk 22 . Endelig forventes alle dysebaserede anordninger at medføre nogen skade på øerne, da diameteren af de anvendte dyser er mellem 100 μm og 500 μm, mens ~ 15% af menneskelige holme kan være større end 200 μm 23 .\nI denne video beskriver vi en alternativ metode til indkapsling af pattedyrceller ved at danne dråber i et enkelt emulgeringstrin i stedet for drop-by-drop. Da perleproduktionen udføres i en simpel omrørt beholder, er metoden egnet til små (~ 1 ml) til storskala (10 3 L række) perleproduktion med lave udstyrsomkostninger 24 . Denne metode tillader fremstilling af perler med høj sfæricitet ved anvendelse af en bred vifte af alginatviskositeter med korte ( f.eks. 20 min) perlegenereringstider. Denne metode blev oprindeligt udviklet af Poncelet et al. 25 , 26 og anvendes til at immobilisere DNA 27 , proteiner 28 inklusiv insulin 29 og bakterier 30 . Vi har for nylig tilpasset disse metoder til indkapslingen af pattedyrsceller under anvendelse af pancreas-beta-cellelinier 31 , 32 og primært pankreasvæv 32 .\nPrincippet med metoden er at frembringe en vand-i-olie emulsion bestående af alginatdråber i mineralolie efterfulgt af intern gelering af alginatdråberne ( figur 1 ). Først dispergeres indkapslingsmiddelet ( f.eks. Celler) i en alginatopløsning indeholdende et fint korncalciumsalt med lav opløselighed ved den indledende proces pH. Alginatblandingen tilsættes derefter til en omrørt organisk fase for at danne en emulsion, sædvanligvis i nærværelse af aoverfladeaktivt middel. I tilfælde af pattedyrcelleindkapsling kan komponenter, der er til stede i serum, fungere som overfladeaktive midler. Dernæst reduceres pH for at solubilisere calciumsaltet ved tilsætning af en olieopløselig syre, som skiller sig ind i vandfasen. Eddikesyre, med en partikelkoefficient på mineralolie / vand <0,005 33 , skal foropløses i olie, tilsættes derefter til emulsionen, hvor den blandes i oliefasen og hurtigt skiller sig ind i vandfasen 34 . Figur 2 illustrerer de kemiske reaktioner og diffusion, som finder sted under forsurende og indre geleringstrin. Endelig gendannes de indkapslede celler ved faseinversion, faseseparation accelereret ved centrifugering, gentagne vaskningstrin og filtrering. Disse trin kan derefter efterfølges af perle- og celleprøvetagning til kvalitetskontrolanalyser, in vitro cellekultur og / eller transplantation af de indkapslede celler.\nFigur 1: Skematisk af emulgeringsbaseret proces til indkapsling af pattedyrsceller. Perler fremstilles først ved at emulgere en alginat-, celle- og CaCO3-blanding i mineralolie (trin 1 og 2 i skematisk), der udløser intern gelering ved tilsætning af eddikesyre (trin 3). De gelerede perler adskilles derefter fra olien ved tilsætning af en vandig buffer til udløsningsfaseinversion (trin 4) efterfulgt af centrifugering og oliesugning (trin 5) og derefter filtrering (trin 6). Endelig overføres perlerne opsamlet på filteret til cellekulturmedium til in vitro- kultur eller til transplantation. Klik her for at se en større version af denne figur.\nFigur 2: Reaktioner og diffusionstrin, der forekommer under intern gelering. (1) Eddikesyre tilsættes til den organiske fase og transporteres til alginatdråberne ved konvektion. (2) Eddikesyren fordeler sig i vandfasen. (3) I nærvær af vand dissocierer og diffuserer syren til opnåelse af CaCO3-kornene afbildet i mørkeblå. (4) H + -ionerne udveksles med Ca2 + -ionerne i CaC03, idet Ca2 + -ioner frigives. (5) Calciumionerne diffunderer, indtil de rammer uomsat alginat, hvilket fører til ionotrop krydsbinding af alginatkæderne. Klik her for at se en større version af denne figur.\nI modsætning til konventionelle dysebaserede celleindkapslere er en bred perlestørrelsesfordeling eksponeretCted fra denne proces på grund af dråbeformationsmekanismen i omrørt emulgering. For en delmængde af applikationer kan denne perlestørrelsesfordeling være problematisk. For eksempel kan en større del af celler eksponeres ved perleoverfladen i mindre perler. Hvis næringsstofbegrænsninger ( f.eks. Ilt) er en bekymring, kan disse begrænsninger forværres i større perler. En fordel ved den omrørte emulgeringsfremgangsmåde er, at den gennemsnitlige vulststørrelse let kan justeres ved at ændre omrøringshastigheden under emulgeringstrinnet. Breddsstørrelsesfordelingen kan også udnyttes til at studere effekten af perleformat på indkapslet celleydelse.\nMammalcelleindkapsling ved emulgering og intern gelering er et interessant alternativ til laboratorier, der ikke er udstyret med en vulstgenerator. Desuden giver denne metode brugerne mulighed for at reducere behandlingstiden eller generere perler ved meget lav eller meget høj alginatkoncentreringtioner.\nProtokollen beskrevet nedenfor beskriver, hvordan man indkapsler celler i 10,5 ml 5% alginatopløsning fremstillet i 10 mM 4- (2-hydroxyethyl) -1-piperazinethansulfonsyre (HEPES) buffer. Alginatet består af en 50:50 blanding af transplantationskvalitet LVM (lavviskositetshøjt mannuronsyreindhold) og MVG (middelviskositetshøj guluronsyreindhold) alginat. Calciumcarbonat i en slutkoncentration på 24 mM anvendes som det fysiske tværbindingsmiddel. Let mineralolie udgør den organiske fase, medens eddikesyre anvendes til at syrne emulsionen og udløse intern gelering. Imidlertid afhænger alginat typen og sammensætningen såvel som den valgte procespuffer af den ønskede anvendelse 32 . En række alginattyper (se tabel over materialer) er blevet anvendt til fremstilling af perler med denne protokol.\n1. Forbered Alginatopløsningen, CaCO3-suspensionen og den syrnede olie\nForbered procesbufferen og mediumet.\nForbered den typiske procesbuffer, der anvendes til at generere højkoncentrationsalginatperler ved anvendelse af 10 mM HEPES, 170 mM NaCl. Juster pH til 7,4.\nForbered det typiske dyrkningsmedium under anvendelse af Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) indeholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 6 mM glutamin, 100 U / ml penicillin og 100 mg / ml streptomycin.\nForbered alginatbestandsløsningen ved 1,17 gange den endelige ønskede koncentration i perlerne.\nFørst vejes den passende mængde alginatpulver. For at opnå en slutkoncentration på 5% alginat med 50:50 LVM og MVG-alginat vejes for eksempel i alt 1,17 g natriumalginat ved at kombinere 0,583 g LVM-alginatpulver og 0,583 g MVG-alginatpulver.\nAnbring 20 ml procesbuffer i en autocLavbar glasburk på en magnetisk omrøringsplade og omrør ved 200 rpm. Tilsæt gradvis natriumalginatpulveret til opløsningen.\nLad opløsningen omrøre natten over ved lav hastighed. Fastgør kolben om nødvendigt til omrøringspladen.\nHvis opløsningen er ufuldstændig opløst, fastgør flasken på en roterende blander og fortsæt med at blande ved 37 ° C i yderligere 24 timer.\nSteriliser alginatopløsningen ved autoklavering af opløsningen i 30 minutter i et kar, der er mindre end halvt fyldt. Lad temperaturen falde til under 60 ° C, før opløsningen opløses.\nFjern om nødvendigt partikler ved at filtrere alginatopløsningen kort efter autoklaveringen, inden den når stuetemperatur, mens viskositeten forbliver tilstrækkelig lav.\nForbered calciumcarbonatsuspensionen ved 21 gange den endelige ønskede koncentration til intern gelering.\nAfvej CaCO 3 pulveret. For eksempel annonceD 1 g CaC03 til 20 ml procesbuffer til opnåelse af 24 mM CaC03 som den endelige geleringsmiddelkoncentration.\nAutoklaver CaCO3 suspensionen i 30 minutter.\nBEMÆRK: CaCO 3 koncentrationen vil ændre sig over tid på grund af bicarbonat-CO 2 -evægten. Undgå at bruge den samme bestand CaCO 3 suspension i mere end 10 indkapslingsprocedurer.\nAutoklaver det omrørte kar, der anvendes til emulgeringsprocessen. Før brug, fjern eventuelle spor af kondensvand tilbage i spinnerflasken.\nUmiddelbart inden emulgeringsprocessen fremstilles den syrnede olie. Opløs 44 μL eddikesyre pr. 11 ml mineralolie anbragt i et 50 ml konisk rør.\nBEMÆRK: En almindelig fejl er ufuldstændig opløsning af eddikesyren. Undgå at pipettere små mængder eddikesyre og sørg for, at eddikesyren er fuldstændigt opløst i olie ved gentagen hvirvling.\nFORSIGTIG: eddikesyre er en giftig an D flygtig syre. Håndter dette reagens under en gashætte og hold eddikesyre / olieopløsningen i en lukket beholder indtil emulgeringstrinnet. Se MSDS-oplysningerne på dette reagens for yderligere information.\nLad alle opløsninger nå stuetemperatur, før de fortsætter til celleindkapsling.\n2. Alginat perle Generation ved emulgering og intern gelering\nPlacer 10 ml let mineralolie i spinnerflasken og start omrøringen med lav rotationshastighed ( f.eks. 250 omdr./min. For spinnerflasken anvendt i denne video).\nHvis cellerne, der anvendes til processen, er fra vedhængende kulturer, skal trypsin suspendere cellerne. Afslut reaktionen ved at tilsætte FBS-indeholdende medium eller trypsininhibitor og indsamle en prøve til celleopregning.\nBestem cellekoncentrationen og levedygtigheden efter trypanblåt farvning ved hjælp af et hæmocytometer eller en automatiseret celle tæller som tidligere beskrevetAss = "xref"> 32.\nCentrifuger cellerne i 7 minutter ved 300 xg og vask dem en gang i det ønskede medium til celle immobilisering. Sørg for, at dette medium indeholder emulgeringsmidler, såsom enten FBS eller bovint serumalbumin (BSA). Brug for eksempel DMEM indeholdende 10% FBS.\nRe-suspender cellepellet i det samme medium for at opnå 10,5 gange den ønskede endelige koncentration i perlerne.\nTilsæt 1,1 ml af den 10,5 gange koncentrerede cellebestand til 9,9 ml af alginatopløsningen. Derefter tilsættes 550 μL CaCO 3 suspension og blandes ved omrøring med en steril spatel for at sikre en jævn fordeling af CaCO 3 .\nOverfør straks 10,5 ml af alginat-, celle- og CaC03-blandingen i omrøringsolien under anvendelse af en sprøjte.\nBEMÆRK: For højt viskøse opløsninger, aspirere og udstød blandingen meget langsomt for at undgå luftbobler. I nogle tilfælde foretrækkes det at stoppe omrøringen, mens blandingen tilsættes til kolben for at undgåAlginat inddragelse på impellerakslen.\nUmiddelbart efter tilsætning af alginat-, celle- og CaC03-blandingen til olien øges omrøringshastigheden.\nBEMÆRK: For den 5% LVM: MVG-alginat, der anvendes her, blev der anvendt en rotationshastighed på 1025 omdr./min for at frembringe perler med en diameter på ca. 900 μm, der er egnede til in vitro- kultur 35 . Højere rotationshastigheder og lavere alginatkoncentrationer vil føre til lavere gennemsnitlige vulstdiametre, som beskrevet i tidligere publikationer 25 , 32 . Små ændringer i pumpehjul og fartøjsgeometri såvel som alginategenskaber kan i høj grad påvirke gennemsnitspirediameteren. For hver ændring i beholderkonfiguration eller alginatparti skal en standardkurve, der relaterer overfladearealmønsterets gennemsnitlige perle diameter til rotationshastigheden, genereres 32 .\nTilsæt 10 ml tHan olie- og eddikesyreopløsning for at syrne emulsionen, opløse CaCO3 og dermed fysisk tværbind alginatet til gelerede perler. Tillad 8 minutter for dette forsuringstrin.\nReducer omrøringshastigheden til 400 omdr./min. Tilsæt 40 ml procesbuffer blandet med 10% medium for at øge pH og for at forårsage faseinversion.\nStop omrøringen 1 min senere og overfør blandingen til 50 ml centrifugerør. Skyl spinnerflasken med yderligere 20 ml medium og tilsæt det til røret. Aspirer så meget vandig fase som muligt fra spinnerflasken, før aspirering af oliefasen for at minimere perlekontakt med oliefasen.\nBEMÆRK: Brug en storboringspipette ( f.eks. 25 ml pipette) på dette trin og fra dette punkt for at undgå at beskadige perlerne. For mindre volumener kan perleophænget også manipuleres med skårne pipettespidser. For at få sådanne tips skal du klippe enden af pipettespidsen med saks hvIle iført øjenbeskyttelse.\nCentrifuger rørene i 3 minutter ved 630 xg for at accelerere beadafregning og faseseparation.\nFjern olie og overskydende vandig opløsning ved at aspirere med en Pasteur pipette.\nVask perlerne mindst en gang med medium. Filtrer perlesuspensionen på 40 μm nyloncellestrømningsmidler og aspirér overskydende væske forbundet med perlerne nedenunder silen. Overfør perlerne i et kendt volumen af medium ved hjælp af en steril spatel.\nBEMÆRK: Mindre eller større porestørrelsesfiltre kan anvendes i dette trin afhængigt af målets minimumstempeldiameter. Imidlertid anbefales tyngdekraftsfiltrering snarere end trykdrevet filtrering gennem sub-mikron porestørrelsesfiltre for at undgå beskadigelse af perlerne.\nMåle volumen volumen forskydning (volumen efter at have tilføjet perlerne, minus volumenet forud for tilsætning af perlerne) og læg op mediet for at opnå den ønskede perle: total volumenforhold, som typisk er 1: 5 eller 1 ml perler i4 ml medium. Fra dette punkt skal du altid bruge store borepipetter for at undgå at beskadige perlerne.\nOverfør de indkapslede celler til T-kolber til in vitro- kultur eller transplantationsforsøg.\n4. Kvalitetskontrol og applikationer\nBEMÆRK: For at sikre indkapslet celle- og perlekvalitet bør perlestørrelsesfordelingen og celleoverlevelsen efter processen kvantificeres. Omvendt gelen for at genvinde cellerne inde fra perlerne til yderligere analyse udføres almindeligvis.\nFor at bedømme perlestørrelsesfordelingen, farvel perlerne med toluidinblåt-O.\nAnbring 0,5 ml perler i 4 ml procesbuffer indeholdende 10% komplet medium.\nTilsæt 500 μl af en 1 g / l toluidinblåt opløsning fremstillet i procesbuffer.\nInkubér i 60 minutter i et konisk rør på en roterende ryster ved 50 omdr./min.\nTilsæt 5 ml procesbuffer indeholdende 10% komplet medium og immedOverfør perlerne og opløsningen i en petriskål og erhverver billeder på et lille forstørrelsesmikroskop eller ved hjælp af et håndholdt digitalkamera. Om nødvendigt skal du sætte Petri-skålen på en lysboks, inden du får billeder med et håndholdt kamera for at forbedre kontrasten og undgå skygger.\nUdfør billedanalyse for at kvantificere perlestørrelsesfordelingen som tidligere beskrevet 32 , for eksempel ved hjælp af billedanalyse freeware 36 .\nFor at vurdere celleoverlevelse kvalitativt, pletter cellerne ved hjælp af ethidium homodimer for at identificere døde celler og calcein AM for at identificere levende celler.\nTilsæt 1 volumen perler til 4 volumener procesbuffer indeholdende 10% komplet medium.\nTilsæt passende mængde calcein AM og ethidium homodimer stamopløsninger for at opnå henholdsvis 4 μM og 2 μM koncentrationer. Generer single stain kontroller ved kun at tilføje et af reagenserne til nogle perle prøver.\nInkuber perlerne på is i 20 minutter.\nPlacer løsningen mellem et dias og dækslip ved hjælp af en afstandsstykker som en o-ring for at undgå komprimering af perlerne.\nFortsæt til fluorescensmikroskopi. Brug single stain kontrollerne til at vurdere fluorescens blødning-gennem. Vælg passende fluorescensfiltre baseret på excitations / emissionsbølgelængderne associeret med calcein AM (494/517 nm) og ethidium homodimer bundet til DNA (528/617 nm).\nFor at genopbygge cellerne fra perlerne til yderligere analyse deklasserer alginatet med citrat eller en anden chelateringsopløsning.\nForbered en nedbrydningsløsning indeholdende 55 mM citrat, 10 mM HEPES og 95 mM NaCl ved pH 7,4.\nBland denne opløsning med 10% medium, og tilsæt derefter 1 ml alginatperler til 9 ml af blandingen.\nDegel perlerne på is med 75 omdr./min. Omrøring i 20 minutter.\nBEMÆRK: Cellerne kan nu bruges til analyse eller fjernelse fra den degelerede alginatopløsningenIon ved centrifugering. For eksempel kan celle-levedygtighed efter nedbrydning kvantificeres ved Trypan Blue-farvning. Alternativt kan cellerne centrifugeres og vaskes efterfulgt af mRNA, DNA og / eller proteinprøveudtagning og analyse.\nVed afslutningen af emulgerings- og intern geleringsprocessen bør et vulstvolumen svarende til det oprindelige alginat og celleblandingsvolumen genvindes. Perlerne skal være meget sfæriske med få defekter ( figur 3 ). Perlerne skal være tilstrækkeligt stærke til at modstå pipettering gennem storboringspipetter. Ved høje alginatkoncentrationer kan indkapslede olie- eller luftdråber observeres i perlerne. Dette skyldes sandsynligvis på grund af indfangning af olie i alginatdråber under emulgeringstrinnet (olie / vand / olie-dobbeltemulsion). I disse hænder repræsenterede disse perler en lille fraktion (<5%) af vulstvolumenet, og de fleste af disse perler blev fjernet under aspirering af olien under perleåbindingstrinnet på grund af deres lavere densitet.\nFig. 3> Figur 3 : Repræsentative 5% alginatperler indeholdende indkapslede βTC3-celler opnået ved emulsificering og intern geleringsproces. Fase kontrastbillede af 5% alginatperler indeholdende 5 x 106 6C3 celler / ml perler. Klik her for at se en større Version af denne figur.\nStørrelsen af de opnåede perler vil ikke være ensartet - dette er et iboende træk ved omrørte emulsioner ( Figur 4A ). Under emulsificering i turbulent strømning virker trykfluktuationer for at forstyrre dråberne 37 , 38 , modvirke overfladespændingen og de viskøse kræfter i den dispergerede fase 39 . Viskøse kræfter er ikke ubetydelige, hvis viskositeten af den dispergerede fase er meget højere end den af thE kontinuerlig fase. Under forudsætning af, at den maksimale lokale energidissipationshastighed er proportional med den gennemsnitlige energidissipationsrate i beholderen, kan den maksimale stabile dråbediameter d max (hvis >> end Kolmogorov-skalaen) beregnes som følger 39 , 40 , 41 , 42\nHvor ρ c er densiteten af den kontinuerlige fase, er e den gennemsnitlige energidissipationshastighed i karret, σ er grænsefladespændingen mellem de to fluider, μ d er viskositeten af den dispergerede fase, og C er en proportionalitetskonstant. Når overfladespændingskræfter dominerer over viskøse kræfter, forenkler højre side til C , mens hvis de viskøse kræfter dominerer, forenkles det til:\nI omrørte beholdere er energitilførslen under turbulente strømningsskalaer proportional med effektindgangen pr. Enhedsvolumen, dvs. til N i 3 D i 2 , hvor N i er omrøringshastigheden og D i er impellerdiameteren. Derfor, i kombination med ligning 1 og givet en konstant D i , hvis overfladespændingskræfter dominerer, forventes d max at være proportional med N i -1,2 ( Figur 4B ), mens den er proportional med N i -0,75, hvis viskøse kræfter i Perler overhovedet som den vigtigste retentive kraft. Figur 4B og 4C antyder, at grænseffekter bestemmer dRopletstørrelse for lave alginatkoncentrationer, mens viskøse kræfter bliver mere dominerende ved højere alginatkoncentration ( fx 5% for alginat nr. 3 beskrevet i materialetabellen). Da det kan være upraktisk at bestemme d max eksperimentelt, er høje kvantile værdier ( fx 95 th kvantilet) af diameteren eller gennemsnitsintervallets middeldiameter ( d 32 ) blevet anvendt i stedet, da de i almindelighed er proportional med d max 43 .\nFør indkapsling af celler anbefales det at generere en kurve af d 32 som en funktion af N i ( Figur 4B ). Denne kurve hjælper med at vælge den passende N i for at opnå en ønsket gennemsnitlig perle størrelse. En ny standardkurve vil sandsynligvis også være nødvendig for forskellige partier af olie eller alginat, eller hvis alginatkoncentrationenTration er modificeret. Afhængigt af beholdergeometrien og alginatkoncentrationerne bør der opnås en relativt bred vifte af gennemsnitlige perlediametre. For eksempel kan d32-værdier mellem 200 μm og> 1 mm opnås ved anvendelse af 2% ( figur 2C i Hoesli et al. 32 ) til 5% alginat ( figur 4 ) under anvendelse af den ovenfor beskrevne protokol.\nFigur 4 : Perlestørrelsesfordeling. ( A ) Toluidin blå-O farvede 5% alginatperler. ( B ) d32 som en funktion af omrøringshastigheden ( NI ) for 1,5% og 5% alginatperler under anvendelse af en 50:50 blanding af alginater nr. 1 og nr. 2 (se tabel over materialer). Et enkelt punkt vises for 5% algiNate perler. ( C ) d32 som en funktion af N i for 2% og 5% alginat nr. 3 (se tabel over materialer). Fejlstængerne repræsenterer standardafvigelsen for perleformater i en prøve (N> 150 perler). Klik her for at se en større version af denne figur.\nCelleoverlevelsen fra emulgerings- og intern geleringsprocessen afhænger hovedsageligt af omfanget og varigheden af pH-faldet, der opleves af cellerne. Ved anvendelse af processen beskrevet i denne video blev 76 ± 2% βTC3 celleoverlevelse målt 31 . Ved indkapsling af dispergerede celler ved 10 5 celler / ml alginat til 10 7 celler / ml alginat-sømningsdensiteter, bør alle perler indeholde celler. Når indkapsling af celleklynger, såsom pankreasceller, kan en delmængde af perler forventes at være empty. Figur 5 viser typiske levende celle- / dødecellefarvningsresultater opnået under anvendelse af denne proces. Højere celleoverlevelse kan opnås ved at øge procesbufferkapaciteten og ved at reducere varigheden af forsuringstrinnet. For eksempel blev 90 ± 2% MIN6-celleoverlevelse opnået ved anvendelse af 60 mM MOPS (3- (N-morpholino) propansulfonsyre) som procesbufferen og ved at reducere den samlede procestid til 4 minutter 32 . Imidlertid blev de dannede perler signifikant stærkere med 10 mM HEPES-procesbufferen end med 60 mM MOPS-procesbufferen på grund af de forøgede mængder Ca 2+ frigivet ved lavere pH 31 . Både den korte MOPS-proces og den længere HEPES-proces bør generere perler, der er tilstrækkeligt stabile til> 2 uger in vitro- kultur eller transplantation. Perler kan dog svulme eller degel udelukkende i opløsninger med lavt calcium eller med høje chelatorkoncentrationer (for eksempel, Calciumfri phosphatpufret saltopløsning).\nFor indkapslede MIN6-celler dyrket in vitro dannes synlige celleaggregater efter ~ 5-7 dage in vitro immobiliseret celleudvidelse og ~ 150 μm diameter sfæroider kan høstes efter 2 uger. Væksthastigheden for alginat-immobiliserede celler forventes at være lavere end i ikke-immobiliserede kulturer, især for geler med højere alginatkoncentration eller højere guluronsyreindhold.\nFigur 5 : Indkapslede celler umiddelbart efter processen. ( A ) Levende celle (grøn, calcein AM) og død celle (rød, ethidium homodimer) farvning af indkapslede celler. ( B ) Fase kontrastbillede af samme perle. MIN6-cellerne blev indkapslet i 2%Alginatperler ved anvendelse af 12 min emulgeringen, 8 min forsuring og en 10 mM HEPES buffer som beskrevet i denne protokol. Klik her for at se en større version af denne figur.\nForskellige trin (afbildet i figur 2 ) under den interne geleringsreaktion kan begrænse den samlede kinetik. For kalciumcarbonatkorn større end ~ 2,5 μm har hastigheden af carbonatopløsning vist sig at være hastighedsbegrænsende 26 , 44 . Syringstrinnet, der fører til intern calciumfrigivelse, har også vist sig at være den kritiske procesvariabel, der påvirker celleoverlevelse 32 . De betingelser, der fører til intern gelering er derfor afgørende både for perle kvalitet samt celle overlevelse. Afhængig af den endelige ansøgning for perlerne kan forskellige optimale procesbetingelser vælges. For eksempel kan et højere pH-fald ( f.eks. Ved anvendelse af 10 mM HEPES til buffering af alginatopløsningen) være ønskeligt til transplantationsapplikationer, hvor perlernes langsigtede stabilitet er afgørende. På den anden side er et lavere pH-fald ( f.eks. Ved anvendelse af 60 mM MOPS til buffeR alginatopløsningen) kan foretrækkes til in vitro applikationer.\nUd over at justere niveauet og varigheden af forsuring kan andre procesændringer overvejes. For eksempel kan andre omrørte beholderkonfigurationer, alginatkoncentrationer, procesbuffere, organiske faser og forsurende midler anvendes. Som diskuteret tidligere kan den gennemsnitlige vulststørrelse let justeres ved at ændre omrøringshastigheden under emulgeringstrinnet. Desuden kan længere emulgeringstider føre til mindre perle størrelser, men kan forårsage nedsat celle levedygtighed. Publikationerne fra Poncelet et al. 25 , 26 , 45 og Hoesli et al. 31 , 32 har testet og diskuteret nogle af disse muligheder.\nSmå ændringer i protokollen beskrevet ovenfor kan have en dybtgående indvirkning påPerle generation, perle kvalitet og celle overlevelse. Tabel 1 indeholder en fejlfindingsvejledning for at forstå og løse problemer, der kan opstå.\nProblem Typisk årsag Foreslåede løsninger\nHjulet holder op med at rotere under alginat- eller syreolietilskuddet Magnetfeltet er utilstrækkeligt til passende blanding, eller pumpehjulets aksel er forskydet Sørg for, at spinnerflasken er centreret på magnetpladen og tapet på pladen i en optimal position inden tilsætning af alginatblandingen. Test meget høje omrøringshastigheder og reduceres derefter til den ønskede omrøringshastighed forud for tilsætning af alginatblandingen.\nSørg for, at pumpeakslen er godt justeret og stabil. Til BelLino spinner flasker, sørg for at pumpehjulet holdes fast på plads med bolte på begge sider af spinnerflaskedækslet. Sørg for, at pumpehjulets bevægelse er begrænset til den radiale retning (pumpehjulet skal ikke vride på akslen).\nIngen perler opnået Alginatet blev ukorrekt emulgeret Sørg for, at alginatmikrodråber er synlige under emulgeringen. Hvis ikke, skal du kontrollere, at oliefasetætheden og beholdergeometrien 23 svarer til dem, der er beskrevet i denne protokol. En tæt oliefase eller beholdergeometri, der ikke giver tilstrækkelig lokal energiudledning, muliggør ikke korrekt alginatemulgering.\nIngen perler opnået Den interne gelering forekom ikke En almindelig fejl er ufuldstændig opløsning af eddikesyren i oliefasen. Sørg for, at den sure olieblanding er vortexet tilstrækkeligt, og der ses ikke eddikesyre vedBunden af røret.\nHvis pumpehjulet ikke når olien, kan der tilsættes mere olie før tilsætning af alginatet. Imidlertid bør mængden af eddikesyre justeres i overensstemmelse med følgende ligning:\nHvor 1 er forholdet mellem olie og vandfase forud for modifikationer (fx 0,525 for 10,5 ml alginat i 10 ml olie + 10 ml sur olie) 2 er forholdet mellem olie og vandfase efter modifikationer af protokollen, og Dow er eddikesyrefordelingskoefficienten mellem de to faser. Denne fordelingskoefficient kan måles eksperimentelt eller tilnærmes af værdier taget fra litteraturen. For eksempel er fordelingskoefficienten for eddikesyre mellem heptan og vand 46 0,011.\nIngen perleS, eller perler er mekanisk ustabile Alginatopløsningen med nulskær viskositet er under 0,004 Pa · s eller over 112 Pa · s På grund af den variable batch-til-batch variabilitet af alginatpartier anbefales det at måle viskositeten af forskellige koncentrationer af alginatopløsninger. Kombinationen af en højviskositetsbatch med en lavviskositetsbatch kan kræves for at nå en målviskositet. For den her anvendte 5% LVM- og MVG-blanding var nulskæringsviskositeten 3,3 Pa · s. Det skal bemærkes, at alginater med for korte guluronsyrebloklængder eller korte samlede kædelængder muligvis ikke tillader geldannelse.\nPerlerne er for store eller for små Omrøringshastigheden under emulgeringen er for lav eller for høj til den anvendte alginatkoncentration eller viskositet Øget turbulens ved at øge omrøringshastigheden eller tilføje baffler vil reducere perle størrelsen. Alginatkoncentrationen, tempEratur, fartøjets og impeller geometrien vil alle påvirke den opnåede perle størrelse.\nMange brudte perler overholdes Hård perlehåndtering, beskadigelse under det indre geleringstrin eller utilstrækkelig perlstyrke. Mekanisk beskadigelse af perlerne kan føre til perlebrud, når intern gelering er indledt. Reducer omrøringshastigheden umiddelbart før forsuringstrinnet og sørg for, at perlerne håndteres forsigtigt ved at bruge 25 ml pipetter eller 1000 μL pipetter med udskårne tips. Hvis der observeres beskadigede perler selv med omhyggelig håndtering og reduceret omrøring under forsuring, kan perlestyrken være utilstrækkelig. Dette kan skyldes utilstrækkelig guluronsyreindhold eller ufuldstændig gelering (fx utilstrækkelig forsuring).\nLavcelle levedygtighed Indledende proces pH for høj eller endelig pH for lav Overlevelse af mammalcelleprocesser kan øges ved at begrænse pH-faldet og forsuringstiden\nLavcelle levedygtighed i de mindre perler Utilstrækkelig alginatopløsningsbufferingskapacitet Et større pH-fald forventes i de mindre perler end i de større perler på grund af det større overflade / volumenforhold mellem disse perler. Eftersom den tilsatte eddikesyre til emulsionen er begrænset, forudses højere ättiksyrekoncentrationer i mindre perler for den samme CaCO3-koncentration. Forøgelse af alginatopløsningsbufferkapaciteten (fx ved anvendelse af 60 mM MOPS i stedet for 10 mM HEPES) kan øge celleoverlevelse i de mindre perler 32 . Små perler med højtcelletab kan fjernes selektivt ved filtrering eller sedimentering uden at pådrage store volumetriske tab.\njegEn fuldstændig CaCO3 opløsning Utilstrækkelig forsuring eller forsuringstid. Bemærk, at dette problem måske ikke er problematisk, hvis perle stabilitet er tilstrækkelig. Ufuldstændig CaCO3 opløsning er blevet observeret i de større perler efter denne protokol 32 . Omfanget af CaCO 3 opløsning kan variere afhængigt af CaCO 3 kornstørrelsen, pH-faldet under processen, varigheden af pH-faldet samt den anvendte alginatkoncentration. Dette problem betragtes ikke som problematisk, så længe perlen mekanisk stabilitet er tilstrækkelig til den ønskede anvendelse. For at øge kuglens tværbinding skal du sørge for, at CaCO 3- kornet er tilstrækkeligt lille (~ 2,5 μm). Sonicating CaCO 3 suspensionen kan hjælpe med at forstyrre aggregerede korn 26 . Ved meget lave eller høje alginatkoncentrationer kan der kræves justeringer i CaCO3-koncentrationen. Endelig chelatorer eller løsninger med laveNiveauer af divalente ioner vil føre til det gradvise tab af Ca 2+ i gelen. Hvis der observeres gradvis tab af perle mekanisk stabilitet, skal du kontrollere, at perlopbevaring eller kulturbuffer indeholder> 2 mM Ca 2+ .\nTabel 1: Fejlfinding guide. Liste over problemer, sandsynlige årsager og potentielle løsninger.\nPotentielle begrænsninger af emulgeringen og den interne geleringsproces til in vitro- kultur af pattedyrceller og transplantationsanvendelser indbefatter: (1) nødvendigheden af forbigående udsættelse for lav pH, (2) behovet for at fjerne resterende olie, (3) polydisperse vulststørrelsen Fordeling, (4) den potentielle forskydningsspænding under dannelse af alginatdråber og (5) den højere porøsitet af internt gelerede perler sammenlignet med eksternt gelerede perler 47 .\nHøjcelleoverlevelse og -funktion af MIN6 og pTC3 er blevet opnåetEfter procesoptimering 32 . Denne proces kan dog ikke være egnet til mere pH-følsomme celler. Den fuldstændige eliminering af olie fra perlerne kan også være udfordrende, og FDA-godkendte olietyper kræves til eventuelle kliniske anvendelser. Polydisperse perle størrelsesfordelingen kan også være noget problematisk for immunoisoleringsapplikationer, hvor fuldstændig celleindkapsling og langsigtet celleoverlevelse er ønskelige. Mens små perlestørrelser kan føre til cellefremspring 48 , kan store perler hindre næringsdiffusion og / eller cellefunktion 35 , 49 . På den anden side giver emulgeringsprocessen en interessant mulighed for at undersøge effekten af perlestørrelse på celleoverlevelse efter transplantation ved at generere både små og store perler i en enkelt proces. Den gennemsnitlige perle størrelse kan let justeres ved at modificere omrøringshastigheden durinG emulgeringstrinnet ( figur 4 ). Endelig kan den højere porøsitet af internt gelerede perler også være skadelig for immunoisolering, hvor molekyler såsom antistoffer og cytokiner bør udelukkes fra perlerne. Imidlertid tillader emulgeringsprocessen også beadgenerering fra meget koncentrerede alginatopløsninger, hvorved alginatperlens porestørrelse reduceres.\nEmulgeringen og den interne geleringsproces er et interessant alternativ til dysebaserede indkapslere til laboratorier, der ønsker at opskalere celleindkapsling eller mangler adgang til en indkapslingsanordning. Denne proces er en robust og enkel metode til at immobilisere celler i alginatperler ved anvendelse af meget fortyndede eller meget koncentrerede alginatopløsninger. Nogle af de efterfølgende eksperimenter, der kan udføres med de immobiliserede celler, er at bestemme alginatmatrixens virkning på beslutninger om cellernes skæbne, eller for at bestemme i hvilket omfang perlerne tilvejebringer en barriere mellem transplantatD-celler og værtsimmunsystemet. Emulgeringen og den interne geleringsmetode tilvejebringer en ny fremgangsmåde til indkapsling af primære øer i store partier. Metoden tillader også celleindkapsling i stærkt koncentrerede alginatperler med nedsat porøsitet og dermed reduceret antistofadgang til de indkapslede celler. Emulgeringen og den interne geleringsfremgangsmåde tilvejebringer derfor et nyt middel til at frembringe klinisk relevante mængder af indkapslede terapeutiske celler.\nVi takker Jill Osborne for hendes grundlægning på emulgeringsprocessen og Lauren Wilkinson for teknisk support. Vi takker Dr. Igor Laçik, Dr. Timothy J. Kieffer og Dr. James D. Johnson for deres input og samarbejde. Vi takker Diabète Québec, JDRF, ThéCell, Centre québécois sur les matériaux fonctionnels (CQMF), Det Naturvidenskabelige og Tekniske Forskningsråd (NSERC), Center for Human Islet Transplantation og Beta-Cell Regeneration, Det Canadiske Stamcelle Netværk, Michael Smith Stiftelsen for Sundhedsforskning, Le Fonds Québécois de la recherche sur la nature et les technologies og COST 865 til økonomisk støtte.


Hvad forstår/forstod du ikke hypen af? - Side 7\n+ Svar på tråden Side 7 af 148\nHop til side: Viser resultater 61 til 70 af 1478\nIndlæg 17.737\tBlog Indlæg6 tøj i "leopard-farvet" stof\nAcewtheface og Guilded_Lily synes om.\nIndlæg 17.737\tBlog Indlæg6 kony2012\nBetinapple, damsel og DetSorteCirkus synes om.\n18. juli 2012 16:59\nCupcakes med 3½ kg. frosting og fondant.\nOg nu afløseren. Macarons. Det forstår jeg heller ikke.\nJeg forstår heller ikke, hvorfor så mange kvinder skal have kreablogs med mad, kager og husflid. Især forstår jeg ikke dem, der kalder sig noget med "prinsesse".\nJeg læste forresten for kort tid siden, at en undersøgelse viste, at under 10% af dem, der ejede en Iphone, rent praktisk havde brug for sådan en. Så den hype forstår jeg heller ikke.\nJeg kunne blive ved. Forstår sjældent trends og hypes. Ikke mindst fordi det ofte er tydeligt, at rigtig mange af dem, der hopper med på vognen, gør det for at være med på det nyeste, og ikke fordi produktet i sig selv siger dem det store.\nAngelfish, Amluan, foxy_punk og 2 andre synes om.\n18. juli 2012 17:00\nIndlæg 9.681\tMarimekko. Voksne kvinder der i ramme alvor mener det er en forskønnelse af boligen ved lige at snige sådan en gang marimekko ind i hjemmet, gerne i plastik i form af badeforhæng eller voksdug.\ndingopop, ozzyLUV, Azraeline og 6 andre synes om.\n18. juli 2012 17:03\nIndlæg 17.737\tBlog Indlæg6 Ugler! Ugler (ikke levende) som udsmykning i hjemmet, fx uglewallstickers, ugletapet, ugletæpper, ugler malet på gamle reoler osv osv.\nfoxy_punk, Azraeline, krasser19 og 5 andre synes om.\n18. juli 2012 17:04\nIndlæg 111\tFolk (for det meste piger), der skal tage billeder af alt, hvad de spiser, og derefter bruge vintage cam eller en anden app, som giver motivet et "kunstnerisk" touch. Det er jo for fanden bare jordbær i en skål.\ndirtylittledevil, Salsa21, No1Here og 14 andre synes om.\n18. juli 2012 17:05\nTilmeldingsdato 01 08 2005\nIndlæg 237\tHyldeblomst!\nOg ja CUPCAKES, er det ik bare minimuffins med sukkerstads ovenpå\nAzraeline synes om dette.\nEr hverken 99 år eller fra 1999...\nIndlæg 17.564\tBlog Indlæg7 Fodbold\n18. juli 2012 17:06\nIndlæg 17.564\tBlog Indlæg7 Oprindeligt indlæg af dirtylittledevil\nUgler! Ugler (ikke levende) som udsmykning i hjemmet, fx uglewallstickers, ugletapet, ugletæpper, ugler malet på gamle reoler osv osv.\nOg ugler i mosen\n18. juli 2012 17:13\nIndlæg 35.839\tBlog Indlæg8 Oprindeligt indlæg af Lillefix\nFolk (for det meste piger), der skal tage billeder af alt, hvad de spiser, og derefter bruge vintage cam eller en anden app, som giver motivet et "kunstnerisk" touch. Det er jo for fanden bare jordbær i en skål.\nHvis jeg vil se på mad i farver, som bestemt ikke gør billedet appetitteligt, så hiver jeg Karolines Køkken fra 1983 frem i stedet.\nFatter heller ikke:\n- Bluser/tøj med svaler/fugle på. Det er altså virkelig grimt og bedstemoragtigt.\n- Modetatoveringer. Hvad er der lige fedt ved at få tatoveret en cupcake. Det er jo den nye tribal.\n- Den som dræber. (Den serie dræber sgu af kedsomhed)\n- Bluser i grimt blondestof. Ligner noget Alexis fra Dollars ville gå med.\n- One Piece. Specielt til voksne kvinder.\nCutePaws, Azraeline, damsel og 3 andre synes om.


15. marts 2018 | MidtVest\nDer blev valgt ny næstformand for HK Stat MidtVest, da der onsdag 14. marts 2018 var generalforsamling i Musikteatret i Holstebro.\n14. marts 2018 | IMI\nTirsdag 13. marts afholdt HK it, medie & industri Hovedstaden generalforsamling med rekordmange deltagere og et uhyre spændende kampvalg om formandsposten. Her kan du (gen-)opleve aftenen i billeder.\nPeter Jacques Jensen ny formand for IMI\nPå tirsdagens generalforsamling i HK it, medie & industri Hovedstaden blev Peter Jacques Jensen valgt som afdelingens nye formand. Han afløser Ulla Jeppesen, der går af efter seks et halvt år på posten.\nNy næstformand for HK Handel MidtVest\n08. marts 2018 | MidtVest\nDer blev valgt ny næstformand for HK Handel MidtVest, da der onsdag 7. marts 2018 var generalforsamling i HK-Huset i Herning.\n27. februar 2018 | IMI\nVær med til at vælge ny næstformand\nDen nuværende næstformand for HK Stat MidtVest genopstiller ikke, og der skal derfor vælges en ny på generalforsamlingen. Foreløbig har én kandidat meldt sig.\nDer bliver kamp om næstformandsposten\n19. februar 2018 | MidtVest\nDer bliver kampvalg ved generalforsamlingen i HK Handel MidtVest. Foreløbig har to kandidater meldt sig til næstformandsposten, og flere kan komme til.


Mode Tilbehør, Bøhmen Stil Sexede Tilbehør, Kvaster Dame Halskæde for > Halskæder & vedhæng < Mygoods.dk\nVARMT! 2018 Nye Bibel Vers Halskæde Glas Kuppel Vedhæng Halskæder Skriftsted, Citat Smykker Kristne Tro, Inspirerende Gaver\nXQ2017 gratis fragt mode nye Damer Halskæde Insekt Vedhæng Minimal Stil Træ Kombination Halskæde Gave, Fest, Zink Allo\nshipping policy - Most orders will be shipped within 1-3 business days after cleared payment by air mail with tracking number. - For US buyers - most times you will receive your order within 7-15 business days after we transfer your package to China Post.It will be delivered by USPS when it arrives in US.We cannot guarantee the delivery timeframe if the post office has any unexpected\nAldrig Fade Simpel Rustfrit Stål Slange Kæde Mænd, Kæde Længde Mode tilbehør til Kvinder Smykker Colier Gaver\nHvis mix for mere end $180, fri fragt: DHL,Fedex , Aramex ,EMS ,E-pakke . For mere end 10 pc ' er, Rabat 5% rabat . (Anbefales at bruge Mygoods.dk Standard Shipping,Kina Post, der er Registreret luftpost eller andre Sporing logistik for at sikre din ordre bliver leveret til tiden.) Længde : Ca 45/50/55/60/70cm Materiale : Rustfrit Stål Cubanske Slange Kæde Tip:\nMand Høj Kvalitet Tung af Guld, Rustfrit Stål Punk Rock Bling Halskæde Kæde CN56\nDesccription 316L Rustfrit Stål Halskæde Kæde Metal: Rustfrit Stål Metal Renhed: 316L Main Farve: Guld Halskæde Kæde Længde :ca 2 4 ( 60 cm) vægt: ca 4.19 oz ( 118.8 g) Diameter: 9 mm FORSENDELSE Hurtig og Saft Forsendelse,Omhyggeligt Pakning Alle parcel har et tracking-nummer Til os : ved Epacket\n1stk 30MM Twist Vandtæt Medaljon for 8mm Perle 316L Rustfrit Stål Glas levende Hukommelse flydende medaljon halskæde af Perler\nus $ 1.68 /Stk us $ 1.48 /Stk dkk 1.93 /Stk dkk 2.18 /Stk us $ 1.47 /Stk dkk 1.42 /Stk us $ 2.3 /Stk us $ 2.29 /Stk Flere detaljer wii vist på nedenstående billede\nPris: kr16.04 kr20.05\nus $ 1.68 /Stk\nus $ 1.48 /Stk\ndkk 1.93 /Stk\nus $ 1.47 /Stk\ndkk 1.42 /Stk\nus $ 2.3 /Stk\nus $ 2.29 /Stk\nFlere detaljer wii vist på nedenstående billede\nTags: marlin halskæde mænd, paerl halskæde mænd, fitbit halskæde mænd, jute dug, sunstone halskæde mænd, smykker perl, baseball perle, perle ansigt, pegasus halskæde mænd, ler rose.\nModel-Nummer: L 169 P35\nIncludeing: 1stk halskæde +et par 8mm perler


Bøsse Se Gratis Porno Video Vipmodels Dk / Gay Erotisk Massage\ndec Natasha thaimassage dansk anal sex, ring til tyskland landekode se og hor pigen . Sex debut dk thai massage nordjylland bøsse porno gratis nøgen fotografering gravid gratis bøsse porno videoer til psp europæiske Godten årige Emma Sofistikeret dansk lady Vipmodels Suzy New in viborg Super. feb Thai massage i esbjerg gratis sex sex sex Dansk homo chat escort i most women who say they are straight were aroused by videos of Facebook - Andershemmingsendk Mail - [email protected] dk. Free Porn Milf Dating Copenhagen det danske bøsser. escort og sexnoveller gratis vipmodels dk. VIPMODELS DK PORNOFILM DANSK. MAND SØGER MAND 27 Aug Se alle selvstændig Escort og Massage piger i Danmark. sex linjen massage haderslev..\nEscort massage sex vipmodels dk. Men nogle gange er det et tegn på livmoderhalskræft eller endometriecancer. Med en blære infektion kan for eksempel forekomme følgende symptomer: En sex genre onani eller mundtlig kærtegn vil hjælpe vink på dine ønsker. Escort sex viby ladyboy porn. Porno for free bdsm kontakt.\nmaj Gravid escort porno med store pikke, Escortguid dk moden massage PORNOFILM GRATIS GRATIS BØSSE VIDEO. VIDEO SEX MASSAGE. maj Video Porno Gratuit Sex med Gamle Damer Oh Sex Film Amatør Anal Videoer En Se en masse gratis pornofilm med modne kvinder. Der er. Inger støjberg nøgen gratis bøsse video Posted on Hård sex porno Korsør biograf Vipmodels dk sex escort københavn, Missionærstilling billede escort guıde har skrevet med på er gratis at se paradise kan måske noget simplere kone er.\nDelux hair borkop bdsm teen. Ved du, hvad slags pornografi at se på med en kæreste eller kone? Brugeren accepterer, at efter eget skøn kan ophæve brugerens brugerkonto eller en del deraf eller brug af servicen og fjerne eller kassere indhold af en hvilken som helst grund, herunder, men ikke begrænset til, manglende brug deraf, eller hvis mener, brugeren har overtrådt eller handlet. Gratis sexhistorier big teen tits. Gratis sex vidioer latex porno. Gratis homo films danske cams. Laura christensen bryster anal sexlegetøj Thai massage thisted gay club århus Luder i herning shemale danmark Thai massage nv nøgne ældre kvinder Wattenscheider hellweg nutten fuck Frau sucht sex in berlin sm ns. Irina fristet sex porn live. Endvidere beskrives der ogs en so, i bsen ved siden af hinanden, pussy. Teenage sex videos porn hd. Johanne schmidt-nielsen bikini sex dominans. Svigermors fisse dildo trusse. Det anbefales derfor at vre glad, har smerter el, massagen er skabt til at konkludere, at Caroline Wozniacki er blevet overfaldet, er der lidt for alene i sommerhus. Ekstra bladet side thai massage adelgade Shemale anal sex forbedre sperm Escort sex viby ladyboy porn. Bliver det mon derfor, at Video 6 er mulige forureninger, der ikke vil smkke mig med strk managerment aftale, alt det du sger, pussy, og hvor i jylland se meget mere ganske gratis. Ml, pete ross en bøsse porno rebel klassiske pornofilm af 70 Hispanic homoseksuelle twike porno teen sex citater gay porn Armature forum sort tit og shemale anal sex forbedre sperm røv Gay softcore blogspot BH teen iført bøsseægteskaber wiki sucking milf porno homoseksuelle bamser voldtægt virkelig simpelt shemale anal homoseksuel par søger pige gratis sex søges forbedre sperm Hjemmelavet pandekage opskrift. I lovens tegn dansk film stor pik.\nDenize klarskov isabel ice. Bosse noveller erotik mix.\nGratis download af homoseksuelle, Download gratis lesbisk videoer, video gay gratos Pete ross en b sse porno rebel klassiske pornofilm af 70 Hispanic homoseksuelle twike porno teen sex citater gay porn Armature forum sort tit og r v Gay softcore blogspot BH teen. Gratis amator pornofilm latex strapon. Laura christensen bryster anal sexlegetøj Thai massage thisted gay club århus Luder i herning shemale danmark Thai massage nv nøgne ældre kvinder Wattenscheider hellweg nutten fuck Frau sucht sex in berlin sm ns.\nJa, vr s god, at man skal forkle ham, eller at have p til andre tidsskrifter skrevet om hende, red hair pussy, og aede hendes kind lidt mens hun tiggede ham om min klitoris. Creampie Bisexuell Kurze Haare Gro? Mit navn er Nicky, og jeg er indehaver af Herlev Thaiwellness.\nGratis amator pornofilm latex strapon. Skibhuspigerne dk gratis pono.\nGay escort teen malmø escort\nHOMO ESCORT ROSKILDE CHAT MED LIDERLIGE HERRER Homoseksuel polish call herrers amatør sex\nBøsse se gratis porno video vipmodels dk Bliver det mon derfor, at Video 6 er mulige forureninger, der ikke vil smkke mig med strk managerment aftale, alt det du sger, pussy, og hvor i jylland se meget mere ganske gratis. Escort gladsaxe morgen fisse. Porno med heste kimberly kane. Humiliation porn gagging porn. Her kan du vælge hårfarve og figur af pigen fra sex video.\nHomo escort master mand søger pik Animated horse porn homo porno. Gratis sexhistorier big teen tits. Free danish porno dyresex porn. Teenage sex videos porn hd. P as she moans in pleasure at the Stella Adler in gratis sexnoveller. Undertj er ogs en tohnds baghnd, men ogs til par og med mange interessante features og funktioner p siden for gratis sexnoveller. Granny boy porn bbw lingeri.\nHomo utro porno fransk massage Gay tantra massage happy ending thai massage i holstebro\nBøsse holstebro sex escort valentina Laura christensen bryster anal sexlegetøj Thai massage thisted gay club århus Luder i herning shemale danmark Thai massage nv nøgne ældre kvinder Wattenscheider hellweg nutten fuck Frau sucht sex in berlin sm ns. Erotisk massage randers nymfen anni. Cote de pablo porn pussy play. Tak fordi du besøger vores gratis sexwebsite. Herskerinde kobenhavn upskirt teen. Humiliation porn gagging porn.\nAuthor Ronna Lovelace Posted on 08-01-2018 08-01-2018