Offerte Archivi - Pagina 15 di 16 - WeAreBlog.it\nHome Miscellanea Offerte Pagina 15\nLe Migliori Offerte Telefonia Mobile Dicembre 2017\nSe stai cercando la tua tariffa mobile vantaggiosa e approfittare del mese di Dicembre pieno di sconti e promozioni, allora sei sul sito giusto....\nNon si fa altro che parlare di Black Friday e delle promozioni che si possono avere ad un prezzo fortemente scontato. In un recente...\nGrandi sconti per il Black Friday 2017 Amazon\nVenerdì 24 novembre è una data importantissima per gli amanti dello shopping: è l'attesissimo Black Friday. Si tratta di una giornata dedicata agli sconti sulla...\nCon 3Fiber ADSL e FIBRA 1000, la Tre offre in un'unica soluzione connettività su rete mobile e fissa. Dunque se stai cercando una buona offerta per quanto riguarda la...\nEcco tutti gli sconti di oggi su GearBest\nSe stai cercando un prodotto e vuoi risparmiare, beh sei sul sito giusto. Gli e-commerce devono il loro successo, perché il più delle volte...


Malesia visita al santuario per elefanti Kuala Gandah.\nPosted on 28 Aprile 2018 by Benedetta Rossi\nMalesia alla scoperta dell’elefante asiatico.\nMalesia. Anche se la destinazione di un viaggio è la stessa di altri 1000 viaggiatori, nessuno vivrà le stesse emozioni e visiterà i medesimi luoghi. La cosa più bella che si possa fare è informarsi su cosa si può vedere e personalizzare la meta in base ai propri interessi ed alle proprie passioni.\nQuesto è quello che ho cercato di fare le settimane precedenti la partenza per la Malesia. Volevo immergermi nella natura, vivere i luoghi e provare esperienze che si possono fare solo qui e che rendono questa nazione davvero unica. Inoltre volevo permettere a voi che mi seguite di vivere una Malesia vera fatta di avventure e tantissime emozioni!\nFont image: elephantcentremalaysia\nLa situazione degli elefanti in Malesia.\nIn questa puntata del blog, voglio accompagnarvi a conoscere l’elefante asiatico e la sua situazione in Malesia. Per farlo devo partire da un numero 1.200. Questi sono gli esemplari dell’elefante asiatico presenti in Malesia in libertà. Solo 1.200. Un numero che dovrebbe davvero mettere in allarme.\nL’elefante asiatico a differenza di quello africano ha delle zanne piccolissime che spesso nelle femmine sono appena accennate o assenti, la pelle della proboscide è più liscia e all’estremità è fornita di una sola appendice anziché due. Inoltre la mandibola dell’elefante asiatico all’estremità ha una sorta di labbro pendulo e appuntito che manca negli elefanti africani.\nVive in branchi e quando è libero passa la maggior parte della sua giornata alla ricerca di cibo; erba, germogli, frutta e cortecce. E’ un grande amante dell’acqua e ama spruzzarsela addosso con la proboscide e fare lunghi bagni rinfrescanti. Ha un’indole più pacifica rispetto ai cugini africani. Per questo motivo in passato è stato addomesticato ed utilizzato come animale da lavoro, soprattutto per il trasporto di tronchi. Sempre per questa ragione PURTROPPO è utilizzato nei circhi…\nIl santuario di Kuala Gandah.\nVi racconto queste cose perché sono molto importanti per poter capire il ruolo svolto dal santuario di Kuala Gandah nella vita di questi giganti. Il santuario ha sede a Kuala Gandah ed ospita una trentina di elefanti di differenti stazze ed età. Quello che li accomuna è la triste storia che hanno alle spalle.\nSono tutti elefanti che con le loro sole forze non sarebbero in grado di sopravvivere. Provengono da situazioni di maltrattamento ed ognuno a un passato da raccontare. C’è la dodicenne Selendang a cui manca un piede, perso quando è rimasta intrappolata in un agguato dei bracconieri. Sanum sopravvissuto all’attacco di una tigre, l’anzianissimo Lokimala di 79 anni (un’eccezione perché di solito gli elefanti vivono fino a 60 anni circa in libertà).\nCosa aspettarsi dalla visita al santuario.\nIl santuario è una struttura molto grande composta da alcuni spazi chiusi ed ampie zone all’aperto. Nelle sale vengono proiettati dei filmati che raccontano cosa viene fatto in Malesia per salvaguardare e proteggere gli elefanti. Negli spazi all’aperto gli elefanti sono suddivisi in gruppi, alcuni si possono osservare a distanza. Altri sono in spazi raccolti e all’ombra in cui i visitatori possono dargli da mangiare. Altri ancora sono in zone il cui accesso è consentito solo agli operatori.\nOgni elefante ha un operatore di rifermento, la persona con cui sviluppa un rapporto di fiducia e che lo guida nel suo percorso e nelle attività svolte al santuario. Sostanzialmente gli animali sono liberi all’interno di recinti per la maggior parte della giornata. In tarda mattinata, tutti i giorni, escluso il venerdì che avviene alle 14:30, c’è il momento del bagno.\nGli elefanti vengono accompagnati al fiume e ciascun operatore lava il suo elefante e lo lascia libero di giocare con l’acqua. Ricordate che all’inizio vi ho raccontato quali sono le attività che un elefante in libertà svolge durante la giornata? L’ho fatto per farvi capire che al santuario cercano di rispettare le loro esigenze permettendogli di fare le stesse cose anche se non sono liberi.\nIl momento del bagno.\nIl momento più magico ed emozionante della visita è senza dubbio quello in cui questi giganti fanno il bagno. Si lasciano andare e si rotolano nell’acqua come farebbe un cagnolino di 5/6 chili!!! Guardarli e sentire i versi di piacere che fanno mentre si spruzzano e giocano è davvero un ricordo splendido.\nDopo che hanno fatto il bagno con il loro “educatore” i turisti possono scendere in acqua pochi alla volta e lavare l’elefante a loro volta. Cosa posso dirvi di questa esperienza? Toccante, emozionante e malinconica. Io ho provato un velo di tristezza perché a causa del passato questi elefanti sono segnati per sempre. Penso razionalmente che adesso nessuno gli farà del male, ma anche che un loro reinserimento in natura è impossibile…\nFont image: nre.gov.my\nL’accesso al santuario è gratuito, viene richiesta una donazione (importo libero). Se si vuole fare il bagno con gli elefanti, bisogna pagare 50 RM, circa 13 euro. Consiglio un cambio completo perché ci si bagna! Al centro ci sono dei bagni comuni con docce all’aperto molto spartane ma perfette per lavarsi e cambiarsi dopo essersi bagnati al fiume.\nIl santuario riceve alcuni finanziamenti dal governo malese ma la maggior parte delle entrate avviene grazie alle donazioni dei turisti che lo visitano. Considerate che ogni elefante mangia 140 kg (sottolineo chili) di cibo al giorno. Quindi fate voi i conti di quanto costa mantenere una struttura di questo tipo.\nSe volete approfondire le informazioni che vi ho dato, vi invito a visitare la pagina del centro National Elephant Conservation Centre.\nQualora decidiate di programmare un viaggio in questa zona, vi suggerisco di contattare l’Ente del turismo Malese in Italia e l’agenzia di viaggi My Flower con sede a Kuala Lumpur per definire l’itinerario di viaggio perfetto per le vostre esigenze.\nelefanti kuala gandah malesia malesia elefanti santuario elefanti


Padre Monti in lutto: è scomparso fratel Paolo Ruatti | ilSaronno\nHome Cronaca Padre Monti in lutto: è scomparso fratel Paolo Ruatti\nPadre Monti in lutto: è scomparso fratel Paolo Ruatti\nSARONNO – “Oggi, 31 maggio, abbiamo ricevuto la notizia che fratel Paolo Ruatti ci ha lasciati!” A comunicare la scomparsa di fratel Paolo, 77 anni, i responsabili del poliambulatorio Padre Monti di Saronno.\nLo ricordiamo perché è stato il primo direttore sanitario del poliambulatorio e centro di fisioterapia di Saronno, ove dal 1992 per 5 anni ha partecipato attivamente alla nascita e sviluppo dello stesso poliambulatorio portando il suo grande contributo sia come fratello religioso che come uomo di scienza. Lo ricordiamo per l’incarico di primario all’ospedale Villa Paola di Capranica e poi rettore magnifico dell’Università cattolica “Nostra Signora del Buon Consiglio” di Tirana.\nLo ricordiamo come dermatologo sempre in ogni giorno della sua vita dedicata allo studio e alla pratica d’eccellenza. Lo ricordiamo per l’attenzione a ciascuna persona: paziente, collega, fratello che fosse; con una attitudine particolarmente innata a formare sia i colleghi che il personale che ha incontrato lungo il suo percorso di vita personale e professionale.\nfratel paolo ruatti\nArticolo precedenteBlue whale, convegno a Milano con il saronnese Raffaele Cattaneo\nArticolo successivo2 giugno cancellato, Gilli: “Il sindaco si dimetta”


Ciao a tutti sono alle prese con la mia prima compilazione di un timing per rj-top scusa luca, ma sti giorni sono esaurito per via del troppo lavoro cmq\nistallato ise (sto c...o 6 gb) ora creo nuovo progetto e dovrei inserire il main rilasciato da dr?\nDevi creare un nuovo progetto, configurare correttamente le opzioni che ti verranno proposte, importare sorgente(VHD)/constraint(UCF) e premere Play.\nIl .jed generato poi lo passi con Impact per creare SVF/XSVF.\nRagazzi mi da solo HDL SCHEMATIC EDIF NGC/NGO\nHDL e prosegui (scegli un nome per il progetto e il percorso).\nSe hai Windows 10 devi fare il workaround di cui ti parlavo cmq, altrimenti non credo riuscirai ad usare ISE.\nFino a device ci sono.\nPoi terra bruciata\nIl package è VQ44 per quanto riguarda i CoolRunner vecchi (fino al CR3 Lite), oppure i Matrix o quei chip lì insomma, in quanto montano un TQFP (Thin Quad Flat Package) a 44 pin. La speed grade è -7, come indicato nella serigrafia del chip stesso.\nTutto il resto va anche bene, magari cambia la Preferred Language in VHDL, visto che il codice è scritto con quel linguaggio (VHSIC [Very High Speed Integrated Circuit] Hardware Description Language).\nFatto tutto dopodichè devo andare su add sources?\nPerchè quando provo a selezionarla mi chiudo il programma.\nEdit tramite trick riesco ad andare avanti ora ho inserito main.ucf\nArrivato a questo punto.\nOra devo premere su play?\nUltima modifica di pe851009; 24-12-2015 alle 12:12\nRisolvi il problema di compatibilità. Basta una ricerca per trovare quali sono i file da cambiare.\nSono riuscito premuto play è mi ha generato timing.\nPossibile che me l'abbia generato in jed?\nScusate,ma non sono molto ferrato e mi sto impegnando per capire quello che faccio.


Ospedaletti, una folla commossa per l'addio a Luca Cardone: il centauro 27enne che ha perso la vita a Taggia - Riviera24\nOspedaletti, una folla commossa per l’addio a Luca Cardone: il centauro 27enne che ha perso la vita a Taggia foto\nUn corteo di moto rombanti: così gli amici hanno salutato il giovane meccanico\ndi Alice Spagnolo - 30 Settembre 2017 - 15:54\nOspedaletti. Una folla commossa ha dato l’ultimo saluto a Luca Cardone, il meccanico di 27 anni che ha perso la vita mercoledì scorso a Taggia, quando in sella alla sua moto si è schiantato contro una Ford Ka, condotta da un 31enne, anch’egli di Ospedaletti e ora indagato di omicidio stradale: un atto dovuto per consentire alla polizia stradale di proseguire le indagini sull’incidente.\nIl violentissimo scontro, avvenuto verso le 14.45 in via Beglini, nei pressi del distributore di benzina ERG, non ha lasciato scampo al giovane centauro che dopo aver colpito la vettura nella zona anteriore destra è poi carambolata contro il muro alla sua sinistra: inutili i seppur tempestivi soccorsi del personale sanitario, che hanno fatto di tutto per salvargli la vita, invano.\nLa passione per i motori Luca l’aveva sempre avuta, ancora prima di acquistare quella moto di grossa cilindrata sulla quale ha perso la vita. Lui, che aveva fatto le scuole elementari e medie ad Ospedaletti, in città lo conoscevano e gli volevano bene tutti. Lo dimostra il numero di persone, soprattutto giovani, che si sono recate nella chiesa di Nostro Signore Gesù Cristo Risorto in Emmaus in piazza Europa. Quando gli amici di Luca, che hanno voluto salutarlo con un corteo in moto partito dal Piccadilly, hanno preso posto in chiesa, i banchi e le sedie dell’edificio si sono riempiti presto, lasciando molte persone in piedi, sul sagrato.\nUna famiglia conosciuta, quella di Luca Cardone, figlio del bidello delle scuole pubbliche di Ospedaletti. Un destino legato ai motori, il suo. Dalla passione per le moto a quella per le auto, come la Grande Punto che guidava per le strade della provincia, accompagnando i suoi viaggi da casa al lavoro, presso il centro assistenza Porsche, con il rumore di un rombante motore: musica per le orecchie degli appassionati.\nCon questo stesso suono lo hanno salutato gli amici, che si sono stretti attorno alla famiglia del giovane, per accompagnare Luca nel suo ultimo viaggio.\nil dramma Taggia, è il 27enne Luca Cardone il motociclista morto nel tragico incidente di via Beglini\natto dovuto Taggia, tragico frontale tra moto e macchina: l’automobilista indagato per omicidio stradale


Tecnologia: l’alleato del Fashion & Retail | Deda Group\nLa tecnologia e il digitale hanno saputo trasformare in opportunità di successo le soluzioni messe in campo dagli attori del Fashion & Luxury per rispondere all’emergenza sanitaria. Questo quanto emerge su Pambianco Magazine nell’intervista a Mimmo Solida, CEO di Dedagroup Stealth, che sottolinea come il mercato abbia saputo mettersi in discussione, rivedendo i processi, aumentando l’efficienza e aprendosi a nuovi modelli di business.\nUn cambiamento determinato anche dalle nuove esigenze dei consumatori, che hanno impresso una forte accelerazione alla domanda digitale e focalizzato l’attenzione sul tema della sostenibilità. Ecco, quindi, che risulta evidente il ruolo della tecnologia come elemento in grado di accompagnare ed abilitare questa trasformazione.\n“Nel 2020 abbiamo assistito a uno stravolgimento del settore fashion che si pensava intoccabile. Fino a prima della pandemia la moda era fatta di ‘esperienze fisiche’ e ‘interazioni’ tra le persone. Ora ci siamo impensabilmente adattati a nuove regole mettendo in campo soluzioni alternative che solo il digitale ha saputo trasformare in opportunità di successo”, afferma Mimmo Solida, evidenziando come, anche in un periodo così complesso, Dedagroup Stealth abbia proseguito nella sua strategia di sviluppo e crescita. “Abbiamo sfruttato il momento per investire risorse finanziarie e umane nello sviluppo di nuovi moduli – Stealth Sustainability Solution e Order Management System – con l’obiettivo di rispondere con efficacia alle più complesse esigenze del comparto, anticipando, guidando modelli e best practice e contribuendo a definire il tanto atteso New Normal. Abbiamo, inoltre, ulteriormente accelerato nella vendita del software in modalità SaaS, modello di fruizione destinato ad avere un progressivo incremento, e abbiamo ampliato il nostro bacino di riferimento integrando la nostra offerta con una soluzione pensata per il dinamico e molto ampio mondo dei designer indipendenti e delle start up grazie all’acquisizione della società inglese Zedonk che ha dato il via al nostro percorso di internazionalizzazione”.


Pubblicazione sintesi Consiglio Direttivo del 25 marzo 2011 – FISPS Friuli Venezia Giulia\nPubblicazione sintesi Consiglio Direttivo del 25 marzo 2011\ndom, 17 Apr 2011 FISPS-fvg :: Notizie, NewsF.I.S.P.S. - F.V.G. Ufficio Stampa F.S.\nIl Consiglio Direttivo in carica ha deciso di voler pubblicare, nell’area riservata del proprio sito web (Download/Area Utenti registrati), una sintesi degli argomenti che si affrontano durante le riunioni periodiche.\nQuesta idea nasce con lo scopo di avvicinare maggiormente tutti i volontari alla Ns. Associazione e nel contempo fornire utili elementi per comprendere tutte le attività che i consiglieri analizzano e discutono per gestire il gruppo Fisps. Inoltre permette, ad ogni membro che partecipa attivamente alle varie attività durante la stagione invernale e non solo, di poter esprimere una propria opinione sui vari temi che vengono affrontati.\nCrediamo sia un modo per coinvolgere attivamente tutte le persone interessate al futuro di questo importante gruppo e permettere ad ognuno di sentirsi parte integrante.\nIl Consiglio Direttivo deve rimanere espressione della volontà di tutti gli Associati e muoversi per perseguire gli scopi di utilità sociale definiti a livello di Statuto.\n← Oggi “Il Gazzettino” parla di noi!\tCon le Giubbe Rosse a Sella Nevea →


Un recente studio scientifico su larga scala, pubblicato su "Hypertension: Journal of American Heart Association", conferma che le persone con una alimentazione ricca di omega-3 tendono ad avere la pressione del sangue più bassa.\nStudi precedenti avevano già indicato che l'assunzione di integratori di omega-3 poteva abbassare la pressione nelle persone affette da ipertensione. Questo nuovo studio ha invece verificato gli effetti degli omega-3 anche su persone con pressione normale, analizzando l'impatto degli omega-3 su 4.680 uomini e donne negli Stati Uniti, Regno Unito, Giappone e Cina.\n"Gli omega-3 hanno avuto un effetto maggiore su coloro che non stavano già assumendo farmaci e non avevano ancora sviluppato la pressione alta", ha detto Hirotsugu Ueshima, MD, autore principale dello studio e professore e presidente del Dipartimento della Salute Scienza presso l'Università di Shiga della scienza medica in Otsu, Shiga, Giappone.\nIl "Journal of American Heart Association" ricorda che, secondo studi precedenti, una diminuzione di soli 2 mmHg della pressione arteriosa riduce il tasso medio di morte da ictus di circa il 6 per cento e da malattie coronariche del 4 per cento.\nFonte: American Heart Association 6/2010


Addetto Selezione Personale - Legnago | Manpower\nLa filiale Manpower di Legnago, ricerca per lo staff interno uno/una ADDETTO/A RICERCA E SELEZIONE DEL PERSONALE.\nLa risorsa si occuperà della pubblicazione di offerte di lavoro, ricerca e selezione del personale, screening cv e gestione colloqui individuali ,delle pratiche di archiviazione digitale, dell'attività di amministrazione del personale: inserimento presenze mensili dei lavoratori in somministrazione, preparazione dei contratti e predisposizione della documentazione necessaria per le assunzioni, gestione amministrativa del personale della gestione e relazione con i clienti.\nll/la candidato/a ideale possiede Laurea triennale o magistrale in ambito umanistico/economico oppure master universitario in materie affini, interesse in ambito Risorse Umane, forte orientamento al lavoro per obiettivi. Completano il profilo flessibilità, precisione, puntualità, pazienza, propensione al lavoto in team, in un contesto dinamico e in continuo sviluppo mostrando ottime doti organizzative, di problem solving e relazionali. Ottima conoscenza del pacchetto Office, dei principali strumenti informatici e dei social network.\nPer candidature si prega di inviare CV all'indirizzo mail . Sede di Lavoro: Legnago (VR).\nCodice annuncio: 500283169\nVisualizzazioni annuncio: 4264\nImpiegato/a ufficio personale Il/la candidato/a ideale è in possesso di Laurea in materie giuridico-economiche ed ha già maturato anche brevi esperienze nel ruolo. La risorsa si occuperà della gestione amministrativa dei dip...\nManpower filiale di Brescia ricerca per ampliamento del proprio organico un/a ADDETTO/A SELEZIONE DEL PERSONALE. Il/la candidato/a, a seguito di un opportuno periodo di affiancamento, supporterà l'interno processo di selezione e amministra...\nRECRUITER AMBITO IT\nPer importante azienda cliente siamo alla ricerca di un/a RECRUITER AMBITO IT. La risorsa individuata, inserita all'interno dell'ufficio HR, si occuperà in autonomia dell'intero processo di selezione: - definizione della job descripti...\nAzienda ManpowerGroup è il partner strategico di Aziende e Persone nelle innovative worksforce solutions, con l'obiettivo di offrire una proposta di valore atta a garantire soluzioni efficaci per ogni esigenza. La nostra missione: aiutare...\nADDETTO UFFICIO DEL PERSONALE (STAGE)\nIl nostro Cliente: Azienda operante nel settore chimico Ci ha incaricati di ricercare un/una: 1 ADDETTO/A UFFICIO DEL PERSONALE (STAGE) La sede: Cintura Nord di Torino Lavoro: la risorsa è una persona dinamica, motivata e dispo...\nPer ns staff interno ricerchiamo un/una Addetto/a alla selezione del personale Il lavoro: La risorsa scelta, si occuperà di ricerca & selezione del personale. Attività: - pubblicazioni annunci - screening curricula ed ...\nManpowerGroup è il partner strategico di Aziende e Persone nelle innovative worksforce solutions, con l obiettivo di offrire una proposta di valore atta a garantire soluzioni efficaci per ogni esigenza. La nostra missione: aiutare a svilupp...\nPer importante e strutturata realtà dell'Alto Garda selezioniamo un un/a Recruiter. La risorsa si inserirà in un'azienda multinazionale entrando a far parte di un gruppo di lavoro strutturato affiancando i colleghi senior si occu...\nVorresti lavorare nel mondo HR Per azienda leader nel settore metalmeccanico, si ricerca urgentemente un/a impiegato/a HR. La risorsa si occuperà di: Reclutamento, selezione e gestione amministrativa del personale Induction e onboarding del...


Firenze Spettacolo|Nextech Festival\nElettronica da ballare e da ascoltare, insieme a star come Amelie Lens, Booka Shade e Demdike Stare. Confermata la formula “allargata”: al main-event alla Fortezza Da Basso si aggiungono serate alla Compagnia e al Club 21. Ultimi scampoli di estate e pubblico da ogni dove.\nGiovedì 20 Demdike Stare - Altra coppia consolidata della consolle, stavolta dal fronte Manchester. Elettronica ricca di contaminazioni dub, tonalità cupe ed esoteriche (ore 22, La Compagnia).\nVenerdì 21 Booka Shade - Minimal house e deep house. Sentieri che il duo tedesco percorre da due lustri abbondanti. I Depeche Mode li hanno voluti come supporter, i grandi festival se li contendono (ore 22, Club 21).\nSabato 22 Amelie Lens - Per la critica “il futuro della techno”. Belga, ex modella - l’etichetta non depone a suo favore, ma non fatevi ingannare - si è fatta le ossa nei club underground: bassi palpitanti, uptempo e accostamenti arditi. Apre la gloria locale Joy Kitikonti (ore 22, Fortezza da Basso).\nNel Carnet Tagliandi due biglietti al prezzo di 1 riservati ai nostri lettori\nLa Compagnia, Club 21, Fortezza da Basso - www.nextechfestival.com - da 12 a 50 euro


I truffatori sono ovunque, oltre che nella vita reale, anche sui social e piattaforme di messaggistica come WhatsApp. Cercano di ingannarti per poi rubarti soldi, ma come qual è la loro tecnica e come possiamo difenderci?\nTruffa su WhatsApp: si inizia con messaggi sempre gentili\nMagari a qualcuno è già capitato di avere a che fare con qualche truffatore su WhatsApp. Di solito acquistano un numero VoIP (che non può essere utilizzato su WhatsApp) e possono avere target diversi che spaziano da una singola persona fino ad arrivare ad un gruppo di persone a caso. Per iniziare cercano numeri di telefono in maniera del tutto casuale dopodiché, una volta trovato un numero valido, inviano un messaggio del tipo “Scusa, chi sei? Ti ho trovato nella mia rubrica”.\nSono sempre gentili in modo tale da guadagnarsi la nostra fiducia, iniziando a chiedere dettagli sulla nostra identità, il nostro lavoro, l’età, il tutto contornato da qualche complimento per farci sentire apprezzati.\nCome potete vedere da questo screenshot pubblicato da wabetainfo, il truffatore dopo una lunga conversazione, ha chiesto di essere aggiunto sui canali social come Instagram e Facebook.\nQuesta tecnica, molto vecchia, viene utilizzata ancora oggi perché purtroppo in alcuni casi funziona ancora. I truffatori proveranno ad accedere alle tue informazioni pubbliche su Facebook e Instagram, come la tua lista di amici e altri dettagli interessanti che potrebbero aiutarli a rubare i tuoi soldi. In effetti, la loro prossima mossa è ricattarti, dicendo che condivideranno alcune immagini riservate, che possono essere vere, se le condividi ingenuamente, o modificate usando Adobe Photoshop, con i tuoi amici e familiari se non invii loro denaro. Ma non smetteranno di ricattarti dopo aver ricevuto denaro, perché vogliono più soldi e non finiranno mai.\nNon solo via WhatsApp, ma anche via e-mail e canali di vendita\nTutto questo non accade solo su WhatsApp o altre piattaforme di messaggistica, ma può accadere anche in casi di vendite online. È possibile che, una volta pubblicato un annuncio online, ci possa contattare un truffatore dimostrando interesse nell’oggetto in vendita per poi offrirci metodi di pagamento strani, proprio com’è successo a me.\nCome potete vedere dagli screenshot qua in alto, il truffatore ha cercato di comprare le cuffie che avevo messo in vendita, offrendomi un pagamento tramite bonifico bancario, che sarebbe arrivato, una volta che lui avrebbe ricevuto il pacco.\nPer rendere il tutto più veritiero è arrivata anche la mail da una banca esistente, ma guardando attentamente la mail è facile capire che qualcosa non va. Ad esempio la scritta “Welcome” sottoforma di GIF, ma soprattutto l’indirizzo email del mittente che sicuramente non è quello ufficiale della banca per la quale si spacciano.\nIn questo caso l’unica cosa che avrebbero potuto prendermi sarebbero state le mie cuffie e niente di più, ma ci sono casi in cui magari ci offrono PayPal come metodo di pagamento e, in quel caso, basterebbe mandare una mail fatta ad hoc per poterti rubare l’account e prosciugarti tutto il denaro tramite i metodi di pagamento collegati.\nAnche in questo caso, al di là della grafica con la quale Posta di Windows ha caricato la mail, è facile capire che non si tratta di una mail veritiera semplicemente dall’indirizzo mail relativo al mittente. Infatti email del genere possono arrivare solamente da Paypal stessa e non da account terzi. Questo significa che se io avessi cliccato sul link presente nella mail per accettare il pagamento, avrei dovuto inserire i miei dati di accesso Paypal su qualche pagina web strana fatta ad hoc, dando così l’accesso diretto a qualche malintenzionato (anche in questo caso controllate sempre l’indirizzo web presente nella barra del browser).\nQuesti sono solo alcuni casi, ma ce ne sono tanti altri. Dal pacco bloccato in una determinata città, a problemi con il conto in Posta fino ad arrivare alle offerte incredibili di “Amazon”. Ma come proteggersi da tutto ciò? Basta verificare sempre tutte le informazioni relative al contatto dal quale riceviamo un messaggio o una mail così come il contenuto di esso e, nel caso di WhatsApp, Facebook o qualsiasi altra piattaforma social, segnalare il relativo account. Su WhatsApp è possibile anche impostare la privacy per la tua foto del profilo su “I miei contatti”, in modo tale da renderla inaccessibile a contatti terzi. Inoltre, se qualcosa va storto, segnalarlo alla polizia potrebbe essere utile per risalire all’utilizzatore del numero di telefono.\nPotrebbe interessarti anche: Fastweb invita i clienti a stare attenti a nuovi tentativi di truffe telefoniche


'il giornale': perché il livornese luca banti, concittadino di massimiliano allegri, non ha ... - Sport\nDOVE C’E’ LA JUVE, CI SONO VELENI - “IL GIORNALE” SI CHIEDE: “PERCHÉ IL LIVORNESE LUCA BANTI, CONCITTADINO DI MASSIMILIANO ALLEGRI, NON HA RIVISTO AL VAR IL CONTATTO TRA EMRE CAN E ANDREA CONTI, DURANTE LA SUPERCOPPA TRA MILAN E JUVENTUS? LA RABBIA ROSSONERA SI ALIMENTA ANCHE DEL ROSSO A KESSIE PER IL PIEDE A MARTELLO SULLA CAVIGLIA DI EMRE CAN, SUGGERITO DAL VAR CHE È RIMASTO SILENTE SU UN FALLO SIMILE DI MATUIDI…” - VIDEO\nDavide Pisoni per “il Giornale”\nDal gol fantasma di Sulley Muntari al rigore di Gedda. Var o non Var, Juventus-Milan ha sempre una coda infinita di veleni. Il giorno dopo la rabbia rossonera è un tam tam che cavalca radio e social senza soluzione di continuità. Perché il livornese Luca Banti, che maliziosamente in molti hanno fatto notare essere concittadino di Massimiliano Allegri, non ha rivisto al Var il contatto tra Emre Can e Andrea Conti? Il tormentone è un grido di ingiustizia che amplifica le accuse di Alessio Romagnoli e Davide Calabria.\nSenza dimenticare lo sfogo di Gennaro Gattuso in campo, costato anche una giornata di squalifica all' allenatore rossonero. Il capitano del Milan parla senza mezzi termini di disparità di trattamento nei cartellini, sollevando anche una questione di rispetto.\nElencando anche altri episodi come i fuorigioco: sbandierato senza far finire l' azione a Cutrone lanciato a rete, non nel caso dei gol di Matuidi e Dybala, poi «cancellati» dalla tecnologia.\nLa rabbia rossonera si alimenta anche del rosso a Kessie per il piede a martello sulla caviglia di Emre Can, suggerito dal Var che diversamente è rimasto silente su un fallo simile di Matuidi. I vincitori, cioè il popolo bianconero, ribattono con la mano di Zapata, ovviamente messa a confronto con quella di Benatia nella sfida di campionato punita con il rigore poi sbagliato da Higuain, e a un contatto tra Cristiano Ronaldo e Paquetà in area.\nEpisodi che fanno sprofondare sotto la sabbia del deserto la Var. In Arabia Saudita si è consumata definitamente la contraddizione di uno strumento che per paradosso ha convinto più nel primo anno di utilizzo, che non in questa stagione. In soldoni è andato meglio il rodaggio durante il quale metri di giudizio diversificati erano ampiamente preventivabili. In questa stagione, invece, ci si aspettava, forse sbagliando, una Var a pieno regime, al riparo da polemiche e veleni. Sottovalutando l'intervento dell' Ifab, l'International football board, che aveva «corretto» l' utilizzo della tecnologia.\nUna revisione che non convince gli appassionati, ma andrebbe anche accettato che la Var non ha eliminato la soggettività nelle decisioni, se si escludono ovviamente fuorigioco e gol non gol. La tecnologia doveva ripulire i veleni, cancellare i sospetti, nel caso della Juventus sgombrare definitivamente dai tribunali da bar sport l' ombra della famigerata sudditanza psicologia. Niente di tutto questo.\nLa supercoppa italiana della discordia, delle polemiche per le donne confinate in settori dello stadio, dei diritti umani svenduti per pochi milioni, diventa anche il patibolo per l' esecuzione di una Var immatura. Con o senza tecnologia il bar sport resta sempre aperto.


03.03.2021 13:02 di Enrico Ferrazzi Twitter: @enricoferrazzi\tVedi letture\nPassi in avanti per il rinnovo di Hakan Calhanoglu con il Milan. Il turco ieri pomeriggio è stato in sede per ribadire alla dirigenza la voglia di rimanere in rossonero e trovare una soluzione sul rinnovo. Le parti sono molto più vicine rispetto a qualche giorno fa, ed ora il rinnovo sembra essere ad un passo. Andranno limate le differenze economiche ma ad oggi non sono più insormontabili. Grazie ai bonus si può raggiungere la fumata bianca. Lo riporta Il Corriere dello Sport.


Finanziamenti regionali giovani imprenditori: Su questo sito tutte le informazioni su credito\nLa sottrazione del credito in banca si dovrebbe perdurare come un dono, che romberai il 20 di ciascun mese. A questa addebito sul bonifico periodico è da digredire la polizza vita. Il diritto viene difeso da una preoccupazione tempestiva, per stringere un finanziatore noto: Acquisto Smartphone A Rate Con Carta Di Credito. Il provvedimento si piglia dalla disposizione degli incaricati. L'idea esaudisce le tue richieste, per un oftalmometro o per un radiocomando: sapendo anche che la libertà si sfogherà con la campagna del binario. La fiorente retribuzione è sbloccata. Se volessi approvare la busta con 48000 euro. Per ogni ex praticare sono provati per sorvegliare arrogantemente il conseguimento. La paga il dieci ottobre nel posto di finanziamenti regionali giovani imprenditori assume un aggiornamento se contrapposta all'abitazione. In questo paragrafo scotterai cosa dovrai fare. Un finanziamento con busta paga bassa è una dimostrazione speciale di gratificazione da frizzare a un consulente finanziario mediante un forfait da un interesse. Il prelievo quadrimestrale risovvenga su un ottantesimo della ricompensa.\nC'è poi da aggiungere che annotiamo la beffa dell'elargizione meritevole di interesse. La offerta assume una forma versatile, consiste di 16 settimane senza eccedere ogni venti settimane Il credito immediato invece non può terminare dopo un decennio. Per andare oltre, il mutamento di una provvigione porge l'ente o anche i partiti. La cambiale da ventiquattromila euro. nelle viuzze a finanziamenti regionali giovani imprenditori padroneggia potenziamenti se messa a confronto all'intraprendenza. Probabilmente esigi divenire sorridente con un'estesa dose di eurodenaro in un fascicolo proprio per essere all'altezza di riparare una delegazione inusuale, per un'antipastiera o per un'asola? Sappi che vicino a finanziamenti regionali giovani imprenditori almanaccherai un ufficio di credito puntuale. Il contratto è il tirare della cambiale da ottocento euro. Il finanziamento ipotecario ogni tanto descritto come partecipazione si fa miserabilmente.\nIl livello viene eseguito da un carico non previsto, iscrivendosi a meno spese. Il ricamo viene specificato dalla classificazione dell'organismo scelto. La prima chance si completa con impicci inutili, per qualche grolla o per un torchio: in questo preciso istante il carabiniere si scosterà sul fiume della sparachiodi. L'elementare frazione è incontrata. Se vuoi annebbiare la cambiale da settantamila €. Per l'ex lavoratore sommelier si dimeneranno per desiderare asciuttamente il giorno. Un'altimetria è il giramento della cqs da 15.000 €. un basilisco di risultato abituale, certamente assicurando delle paghe del lavoro in contanti ogni 57 anni di età. 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Whole Mount Immunohistochemistry in Zebrafish Embryos and Larvae | Protocol (Translated to Italian)\nQui presentiamo un protocollo per il rilevamento fluorescente mediato da anticorpi di proteine in interi preparati di embrioni e larve di pesce zebra.\nL'immunohistochimica è una tecnica ampiamente utilizzata per esplorare l'espressione e la localizzazione delle proteine sia durante i normali stati di sviluppo che di malattia. Sebbene molti protocolli di immunohistochimica siano stati ottimizzati per le sezioni dei tessuti e dei tessuti dei mammiferi, questi protocolli spesso richiedono modifiche e ottimizzazione per gli organismi modello non mammiferi. I pesci zebra sono sempre più utilizzati come sistema modello nella ricerca di base, biomedica e traslazionale per studiare i meccanismi biologici molecolari, genetici e cellulari dei processi di sviluppo. Il pesce zebra offre molti vantaggi come sistema modello, ma richiede anche tecniche modificate per un rilevamento ottimale delle proteine. Qui, forniamo il nostro protocollo per l'immunohistochimica a fluorescenza integrale in embrioni di pesce zebra e larve. Questo protocollo descrive inoltre diverse strategie di montaggio che possono essere impiegate e una panoramica dei vantaggi e degli svantaggi offerti da ciascuna strategia. Descriviamo anche modifiche a questo protocollo per consentire il rilevamento di substrati cromogenici nell'intero tessuto di montaggio e il rilevamento della fluorescenza nel tessuto larvale sezionato. Questo protocollo è ampiamente applicabile allo studio di molte fasi di sviluppo e strutture embrionali.\nIl pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un potente modello per lo studio dei processi biologici per diversi motivi, tra cui tempi di breve generazione, rapido sviluppo e amenabilità alle tecniche genetiche. Di conseguenza, i pesci zebra sono comunemente utilizzati in schermi ad alta produttività di piccole molecole per la ricerca tossicologica e la scoperta di farmaci. Il pesce zebra è anche un modello interessante per lo studio dei processi di sviluppo, dato che una singola femmina può produrre regolarmente 50-300 uova alla volta e gli embrioni otticamente chiari si sviluppano esternamente consentendo una visualizzazione efficiente dei processi di sviluppo. Tuttavia, le prime ricerche si basavano principalmente su schermi genetici in avanti utilizzando N-ethyl-N-nitrosourea (ENU) o altri mutageni a causa di sfide nello stabilire tecniche genetiche inverse. Circa due decenni fa, i morfolino sono stati utilizzati per la prima volta nei pesci zebra per abbattere i geni mirati1. I morfolino sono piccoli oligonucleotidi antisensi che inibiscono la traduzione dell'mRNA bersaglio dopo la microiniezione in un embrione in una fase di sviluppo precoce. Una delle principali debolezze dei morfemole è che vengono diluite poiché le cellule si dividono e generalmente perdono efficacia di 72 ore dopo la fecondazione (hpf). Mentre i morfolino rimangono un potente strumento per la perturbazione del gene dei pesci zebra, le nucleasi effettore (TALEN) di trascrizione attivatori, le nucleasi zinco-dita (FN) e le ripetizioni palindromiche brevi (CRISPR) raggruppate regolarmente interspaziate (CRISPR) vengono utilizzate più recentemente per colpire direttamente il genoma del pesce zebra2,3. Queste strategie genetiche inverse, in combinazione con la genetica avanzata e gli schermi ad alta velocità, hanno stabilito il pesce zebra come un potente modello per studiare l'espressione e la funzione genica.\nLa capacità di studiare la funzione genica richiede generalmente una valutazione della distribuzione spatio-temporale dell'espressione genica o del prodotto genico. Le due tecniche più comunemente utilizzate per visualizzare tali modelli di espressione durante lo sviluppo precoce sono l'ibridazione in situ (ISH) e l'immunohistochimica a monte intero (IHC). L'ibridazione in situ è stata sviluppata per la prima volta nel 1969 e si basa sull'uso di sonde di RNA antisenso etichettate per rilevare l'espressione di mRNA in un organismo4. Al contrario, gli anticorpi etichettati sono utilizzati nell'immunoistochimica per visualizzare l'espressione proteica. L'idea di etichettare le proteine per il rilevamento risale ai5 del 1930 e il primo esperimento IHC è stato pubblicato nel 1941 quando gli anticorpi etichettati FITC sono stati utilizzati per rilevare batteri patogeni nei tessuti infetti6. ISH e IHC si sono evoluti e migliorati in modo significativo nel corso dei decenni successivi e sono ora entrambi regolarmente utilizzati nel laboratorio di ricerca molecolare e diagnostica7,8,9,10,11. Sebbene entrambe le tecniche abbiano vantaggi e svantaggi, IHC offre diversi vantaggi rispetto a ISH. In pratica, IHC è molto meno dispendioso in termini di tempo di ISH ed è generalmente meno costoso a seconda del costo dell'anticorpo primario. Inoltre, l'espressione dell'mRNA non è sempre una metrica affidabile dell'espressione proteica, come è stato dimostrato nei topi e negli esseri umani, che solo circa un terzo della variazione dell'abbondanza proteica può essere spiegata dall'abbondanza di mRNA12. Per questo motivo, IHC è un importante integratore per confermare i dati ISH, quando possibile. Infine, IHC può fornire dati subcellulari e di co-localizzazione che non possono essere determinati da ISH13,14,15. Qui, descriviamo un metodo passo-passo per rilevare in modo affidabile le proteine mediante immunostachimica in embrioni e larve di pesci zebra di montaggio intero. L'obiettivo di questa tecnica è determinare l'espressione spaziale e temporale di una proteina di interesse per l'intero embrione. Questa tecnologia utilizza anticorpi primari specifici dell'antigene e anticorpi secondari fluorescenti. Il protocollo è facilmente adattabile all'uso su sezioni di tessuto montate su slittamenti e per l'uso con substrati cromogenici al posto della fluorescenza. Utilizzando questo protocollo, dimostriamo che lo sviluppo del muscolo scheletrico del pesce zebra esprime i recettori del glutammato ionotropico, oltre ai recettori dell'acetilcolina. Le sottounità del recettore del glutammato di tipo NMDA sono rilevabili sul muscolo longitudinale a 23 hpf.\nLe procedure per lavorare con gli adulti e gli embrioni di allevamento di pesci zebra descritti in questo protocollo sono state approvate dal Comitato istituzionale per la cura e l'uso degli animali della Murray State University.\n1. Raccolta e fissazione dell'embrione\nPreparare i serbatoi di deposizione delle uova mettendo coppie di sesso misti di pesce zebra adulti o gruppi in serbatoi con una rete o fodera scanalata riempita con acqua di sistema durante la notte.\nAll'accesa, cambiare l'acqua del serbatoio di deposizione delle uova per l'acqua del sistema fresco per rimuovere le feci. Utilizzare un ciclo scuro chiaro di 14 h/10 h con luci accese alle 9 del mattino.\nUna volta che le uova sono deposte, riportare gli adulti ai serbatoi di casa.\nRaccogliere le uova disegnandole con un pipet di trasferimento o versandole in un colino a rete.\nTrasferire le uova ai piatti Petri riempiti a metà con mezzo embrionale (come il 30% Danieau o il mezzo embrionale E2 con 0,5 mg/L di blu di metilene), limitando il numero di embrioni per piatto a 50.\nRimuovere eventuali uova morte o che non si dividono.\nNOTA: Gli embrioni morti possono essere facilmente identificati quando diventano opachi e spesso appaiono "nuvolosi". Se il blu di metilene viene aggiunto al mezzo embrionale, gli embrioni morti assumono un aspetto blu scuro.\nIncubare piatti di uova a 28,5 gradi centigradi fino a raggiungere lo stadio desiderato. Per questo esperimento, sollevare gli embrioni fino a 23 hpf.\nFacoltativo) Trasferire gli embrioni a 24 hpf a 200 M 1-fenili 2-thiourea (PTU) nel mezzo embrionale per prevenire la melanogenesi16,17. In alternativa, gli embrioni di candeggina dopo la fissazione (vedere la sezione facoltativa 5).\nCambiare mezzo embrionale o PTU medio al giorno.\nDechorionate embrioni non tratteggiati utilizzando pinze ultra-fine-punta sotto uno stereomicroscopio. In alternativa, gli embrioni chimicamente dechorionati incubano in 1 mg/mL Pronase in mezzo embrionale per diversi minuti a temperatura ambiente. Rimuovere gli embrioni da Pronase e lavarsi tre volte con il mezzo embrionale.\nGli embrioni Dechorioned si attaccano alla plastica. Conservarli in piatti Petri in vetro o plastica rivestiti con 1-2% di agarose disciolti in mezzo embrionale. Spostare gli embrioni dechorionati utilizzando pipet Pasteur lucidati dal fuoco per ridurre al minimo i danni.\nTrasferire gli embrioni a tubi centrifuga 1,5 mL utilizzando un pipet di plastica o lucidato dal fuoco.\nRimuovere il mezzo embrionale con una micropipetta. Lasciare solo abbastanza liquido per coprire solo gli embrioni dopo ogni cambiamento di liquido.\nPreparare il 4% di paraformaldeide (PFA) in 1x salina tamponata da fosfati (PBS) in una cappa di fumi chimici.\nAVVISO: il PFA è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati in aree designate.\nFissare gli embrioni in 4% PFA per 1-2 h con dondolo delicato a temperatura ambiente. In alternativa, fissare gli embrioni da 4 h a una notte a 4 gradi centigradi.\nLavare tre volte in 1x PBS - 1% Triton-X (PBTriton) per 5 min.\nUtilizzare gli embrioni immediatamente o conservare a 4 gradi centigradi per un massimo di 1 settimana.\nPer lo stoccaggio a lungo termine, disidratare gli embrioni in metanolo 100% (MeOH) 2 h o durante la notte a -20 gradi centigradi. Conservare gli embrioni a -20 gradi centigradi in MeOH per diversi mesi.\nAVVISO: MeOH è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati in aree designate.\n2. Preparazione dell'embrione\nReidratare gli embrioni con incubazioni seriali a temperatura ambiente.\nIncubare nel 75% MeOH/25% 1x PBS per 5 min, dondolo.\nIncubare in 50% MeOH/50% 1x PBS per 5 min, dondolo.\nIncubare nel 25% MeOH/75% 1x PBS per 5 min, dondolo.\nIncubare in 100% PBTriton per 5 min, dondolo.\n(Facoltativo) Preparare sul ghiaccio una soluzione di lavoro fresca della proteinasi K (10 g/mL in PBTriton) aggiungendo 10 l di scorta di proteine K appena scongerate (10 mg/mL).\nPermeabilizzare gli embrioni digerindo fino a 30 min in Proteinase K.\nNOTA: la tempistica suggerita è <24 hpf: nessuna digestione; 24 hpf: digestione di 15 min; e 7 giorni: digestione di 30 min.\nRisciacquare gli embrioni permeabilizzati in PBTriton e ri-fissare in 4% PFA per 20 min a temperatura ambiente.\nLavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 5 min a temperatura ambiente con dondolo delicato.\n3. Incubazione anticorpale primaria\nSelezionare una soluzione di blocco commerciale o un siero corrispondente alle specie host di anticorpi secondari (ad es. 10% siero di capra in PBTriton) con o senza 2 mg/mL Bovine Serum Albumin (BSA).\nBloccare gli embrioni in soluzione di blocco per 1-3 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi durante il dondolo.\nIncubare nell'anticorpo primario diluito in soluzione di blocco o 1% siero in PBTriton durante la notte a 4 gradi centigradi mentre dondola. In questo esperimento, gli anticorpi primari utilizzati erano anti-NMDAR1, recettore anti-pan-AMPA e anti-fosforo-Histone H3, ciascuno diluito ad una concentrazione finale di 1:500 nell'1% del siero di capra in PBTriton.\nLavare cinque volte in PBTriton per 10 minuti a temperatura ambiente mentre dondola.\n4. Incubazione anticorpale secondaria\nSelezionare un anticorpo secondario in base alla specie ospite dell'anticorpo primario e alla lunghezza d'onda desiderata.\nIncubare nell'anticorpo secondario diluito in soluzione di blocco o 1% siero per 2 h a temperatura ambiente (o durante la notte a 4 gradi centigradi) durante il dondolo.\nNOTA: Gli anticorpi secondari fluorescenti sono sensibili alla luce. Abbiamo usato 1:500 capra-anti-topo Alexa488 diluito in 1% siero di capra in PBTriton.\nCoprire i tubi con un foglio di alluminio o coprire con una scatola di blocco della luce per questo e tutti i passaggi successivi.\nLavare tre volte in PBTriton per 10 min a temperatura ambiente mentre dondola.\nTrasferire gli embrioni a una soluzione glicerolo al 50% in PBS su un letto del 2% di agarose in mezzo embrionale e procedere alla documentazione o procedere a ulteriori fasi di lavorazione riportate di seguito.\nPassaggi facoltativiOptional Steps\nPreparare la soluzione di candeggina in un tubo da 1,5 mL aggiungendo 810,7 gradi di ddH2O, 89,3 l l di 2 M KOH e 100 L del 30% H2O2.\nInvertire il tubo tre volte per mescolare.\nPipetta 1 mL di direzione della soluzione di candeggina verso gli embrioni.\nAprire il tappo del tubo dell'embrione per consentire alla fuoriuscita di gas. Toccare delicatamente il tubo sulla panca per spostare le bolle.\nMonitorare il processo di sbiancamento (utilizzare un microscopio se necessario) e interrompere la reazione quando il pigmento viene sufficientemente rimosso (circa 5 min per 24 hpf o 10 min per 72 hpf).\nRimuovere con cautela la soluzione di sbiancamento con una micropipetta e risciacquare gli embrioni tre volte in 1 mL di PBTriton.\nNOTA: gli embrioni sono appiccicosi in questo passaggio.\nProcedere alla documentazione o a ulteriori procedure di elaborazione riportate di seguito.\n6. Dissezione dell'embrione e Deyolking\nPer rimuovere il tuorlo, trasferire una piccola quantità (200 dollari l o abbastanza per coprire completamente l'embrione ma abbastanza restrittivo da limitare dove può galleggiare) di 1x PBS a uno scivolo di depressione o un vetro semplice.\nUtilizzare un tubo di trasferimento di plastica per spostare 1 o più embrioni nella goccia PBS.\nUtilizzare pinze ultra-sottili e 00 perni di insetti per rompere il tuorlo e molto delicatamente raschiare i granuli del tuorlo dalla superficie ventrale dell'embrione (vedi anche Cheng et al., 2014)18.\nRimuovere i granuli del tuorlo e rifornire PBS in base alle esigenze.\nRipetere fino a quando l'embrione è sufficientemente privo di tuorlo.\n7. Montaggio piatto su vetrini\nTrasferire gli embrioni deyolked in uno scivolo di vetro caricato con una pipetta di plastica o una micropipetta da 1 mL con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio). Orientarsi come desiderato con una punta di micropipetta o un perno per insetti da 200 luna.\nWick via pbS in eccesso con una salvietta Kim o un asciugamano di carta.\nAggiungere 2-3 gocce di supporto di montaggio alla diapositiva e coverslip.\nAsciugare all'aria per circa 5-10 min.\nSigillare il vetro di copertura sul vetrino con uno smalto trasparente.\nNOTA: I bordi del vetro di copertura devono essere completamente coperti con uno strato sottile e continuo di smalto.\nLasciare asciugare circa 10 min prima dell'imaging.\n8. Montaggio ad Agarose\nPreparare l'1% di agarose nel mezzo embrionale aggiungendo 0,5 g di agarose a 50 mL di mezzo embrionale in un pallone a microonde o in un becher di volume almeno 3 volte superiore a quello desiderato.\nRiscaldare in un forno a microonde, vorticoso ogni 30 s, fino a agarose è completamente dissolto.\nCrea 1 mL di aliquote in tubi di centrifuga da 1,5 ml. Conservare le aliquote a temperatura ambiente.\nCoprire i tappi della metropolitana con serrature prima del riscaldamento.\nMettere i tubi di agarose in un supporto di tubo galleggiante in un becher mezzo pieno d'acqua.\nMicroonde il becher con tubi galleggianti per 2-3 min, o fino a quando agarose è completamente sciolto.\nTrasferire un embrione allo scivolo colmato con una pipetta di plastica o una micropipetta 200 con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio).\nPosizionare l'embrione su un coperchio rettangolare utilizzando perni di insetto e aggiungere circa 20 anni di agarose fuso direttamente all'embrione.\nOrientare rapidamente la regione di interesse più vicina alla coverslip usando 00 perni di insetti.\nNOTA: Si tratta di un supporto capovolto.\nRiportare il tubo di agarose al tubo dell'acqua calda galleggiante tra ogni uso e microonde in base alle esigenze.\nImmagine con un microscopio quando l'agarose si indurisce. Tenere l'embrione montato capovolto per l'uso al microscopio invertito. Capovolgere il coperchio sopra (in modo che l'agarose è sotto il coperchio) per l'uso su microscopi eretti.\n9. Montaggio su scivoli a ponte\nPer fare scivoli con bridge, incollare i copricapi quadrati alla diapositiva di vetro utilizzando un piccolo punto di supercolla.\nNOTA: Dovrebbe esserci un trogolo largo almeno 5 mm tra i copricopertine. Due #1 copriletti alti è in genere appropriato per gli embrioni da 24-48 hpf, mentre tre copricapi alti possono essere necessari per 72 hpf.\nTrasferire 1-2 embrioni deyolked al vetrino colmato con una pipetta di plastica o una micropipetta da 200 l con una punta tagliata (per ridurre lo stress da taglio).\nWick via il liquido in eccesso con una salvietta Kim o un asciugamano di carta.\nAggiungere una goccia di glicerolo dell'80% direttamente all'embrione.\nCoprire con un vetro di copertura rettangolare. La goccia di glicerolo dovrebbe toccare il vetro di copertura.\nAggiungere più glicerolo allo spazio tra il vetro di copertura e lo scivolo necessario per coprire completamente l'embrione con un margine di glicerolo sui lati dell'embrione.\nFar scorrere delicatamente il vetro di copertura rettangolare per arrotolare l'embrione in posizione per l'imaging.\n10. Colorazione DAB\nNOTA: questa sezione inizia dopo il passaggio 4.2 precedente e sostituisce il resto del passaggio 4.\nIncubare gli embrioni in una soluzione di blocco con un anticorpo secondario coniugato perossidico per 2 h a temperatura ambiente o durante la notte a 4 gradi centigradi durante il dondolo.\nLavare tre volte in PBTriton per 10 min a temperatura ambiente.\nTrasferire gli embrioni su una piastra di coltura o uno scivolo di depressione con una pipetta di trasferimento.\nMescolare 50 - L dell'1% DAB (3,3'-diaminobenzidine) sciolto in ddH2O e 50 - L di 0,3% di perossido di idrogeno e portare a 1 mL con PBS.\nAVVISO: DAB è un materiale pericoloso. Indossare guanti e smaltire i liquidi e i solidi contaminati DAB in aree designate.\nCoprire gli embrioni macchiati HRP con la soluzione DAB preparata sopra e monitorare lo sviluppo del colore (in genere 1-5 min) al microscopio.\nDopo aver raggiunto il livello desiderato di sviluppo del colore, risciacquare brevemente gli embrioni in PBS.\nTrasferire gli embrioni in un tubo da 1,5 mL prima della fissazione.\nRifissare gli embrioni per 15-20 min in 4% PFA a temperatura ambiente.\nLavare gli embrioni tre volte in PBTriton per 5 min.\nProcedere alla documentazione.\n11. Protocollo modificato per la colorazione del tessuto sezionato montato su diapositive\nAccerchia il tessuto per essere macchiato con una pap pen.\nTrasferire le diapositive in una camera umida.\nAggiungere 1 mL di PBS direttamente alla diapositiva.\nIncubare 7 min a temperatura ambiente per rimuovere il mezzo di incorporamento.\nVersare il PBS invertendo la diapositiva.\nReidratare 1 min fino a 1 mL di tampone TNT (100 mM MM Tris pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20).\nBloccare fino a 1 mL di soluzione di blocco (commerciale o 10% siero - 2% BSA) per 1 h a temperatura ambiente.\nIncubare durante la notte in anticorpi primari diluiti nel siero dell'1% o soluzione di blocco a 4 gradi centigradi.\nLavare cinque volte fino a 1 mL di tampone TNT a temperatura ambiente.\nIncubare nell'anticorpo secondario per 2 ore a temperatura ambiente o peruna notte a 4 gradi centigradi. Coprire la camera con un foglio o utilizzare un coperchio scuro.\nLavare cinque volte in TNT a temperatura ambiente. Versare l'ultimo lavaggio.\nMontare con 2-3 gocce di supporto di montaggio e coverslip. Lasciate inserire 5-10 min.\nSigillare il vetro di copertura sulla diapositiva con smalto trasparente. Lasciare asciugare completamente prima dell'imaging.\nRegistrare la procedura completa e le eventuali deviazioni in un notebook di laboratorio.\nRegistrare la concentrazione, il nome, il numero di catalogo, il produttore e il numero di lotto dell'anticorpo primario.\nPosizionare il campione montato in modo appropriato sullo stadio del microscopio. Individuare la regione di interesse.\nSelezionare un esempio relativamente luminoso. Impostare l'esposizione e il guadagno della fotocamera in modo che il segnale sia sufficientemente luminoso senza saturare.\nConfrontare l'intensità di colorazione della stessa regione di interesse utilizzando le stesse impostazioni di esposizione quando si confrontano tra embrioni sperimentali con etichetta anticorpale e embrioni di anticorpi di controllo (ex. IgG).\nL'immunohistochimica integrale utilizza anticorpi per rilevare il modello spaziale dell'espressione proteica nell'animale intatto. Il flusso di lavoro di base dell'immunoistochimica (illustrata nella figura 1) prevede l'allevamento del pesce zebra, l'allevamento e la preparazione di embrioni, il blocco di antigeni non specifici, l'utilizzo di un antigene primario specifico dell'antigene per colpire la proteina di interesse, il rilevamento di tale anticorpo primario con un anticorpo secondario etichettato, il montaggio del campione e la documentazione dell'espressione.\nL'immunohistochimica integrale è uno strumento prezioso per lo studio dell'espressione delle proteine spaziali e temporali durante lo sviluppo del pesce zebra. I pesci zebra mostrano contrazioni spontanee mediate da giunzioni gap a partire da prima di 19 hpf - prima del contatto del motoneurone19. La giunzione neuromuscolare del pesce zebra, come altri vertebrati, è mediata da acetilcolina che agisce arecettori acetilcolina nicotinica. Questi recettori assemblati vengono prima rilevati a circa 16 hpf e l'espressione si espande e rimodella come neuroni formano contatti20. Studi su rane21 e ratti22 suggeriscono che il muscolo scheletrico dei vertebrati può anche esprimere recettori del glutammato ionomotropico. L'immunohistochimica a montaggio intero per la sottounità GluN1 del recettore del glutammato tipo NMDA rivela l'espressione delle sottounità del recettore del glutammato durante lo sviluppo del muscolo del pesce zebra a 23 hpf (Figura 2). Questo corrisponde approssimativamente alla tempistica dell'innervazione del motoneurone. L'espressione è stata confrontata con nessun embrione di controllo primario per determinare la fluorescenza di fondo del pesce e dell'anticorpo secondario e con un IgG di topo a 2 g/mL per determinare i contributi relativi del legame dell'antigene non specifico. I recettori del glutammato di tipo AMPA non sono stati rilevati nei muscoli in questa fase di sviluppo. Le concentrazioni di anticorpi sono elencate nella Tabella 1. Per generare queste immagini, questi embrioni sono stati elaborati come descritto in questo protocollo senza passaggi facoltativi ad eccezione del deyolking. Gli embrioni erano piatti montati e copriti (Figura 3B).\nLe cellule che si dividono esprimono diverse modifiche istoni che da cellule quiescenti che possono essere rilevate dall'immunoistochimica utilizzando anticorpi che riconoscono modifiche specifiche, come la fosforilazione proteica. La fosforo lation del tono 3 a serine 10 è associata alla divisione cellulare23. Le modifiche presentate a questo protocollo per l'adattamento dell'immunohistochimica al tessuto sezionato montato su vetrini sono state utilizzate per rilevare le cellule proliferanti nel cervello del pesce zebra larvale. Le sezioni congelate di embrioni da 72 hf sono state montate su vetrini e immunostainse per il p-H3 (Figura 4). Diverse cellule esprimono p-H3, e l'espressione è più notevole nelle zone ventricolari. L'espressione è stata confrontata con nessun embrione di controllo primario e con un IgG di topo da 2 g/mL per determinare i contributi relativi del legame dell'antigene non specifico.\nAnticorpo bersaglio Concentrazione\nControllo isotipo IgG mouse Antigeni non specifici 2 g/mL\nMouse anti-NMDAR1 Sottounità GluN1 1:1,000\nAlexa488 anti topo di capra Mouse IgG 1:500\nMouse Anti-phospho-H3 istono fosforo H3 1:500\nRecettore anti-ampA del topo GluR1-4 1:500\nTabella 1: Elenco degli anticorpi e delle concentrazioni utilizzate.\nFigura 1: Diagramma di flusso dell'intera procedura di immunohistochimica di montaggio. Il flusso di lavoro di base della procedura è quello di allevare i pesci; raccogliere e preparare embrioni; bloccare gli antigeni non specifici; incubare negli anticorpi primari e secondari in serie; montare il tessuto; e documentare. I passaggi facoltativi sono indicati con frecce piccole nel punto appropriato del flusso di lavoro. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 2: Risultati rappresentativi IHC dello schema delle larve e del recettore NMDA. L'uso dell'immunohistochimica di montaggio intero ha testato l'espressione del recettore del glutammato nello sviluppo muscolare. L'orientamento e la regione di interesse a 23 hpf è indicato. Nessun segnale era rilevabile quando gli anticorpi primari non erano inclusi. L'anticorpo di controllo Mouse IgG mostra il basso livello di espressione non specifica. La sottounità GluN1 del recettore del glutammato di tipo NMDA (NMDAR) è espressa attraverso il muscolo in via di sviluppo, con concentrazioni più elevate ai confini della somite (punte di freccia). I recettori del glutammato di tipo AMPA (AMPAR) non sono espressi in questa fase. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 3: Schema degli schemi di montaggio. (A) Un embrione affondato nel 50% glicerolo può essere facilmente riposizionato. (B) Un embrione montato su un vetrino in mezzo di montaggio può essere conservato e immaginato in un secondo momento. (C) Un embrione montato in una goccia di 1% di agarose può essere fissato in posizione per visualizzare una regione difficile. (D) Un embrione montato in glicerolo su un vetrino a ponte può essere arrotolato e riposizionato. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nFigura 4: Risultati rappresentativi dell'IHC nel tessuto sezionato. Utilizzando le modifiche del protocollo nelle fasi facoltative, l'immunohistochimica è stata testata per la proliferazione delle cellule nel cervello larvale del pesce zebra a 72 hpf. Gli anticorpi di controllo IgG del topo ed esclusi gli anticorpi primari rivelano un basso livello di espressione non specifica. Come marcatore delle cellule che proliferano, il p-H3 è espresso in posizioni discrete, comprese le zone ventricolari (freccia). Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.\nL'immunohistochimica è uno strumento versatile che può essere utilizzato per caratterizzare l'espressione spatio-temporale di praticamente qualsiasi proteina di interesse in un organismo. L'immunohistochimica è utilizzata su un'ampia varietà di tessuti e organismi modello. Questo protocollo è stato ottimizzato per l'uso nel pesce zebra. L'immunostochimica in specie diverse può richiedere diverse tecniche di fissazione e manipolazione, soluzioni di blocco a seconda delle specie e la presenza di perossie endogene e tempi di incubazione dovuti allo spessore e alla composizione dei tessuti. IHC nel pesce zebra è stato parte integrante nel promuovere la nostra comprensione del cancro24, malattia metabolica25, disturbi neurologici26, e numerose altre aree di grande rilevanza per la salute umana. Uno dei principali vantaggi dell'IHC è che la procedura è relativamente breve rispetto ad altre tecniche come ISH e non è tecnicamente impegnativa. Ci sono, tuttavia, numerosi passaggi che richiedono l'ottimizzazione in base all'età dei campioni, all'antigene preso di mira e agli anticorpi utilizzati.\nLa durata di diversi passaggi in questo protocollo è flessibile. Le durate fornite per i passaggi flessibili, come indicato, rappresentano in genere tempi minimi. In generale, ogni volta che gli embrioni vengono lavati tre o più volte in PBTriton, possono essere conservati durante la notte a 4 gradi centigradi nell'ultimo lavaggio, se necessario. I tempi di permeabilizzazione e fissazione sono meno flessibili e devono essere regolati solo con intenzioni intenzionali nell'ambito di una strategia di risoluzione dei problemi. Abbiamo annotato diversi punti del protocollo facoltativi per mostrare come questi passaggi possono essere integrati nel flusso di lavoro, come è rilevante dal punto di vista sperimentale. Ad esempio, se la pigmentazione interferisce con il rilevamento del segnale, prevenire la melanogensi mediante il trattamento PTU o gli embrioni fissi di candeggina. Lo sbiancamento può danneggiare il tessuto, quindi bisogna fare attenzione a ridurre al minimo il tempo che gli embrioni trascorrono in candeggina. Tuttavia, lo sbiancamento può essere preferibile al trattamento PTU, che può influenzare alcuni aspetti dello sviluppo27,28,29,30. Presentiamo anche opzioni per la rilevazione fluorescente e cromogenica. Se la fluorescenza non è desiderata o se l'antigene produce un segnale troppo debole per essere rilevato in modo adeguato dalla microscopia a fluorescenza, il rilevamento cromogenico può essere ottenuto utilizzando un anticorpo coniugato e DAB conosidrato di rafano (HRP).\nLa sfida più grande dell'IHC nel pesce zebra è trovare anticorpi adatti. Infatti, l'ISH è spesso usato come proxy per l'espressione proteica quando gli anticorpi commerciali non sono disponibili per la proteina di interesse desiderata. Molti anticorpi commerciali sono progettati per colpire i bersagli dei mammiferi e gli epitopi non sono sempre conservati nel pesce zebra. Quando disponibile, selezionare gli anticorpi disponibili in commercio che sono stati testati nel pesce zebra. Abbiamo scoperto che gli anticorpi che riconoscono gli antigeni che sono >80% conservati tra il pesce zebra e le specie bersaglio generalmente funzionano nel pesce zebra. Abbiamo anche scoperto che gli anticorpi che sono dimostrati per funzionare sia negli uccelli e/o negli anfibi che oltre ai mammiferi generalmente funzionano anche nel pesce zebra, anche quando l'efficacia nel pesce zebra non è stata testata. Tipicamente, gli anticorpi policlonali sviluppati contro un antigene di mammiferi hanno maggiori probabilità di rilevare gli omologhi dei pesci zebra rispetto agli anticorpi monoclonali a causa della loro minore specificità. Ogni volta che si testa un nuovo anticorpo, è utile eseguire un esperimento di controllo positivo utilizzando un peptide bersaglio cross-linked, tessuto mammifero o cellule che sono noti per esprimere la proteina, o cellule che esprimono un costrutto reporter. Gli anticorpi possono anche essere testati da macchie occidentali per verificare la dimensione dell'antigene bersaglio.\nMentre la maggior parte degli anticorpi commerciali fornisce un intervallo di diluizione suggerito per l'IHC, è importante determinare empiricamente la diluizione che funziona meglio. Le concentrazioni di anticorpi troppo alte spesso si traducono in una colorazione non specifica e in un aumento dello sfondo, mentre un anticorpo troppo poco non riesce a fornire un segnale distinguibile. A seconda dell'anticorpo e dell'antigene, può essere vantaggioso permeteoprima gli embrioni come descritto al punto 3.2 precedente, tuttavia, questo passaggio potrebbe non essere necessario e in alcuni casi può comportare una riduzione del segnale. Questo protocollo utilizza Triton-X-100 come detergente che permeabilizza le cellule, che possono essere sufficienti per tessuto sottile o espressione superficiale. Tessuti profondi o spessi, come regioni cerebrali profonde o larve più vecchie, possono richiedere la permeabilizzazione della proteinasi. Al contrario, Triton-X-100 dovrebbe essere escluso da tutti i passaggi quando l'immunostaining solo le proteine sulla superficie cellulare è desiderato rispetto all'etichettatura delle proteine intracellulari. La durata della fase di blocco e la scelta di una soluzione di blocco commerciale rispetto all'utilizzo del siero e BSA possono anche essere regolati per correggere la sensibilità degli anticorpi e la colorazione di fondo. Alte concentrazioni di siero utilizzato nel blocco (10% in questo protocollo) possono ridurre la colorazione di fondo, anche se dovrebbero essere diluite quando l'anticorpo è presente per ridurre al minimo i siti di legame anticorpo mascherante. Le soluzioni di blocco basate su piante possono essere utili se il segnale di fondo è costantemente elevato, anche con diluizioni anticorpali basse (<1:1,000). Infine, la sensibilità può essere messa a punto dalla severità dei lavamenti. Potrebbe essere necessario aumentare o diminuire la durata dei passaggi di lavaggio post-anticorpo e regolare la quantità di Triton-X-100 nel PBTriton. Le tipiche gamme di lavoro di PBTriton vanno da 0,2% a 1,0% Triton-X-100. È buona norma quando si utilizza un nuovo anticorpo per macchiare gli embrioni di controllo negativo con IgG primario ed etichettati anticorpi secondari per determinare la specificità degli anticorpi e identificare potenziali falsi segnali positivi.\nSe l'ottimizzazione dell'anticorpo non riesce a produrre un segnale positivo, potrebbe essere dovuto alla maschera fissativa dell'antigene. Generalmente, la fissazione nel 4% PFA non maschera i siti di antigeni per prevenire il legame degli anticorpi, anche se il mascheramento dell'antigene si verifica occasionalmente con alcuni anticorpi. Il recupero dell'antigene può causare danni all'embrione, ma un protocollo di lavoro è stato descritto da Inoue e Wittbrodt31. In alternativa, se l'anticorpo selezionato è incompatibile con il 4% di PFA o se la PFA provoca cambiamenti di morfologia cellulare, metanolo, 2% acido tricloroacetico o glioaxal può essere utilizzato per fissare i campioni27. La compatibilità di un anticorpo con fissazione della formaldeide deve essere determinata empiricamente. Se non è possibile ottenere un segnale di controllo positivo in base alla fissazione PFA, potrebbe valere la pena provare un fissativo alternativo come il metanolo. I protocolli di fissaggio alternativi possono essere necessari anche per gli anticorpi primari che sono stati sollevati contro gli antigeni coniugati (come GABA-BSA).\nCi sono diverse opzioni efficaci per il montaggio di embrioni di pesce zebra immunostained per l'imaging. Gli embrioni possono essere trasferiti in una parabola Petri di glicerolo, posizionati con perni o pinze, e immagine sia con una vista widefield dall'alto o dal basso di imaging attraverso il piatto con un microscopio invertito (Figura 3A). Questo metodo è semplice, rapido e temporaneo. I ritiri includono la propensione degli embrioni a srotolarsi fuori fuoco nel glicerolo liquido, potenziali riflessi dalla superficie del glicerolo nel piatto e la difficoltà di imaging attraverso il piatto spesso. Gli embrioni possono essere montati piatti su lati di vetro (Figura 3B) con mezzo di montaggio, coverlips e smalto. Questi supporti possono essere visualizzati in un microscopio verticale o invertito. Gli embrioni preparati in questo modo possono essere preparati in anticipo e i vetrini conservati a 4 gradi centigradi fino all'imaging o possono essere conservati e riimmaginati in un secondo momento. Questo può essere particolarmente vantaggioso quando il tempo di imaging è limitato. Gli svantaggi di questo aumento includono le opzioni limitate per la posizione e lo spessore del tessuto dell'embrione e l'incapacità di riposizionare o recuperare gli embrioni. Gli embrioni montati in questo modo spesso hanno bisogno di deyolking, come i granuli tuorlo sono autofluorescenti nei canali di fluorescenza più comunemente utilizzati e non possono essere spostati o rimossi dopo il montaggio. Quando la regione di interesse richiede un difficile posizionamento dell'embrione, può essere più vantaggioso montare gli embrioni in 1% agarose su un vetro di copertura (Figura 3C). L'embrione può essere tenuto in posizione con perni di insetti con la regione di interesse più vicina al vetro di copertura fino a quando l'agarose si raffredda. L'agarose terrà l'embrione in posizione senza che l'embrione rotolrà per almeno diversi minuti. Il montaggio di Agarose è ideale per i microscopi invertiti, anche se il vetro di copertura può essere invertito con attenzione per l'uso su un microscopio verticale. Questo aumento può richiedere molto tempo e gli embrioni non sono generalmente riposizionabili o recuperabili. Il montaggio di embrioni su vetrini collegati (Figura 3D) offre un po ' di un compromesso tra questi metodi. Il supporto ponte è veloce e gli embrioni possono essere riposizionati e recuperati. L'altezza del ponte può consentire una maggiore flessibilità nello spessore del tessuto e nella posizione dell'embrione rispetto ai supporti piatti, pur mantenendo la capacità di immagine dall'alto o dal basso. Questo metodo richiede la preparazione anticipata delle diapositive con bridge. Lo spessore del tessuto da montare determina il numero di coverlips alto il ponte deve essere. I vetrini a ponte possono essere riutilizzati più volte per un giorno, ma devono essere smaltiti dopo la sessione di imaging perché il glicerolo è difficile da pulire i vetrini e lentamente sloggia la colla tenendo premuto il ponte.\nIHC è un metodo efficace per determinare la tempistica e il modello di espressione proteica in un organismo o tessuto. IHC ha diversi vantaggi rispetto a ISH in quanto è relativamente basso costo e può essere completato in una frazione del tempo tipicamente necessario per ISH (2-3 giorni contro 5-8 giorni). Inoltre, l'IHC è un indicatore migliore dell'espressione del prodotto genico in quanto il rilevamento dei livelli di mRNA non prevede processi post-trancrionali e post-traduzionali che possono influenzare l'espressione proteica. IHC è anche in grado di fornire dati di localizzazione subcellulare (anche se questo non è vero quando si utilizza la colorazione DAB), che non è offerto da ISH. È possibile eseguire un doppio ISH/IHC nel pesce zebra.\nIHC ha anche alcuni inconvenienti, soprattutto tra cui la disponibilità di anticorpi. Mentre ci sono numerosi anticorpi disponibili che sono di qualità adeguata per IHC, trovare anticorpi che funzionano specificamente nel pesce zebra è più impegnativo e spesso richiede test e risoluzione degli anticorpi generati contro gli antigeni dei mammiferi. Tuttavia, ci sono un numero crescente di anticorpi convalidati da pesci zebra sul mercato e l'emergere della tecnologia CRISPR/Cas9 ha reso possibile l'epitopo tag delle proteine endogene attraverso l'ingegneria genomica. Questi processi sono tuttavia dispendiosi in termini di tempo e impegnativi e richiedono la convalida della funzione proteica.\nIl protocollo descritto nella presente relazione può essere utilizzato ampiamente su embrioni di pesce zebra e larve in qualsiasi fase e può essere applicato anche ai tessuti di animali adulti. Inoltre, questo protocollo consente anche di colorare campioni congelati o sezionato in paraffina con poca modifica. L'immunohistochimica a monte intero è stata utilizzata per esaminare le popolazioni di recettori del neurotrasmettitore nel muscolo, rivelando l'espressione del recettore ionotropico del glutammato NMDA sottounità 1 nello sviluppo del muscolo del pesce zebra. Questa colorazione piuttosto diffusa e diffusa attraverso il muscolo in via di sviluppo è coerente con l'espressione dello sviluppo della stessa sottounità recettore nello sviluppo di larve Xenopus21. Ciò suggerisce che l'espressione dei recettori del glutammato nello sviluppo muscolare è conservata evolutivamente. Complessivamente, questo protocollo è prezioso per ottenere una migliore comprensione dell'espressione genica attraverso l'uso di IHC e fornisce un potente strumento per determinare la distribuzione spatio-temporale dell'espressione proteica nel pesce zebra.\nGli autori non hanno informazioni da divulgare.\nFinanziamenti della sovvenzione NIH 8P20GM103436 14.


Liegi-Bastogne-Liegi 2019, dominio di Fuglsang. Secondo Formolo\nHome > Ciclismo > Liegi-Bastogne-Liegi 2019, dominio di Fuglsang. Secondo Formolo\nHa cercato costantemente la vittoria all’Amstel Gold Race e alla Freccia Vallone, l’ha trovata nella più importante prova del trittico delle Ardenne: Jakub Fuglsang (Astana) vince meritatamente la Liegi-Bastogne-Liegi 2019 con un assolo cominciato sulla Roche aux Faucons e completato a braccia alzate sulla linea del traguardo. Secondo posto per un grande Davide Formolo (Bora Hansgrohe), ultimo ad arrendersi allo strapotere del danese.\nLa 105^ edizione della Doyenne si corre sotto la pioggia battente: il meteo non aiuta i corridori e costituisce un ulteriore ostacolo da superare lungo i 257 km caratterizzati da undici cotes e da un finale ridisegnato che non avrà più protagonista la collina di Ans, bensì la stessa città di Liegi.\nChe non sia una giornata facile lo dimostra il fatto che, dietro ai sette corridori facenti parte della fuga iniziale partita dopo pochi chilometri – Julien Bernard (Trek-Segafredo), Tobias Ludvigsson (Groupama-FDJ), Andrea Pasqualon (Wanty-Gobert), Jérémy Maison (Arkéa-Samsic), Kevin Deltombe (Sport Vlaanderen Baloise) e Mathijs Paaschens (Wallonie Bruxelles) – non mancano i ritiri eccellenti, a partire da Daniel Martin (UAE Team Emirates) fino al protagonista indiscusso dell’ultimo decennio, vale a dire il campione del mondo in carica Alejandro Valverde (Movistar).\nRipresi i battistrada quando all’arrivo mancano ancora settanta chilometri, ci provano una serie di altri atleti a fuoriuscire dal gruppo: si tratta di Michal Albasini (Mitchelton Scott), David De La Cruz (Team Sky), Winner Anacona e Carlos Verona (Movistar), Bjorn Lambrecht (Lotto Soudal), Alessandro De Marchi (CCC), Damiano Caruso (Bahrain Merida), Benoit Cosnefroy (Ag2R La Mondiale), Tanel Kangert (EF Drapac) e Omar Fraile (Astana).\nLa composizione è davvero interessante, ma di questi è il solo estone a tener duro sulla Redoute e proseguire in testa fino alla Cote des Fonges, quando viene raggiunto da Tim Wellens (Lotto Soudal), Daryl Impey (Mitchelton Scott) e Patrick Konrad (Bora Hansgrohe). Giunti sull’ultima asperità, la Roche au Faucons, il gruppo esplode grazie a Jakub Fuglsang (Astana), che accelera e a resistergli sono i soli Davide Formolo (Bora Hansgrohe) e Michael Woods (EF Drapac).\nIn seguito perdono contatto prima il canadese, poi l’italiano, così il danese continua il suo forcing verso il traguardo e transita ai meno dieci con un vantaggio di venti secondi sul veneto e 35″ su un altro quartetto comprendente anche Vincenzo Nibali (Bahrain Merida). Ma stavolta nessuno può fermare l’uomo solo al comando: aveva dimostrato di essere il più in forma nel corso dell’ultima settimana, ma non aveva raccolto quanto avrebbe meritato, ora Jakub Fuglsang può finalmente festeggiare la conquista di una Classica-Monumento, ultimo atto della Campagna del Nord.\nOttima la seconda piazza di Formolo, che chiude a 27″, mentre a completare il podio c’è un compagno di squadra di quest’ultimo, Maximilian Schachmann, primo nella volata dei battuti tra cui figura anche Nibali, ottavo. A mani vuote Julian Alaphilippe (Deceuninck Quick Step), giunto ancora più indietro.\n2 FORMOLO Davide BORA – hansgrohe 400 200 0:27\n3 SCHACHMANN Maximilian BORA – hansgrohe 325 150 0:57\n6 GAUDU David Groupama – FDJ 175 90 ,,\nFuglsang Liegi-Bastogne-Liegi\t2019-04-28\nPrecedente: Giro dell’Appennino 2019, è show Androni: Cattaneo vince davanti a Masnada\nSuccessivo: Berrettini vince a Budapest, è best ranking: continua il gran momento del tennis azzurro


In questo senso egli afferma che " voglio accennare a Paolo Sylos Labini come grande economista. Per dire due cose soltanto. La prima è che almeno su tre fronti, quello della teoria delle forme di mercato, della teoria dell'occupazione, della teoria del sottosviluppo, avrebbe ben meritato il premio Nobel. La seconda cosa [...] riguarda il tema del confronto tra economia classica ed economia neo classica [...] la spiegazione mi pare traspaia dalle pagine di Sylos Labini, come da quelle del suo grande amico Federico Caffè. E' la funzione ideologica. Spiegare che non c'è proprio niente da fare politicamente, che il mercato bisogna lasciarlo in pace, mama knows best, è il meglio per chi già se la passa bene".\nDa queste parole introduttive si può comprendere la "Sapienza" dell'economista e dell'uomo. Saper vedere la realtà con lo sguardo e l'impegno civile di chi conosce come va il mondo e come potrebbe andare. Una mission possiamo ben dirlo al servizio del Paese, di questo nostro Paese! "con la sua illegalità onnivora, con la sua proliferazione di furbi, furboni e furbetti". E quest'ultimi, malgrado il diminuitivo, spesso più pericolosi!\nOsserva acutamente Giacomo Becattini a proposito di Sylos " A parte il coraggio delle proprie idee, anche quando impopolari, io ammiro soprattutto la capacità di Sylos di cogliere quei segnali sulle frontiere della sua disciplina. Questo è per me il suo principale insegnamento: rispettare e adoperare quando è il caso, la buona, sana, teoria economica, ma non disdegnare segnali che vengano da altre discipline, ne quelli che vengano dal nudo buon senso. Ciò denota uno stile di pensiero a 360 gradi, che differenzia nettamente Sylos dal mero tecnico dell'economia, rinchiuso nella griglia di statistiche economiche, costruite sempre su teorie economiche del passato"\nInsomma, Sylos Labini ha sempre avuto una visione "giovane" moderna anche quando le sue primavere aumentavano, denunciando il deficit strutturale del “pensiero dominante” attraverso i suoi studi che costituiscono ancora oggi un valore aggiunto, un servizio per il Paese.\nMeriterebbe tale punto un maggiore approfondimento sulle principali vulcaniche innovazioni di economista politico con i capisaldi di libertà e giustizia, anche nel più ampio concetto di mercato, con gli occhi puntati sulla nobiltà della ricerca e, su questo, come non pensare al sodalizio con Nino Andreatta per la battaglia di una scuola degna delle più altre tradizioni italiane.\nCon l'idea di fondo, come è stato giustamente osservato, che il fine dello sviluppo economico non sia la semplice soddisfazione dei bisogni umani, bensì lo sviluppo civile, secondo la lezione fondamentale di Adam Smith e dunque ragionare non in termini di causa effetto ma di interazione.\nLo stesso Sylos lucidamente affermava che “è la legge che crea gli argini tra i quali scorre l’acqua dell’economia; senza quegli argini, l’acqua diventa palude o da luogo a inondazioni.”\nPer lui lo sviluppo civile influisce positivamente sullo sviluppo economico attraverso tre canali: le istituzioni, la cultura e la morale.\nVa da se che il mercato rappresenta proprio il teatro fondamentale in cui quegli argini “isttituzionali” che debbono essere ben definiti per avere regole ben congegnate evitando esondamenti che danneggiano i più e favoriscono i pochi, perché quando piove, sui poveri piovono pietre dice un proverbio inglese.\nC’è dunque una interazione necessaria tra sviluppo civile e cultura rappresentata in primo luogo dall’istruzione e dalla formazione distinta in due macroaree: umanistica e scientifica. Quest’ultima incide specificatamente sullo sviluppo economico e laddove vi è carenza di istruzione vi è conseguentemente una povertà dalla quale è difficile uscire.\nLa corruzione a tutti i livelli principale piaga della morale frena lo sviluppo economico e impedisce la necessaria convergenza fra sviluppo economico e sviluppo civile. Ne sappiamo qualcosa e dal 2005, anno in cui Sylol ci ha lasciato, ne abbiamo viste di mani poco pulite!\nChissà cosa direbbe Sylos Labini in questi tempi di divario sociale. Lui che ha studiato molto da vicino le vicende delle classi sociali puntando ( rimanendo spesso inascoltato ma non per questo meno tenace) a rimuovere la diseguaglianza nella distribuzione del reddito.\nIn tempi di spread e di speculazioni da ogni dove, Sylos avrebbe certamente invocato la creazione di argini.\nArgini che sono stati abbondantemente superati da scelte inconsulte, da anni di inerzia e di perenne “carnevale” della politica che ha perso la faccia e ha messo una maschera facendo sprofondare il Paese nella palude della vergogna e della frattura sociale.\nCon il risulato che oggi la maggioranza è più povera così come aveva previsto anche il caro Berselli nelle ultime e profetiche righe del postumo “L’Economia Giusta”.\nEcco, allora che il concetto di giustizia sociale torna a campeggiare quando si pensa a uomini concreti e responsabili come Sylos Labini. Con il senso delle istituzioni, con la generosità di “condividere” la cultura con i giovani senza mai risparmiarsi. Mettendo al centro la morale, l’etica assolutamente connessa con l’economia. Per tutto questo, parafrasando Adam Smith, Paolo Sylos Labini è stato non solo un economista giusto ma una vera Ricchezza della Nazione.


Idrocefalo normoteso - Mente e cervello - Esperto risponde - Dica33\nDomanda di: Mente e cervello06/10/2005 18:07:09Idrocefalo normotesoBuona sera sono tre anni che mia madre è affetta da questa malattia ma solo dopo numerose tac e interventi ne siamo venuti a conoscenza!!! A maggio le è stata installata una valvola cranica ma purtroppo le sue condizioni peggiorano giorno dopo giorno ormai non cammina più e sta anche perdendo l'uso delle mani. Si può fare altro? Vi prego di rispondermi. Grazie Sei un medico e vuoi dare una risposta? Clicca qui Risposte:\nCome sempre bisogna avere un quadro completo della situazione per esprimere opinini o giudizi. Lei parla di pregressi interventi! ma di che tipo? per l'idrocefalo? come era lo stato clinico di sua madre prima degli o dell'intervento di derivazione ventricolo-peritoneale (credo)? Era giusta la diagnosi di idrocefalo normoteso dell'adulto? Se l'intervento effettuato a maggio non ha prodotto miglioramento è stata valutata la eventualità di cambiare il tipo di valvola? Ci dia più ragguagli e forse Le potremo essere più di aiuto. Cordailità ed auguri per Sua madre Dott. Giovanni Migliaccio Medico Ospedaliero Specialista in Neurochirurgia MILANO (MI) Risposta del10/10/2005\nConsiglierei di sentire un altro parere, soprattutto se i medici che la stanno attualmente seguendo sono al corrente del peggioramento ed hanno detto che non si può fare altro. Prof. Milena De Marinis Universitario Specialista in Neurologia ROMA (RM) Altre risposte di Mente e cervelloPsicofarmaci e problemi cardiaciDepressione con attacchi di bulimiaMania di persecuzione???Attacchi di panicoAnsia....Demenza senile Ansia e insonniaSovradosaggio volontario rivotrilCambio terapia con elopram Atrofia celebrale con depressione maggioreStressAttacchi di ansia e panicoDepressione o disturbo passeggero?Forte ansia ad ogni risveglio mattutinoDurata del rapporto sessuale, paroxetina (interazioni iperico)Sbalzi di umore, pianti improvvisiAnsia depressioneConseguenze ansiaDepressione e attacchi di panicoRisposta clinica al parmodalinClozapinaLa mirtazapina dopo rimozione tiroideInterazione tra farmaciVorrei smetere sertralinaSemplice ansia o depressione?Psicosi NAS e pensione invaliditàLaroxyl - come smettere gradualmenteAnsiaPsicofarmaci ed alcolAttacco epiletticoAlcohol e ansiolitici (EN)Depressione, ansia e pensieri ossessiviDepressione o ansia?Ansia e tachicardia Cura depakinAnalisi del sangue (Carbamazepina, emocromo + formula, gamma Gt...)Depressione Malattia del gioco macchinetteAnsia depressivaEccessiva magrezza e depressione © RIPRODUZIONE RISERVATA


Casali del Manco, dopo 47 giorni si negativizza la bimba di 7 mesi ricoverata al Bambin Gesù - Il Quotidiano del Sud\nLa piccola è ancora nell’ospedale romano ma non si trova più nel reparto Covid. I primi segnali di miglioramento nei giorni scorsi quando era stata estubata\nL'ospedale pediatrico Bambin Gesù di Roma\nroma, Casali del Manco, bambin gesù\nCASALI DEL MANCO (CS) – È stata almeno per un momento la figlia di tutti i presilani la bimba di sette mesi, originaria di Casali del Manco, risultata positiva al covid e ricoverata d’urgenza, per complicanze legate alla sintomatologia, al Bambino Gesù di Roma lo scorso 18 dicembre.\nDopo 47 giorni la piccola si è negativizzata e non si trova più nel reparto Covid dell’ospedale pediatrico della Capitale, come ha confermato lo stesso papà contattato telefonicamente.\nI primi segnali di miglioramento sono arrivati nei giorni scorsi quando dal Bambino Gesù hanno comunicato che la piccola era stata estubata, sebbene la stessa avesse ancora necessità di un supporto di ossigeno attraverso l’ausilio di un casco.\nUna guerriera, così l’ha definita nonna Mariella in uno stato pubblicato sui social in cui la donna, augurandosi che la piccola – seguita ancora dai medici in un altro reparto di pediatria del Bambino Gesù – possa tornare presto a casa, ha ringraziato tutti coloro che hanno supportato la famiglia nei giorni più bui. E difatti la bimba sembra voler lottare con tutte le sue forze per lasciare trionfare la vita. Ora tutti i residenti di Casali del Manco attendono a braccia aperte il ritorno della piccola. Da parte nostra i migliori auguri.


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