Ενοικιαζόμενα για διακοπές σε Κάστρο του Enniskillen, Enniskillen: κλείστε Οικίες & άλλα | Vrbo\nΚάστρο του Enniskillen\nΚάστρο του Enniskillen: Βρείτε τις καλύτερες επιλογές τουριστική κατοικίας για τις διακοπές σας.\nErne View Apartments 1C - Διαμέρισμα Lakeside Enniskillen Ιρλανδία\nΗ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΕΛΛΗΝΙΚΑ ΕΛΛΑΔΑ\n2 μονά κρεβάτι με δυνατότητα προετοιμασίας γευμάτων\nΠολυτελές ισόγειο διαμέρισμα τριών υπνοδωματίων στην πόλη Enniskillen.\nΤο Garden House Αγροτουριστικό κατάλυμα Βόρεια Ιρλανδία Toursim 3 Αστέρων\nΚομψό και κομψό σπίτι, βολική τοποθεσία για να εξερευνήσετε το Fermanagh Lakelands\nΚάστρο του Enniskillen, Enniskillen: Πού να μείνετε;\nΚάστρο του Enniskillen: Στις καταχωρίσεις των καταλυμάτων μας για το 2020, θα βρείτε 33 διαφορετικά εξοχικά σπίτια. Από 16 Οικίες έως 9 Διαμερίσματα, επιλέξτε το ιδανικό κατάλυμα για τις διακοπές σας ή για ένα σαββατοκύριακο. Με τη Vrbo θα νιώθετε όπως στο σπίτι σας.\nΜπορώ να νοικιάσω Οικίες σε Κάστρο του Enniskillen;\nΝαι, φυσικά. Η Vrbo Ελλάδα προσφέρει 16 Οικίες σε Κάστρο του Enniskillen. Άλλοι δημοφιλείς τύποι ενοικιαζόμενων καταλυμάτων σε Κάστρο του Enniskillen περιλαμβάνουν:\nΜπορώ να βρω κατάλυμα διακοπών σε αυτόν τον προορισμό (Κάστρο του Enniskillen) με την επιλογή: ίντερνετ/wifi;\nΝαι, μπορείτε να διαλέξετε το κατάλυμα διακοπών που προτιμάτε με αυτήν την επιλογή (ίντερνετ/wifi) ανάμεσα στα 24 τουριστικά καταλύματά μας σε Κάστρο του Enniskillen. Χρησιμοποιήστε τη μπάρα αναζήτησής μας για να αποκτήσετε πρόσβαση στα διαθέσιμα self catering καταλύματα.\nΜπορώ να κλείσω ένα κατάλυμα για διακοπές απευθείας online ή αμέσως κοντά σε Κάστρο του Enniskillen;\nΝαι, η Vrbo Ελλάδα προσφέρει μια επιλογή 33 διαθέσιμων τουριστικών καταλυμάτων για απευθείας κράτηση online και 18 για άμεση κράτηση κοντά σε Κάστρο του Enniskillen. Μην περιμένετε, ρίξτε μια ματιά στα self-catering καταλύματά μας μέσω της μπάρας αναζήτησής μας και ετοιμαστείτε για το επόμενό σας ταξίδι σε Κάστρο του Enniskillen!


Αποτελέσματα για “Βάσω”\nΑποτελέσματα αναζήτησης για : Βάσω\nΠόσες φορές είδες ανθρώπους να περνούν από μπροστά σου και χωρίς να έχεις ανταλλάξει ούτε μια κουβέντα μαζί τους, χωρίς να τους ξέρεις καλά-καλά, να τους αντιπαθείς. Να σου βγάζουν κάτι αρνητικό, κάτι που σε απωθεί ή και το αντίθετο βέβαια. Πες το διαίσθηση ή όπως αλλιώς θέλεις, […]\nRead More Πρώτη αίσθηση και παντοτινή. @haveatea.gr\nΣηματοδότες ζωής. @haveatea.gr\nΑν δεν τα κάνεις όλα στην άκρη και δεν δεθείς με τον άλλον τόσο, που να νιώθεις κάθε στιγμή πως κάτι θα γίνει και θα σπάσεις. Θα θρυμματιστεί το είναι σου, το μέσα σου, κάτι θα γίνει κι όλο αυτό θα χαλάσει. -Δεν μπορείς να με καταλάβεις […]\nRead More Σηματοδότες ζωής. @haveatea.gr\nΑνάμεσα στους πολλούς..ο ένας. @haveatea.gr\nΈνα βλέμμα φτάνει και περισσεύει για προσέξεις λίγο παραπάνω έναν άνθρωπο. Είναι εκείνοι που θα σου τραβήξουν το ενδιαφέρον. Αυτό έπαθα κι εγώ μαζί σου. Σε είχα ξανά δει κι άλλες φορές και κάπου εκεί κόλλησα. Σκέφτηκα γιατί τώρα, γιατί μου έκατσες έτσι στο μυαλό και όχι νωρίτερα. […]\nRead More Ανάμεσα στους πολλούς..ο ένας. @haveatea.gr\n2019 με λίγη καρδιά παραπάνω. @haveatea.gr\nΜπήκε το 2019 μέσα σε γιορτινούς ήχους και ατελείωτες ευχές για καλή χρόνια. Υγεία, αγάπη, ειρήνη, τύχη, ευημερία και ένα σωρό άλλες παρόμοιες ευχές ήταν εκείνες, που όλοι μας πιστεύω μηδενίσαμε τα προσωπικά μας κοντέρ και η αισιοδοξία πλημμύρισε και πάλι τις σκέψεις και τα πεπραγμένα μας. Μέσα […]\nRead More 2019 με λίγη καρδιά παραπάνω. @haveatea.gr\nΈφτιαξα ένα ζεστό και κάθισα λίγο να σε περιμένω. Αυτές οι κρύες μέρες των Χριστουγέννων με κάνουν να αναδιπλώνομαι μέσα μου και να φτάνω πάλι σε εσένα. Περιμένω να ‘ρθεις. Αν κάπως με ακούς ξέρω ότι θα το κάνεις. Έχω αφήσει κενή τη θέση στο καναπέ απέναντί μου […]\nRead More Τέτοιες μέρες σε χρειάζομαι. #blogmas @haveatea.gr


Πώς μπορώ να μετατρέψω το λογότυπο της Apple σε ένα επιπλέον κουμπί iPhone; - SmartMe\nΑναρωτιέστε πώς να μετατρέψετε το λογότυπο της Apple σε ένα επιπλέον κουμπί στο iPhone σας; Είναι πολύ εύκολο! Εάν χρησιμοποιείτε αυτό το smartphone και έχετε εγκαταστήσει λογισμικό iOS, τότε έχουμε καλά νέα για εσάς. Μπορείτε να αντικαταστήσετε το λογότυπο της Apple στο πίσω πλαίσιο του περιβλήματος με ένα εικονικό κουμπί δωρεάν.\nΠώς μπορώ να μετατρέψω το λογότυπο της Apple σε νέο κουμπί iPhone;\nΣτο iOS 14, η Apple αποφάσισε να εισαγάγει μια λειτουργία που ονομάζεται Back Tap, η οποία στην πολωνική έκδοση του λογισμικού είναι ακριβώς "Back tap". Μπορεί να χρησιμοποιηθεί από κατόχους iPhone 8 και νεότερων smartphone.\nΜε διπλό ή τριπλό πάτημα, μπορούμε να εκτελέσουμε λειτουργίες όπως Συντομεύσεις προσβασιμότητας για γρήγορη πρόσβαση σε συντομεύσεις Siri, Magnifier, VoiceOver ή AssitiveTouch.\nΓια να ενεργοποιήσετε τη λειτουργία, απλώς μεταβείτε στις Ρυθμίσεις -> Προσβασιμότητα -> Αγγίξτε και, στη συνέχεια, επιλέξτε την επιλογή Πίσω βρύση και, στη συνέχεια, επιλέξτε την επιλογή Διπλό ή τριπλό πάτημα και επιλέξτε μια συγκεκριμένη ενέργεια. Μετά από αυτό, το μόνο που έχετε να κάνετε είναι να πατήσετε στο πίσω μέρος του τηλεφώνου για να ξεκινήσετε την προηγούμενη δραστηριότητα. Είναι απλό, έτσι δεν είναι;


Linen Tree Skirt Diameter 105cm Christmas Decorations High Grade Linen Tree Skirt Christmas Tree Aprons Holiday Decoration Household Christmas Tree Skirt Three Dimensional Apron Christmas Decorations Description – impretty.info\nlinen tree skirt diameter 105cm christmas decorations high grade linen tree skirt christmas tree aprons holiday decoration household christmas tree skirt three dimensional apron christmas decorations description.\nheavy linen tree skirt,linen christmas tree skirt,silver and white christmas tree skirt,white linen christmas tree skirt,red and white christmas tree skirt,grey linen tree skirt 21,vintage linen tree skirt angels ornaments,natural linen tree skirt,white christmas tree skirt that looks like snow,linen pop up tree skirt,linen christmas tree skirt initial.\nPosted on 09/17/2019 09:15:46 am Full size linen-tree-skirt-diameter-105cm-christmas-decorations-high-grade-linen-tree-skirt-christmas-tree-aprons-holiday-decoration-household-christmas-tree-skirt-three-dimensional-apron-christmas.jpg


Κυριακή, 16 Ιούνιος 2019 08:21\tΕυρυτανικά Νέα\nΜε αφορμή τη συμπλήρωση 40 χρόνων από την ίδρυση της Ιεράς Μητρόπολης Καρπενησίου, λαμβάνουν χώρα εκδηλώσεις προς τιμή ιερέων που διακόνησαν και προσέφεραν, το δεύτερο μισό του 20ου αιώνα, στον νομό Ευρυτανία.\nΈτσι, εκδήλωση για την προσφορά των μακαριστών ιερέων Δημήτριου Καραπάνου και Νικόλαου Αζακά, που διακόνησαν επί πολλές δεκαετίες στο Μικρό Χωριό, διοργάνωσε το περασμένο Σάββατο, 8 Ιουνίου 2019, η Μητρόπολη Καρπενησίου.\nΗ εκδήλωση πραγματοποιήθηκε στο Μουσείο του Παλιού Μικρού Χωριού και προηγήθηκε Εσπερινός, προεξάρχοντος του Μητροπολίτη Καρπενησίου κ. Γεωργίου, στην εκκλησία της Μεταμόρφωσης του Σωτήρος. Το παρών έδωσαν, μεταξύ άλλων, ο βουλευτής Ευρυτανίας κ. Κώστας Κοντογεώργος, ο αντιπεριφερειάρχης Ευρυτανίας κ. Αριστείδης Τασιός και ο δήμαρχος Καρπενησίου κ. Νίκος Σουλιώτης.\nΟ μακαριστός ιερέας Δημήτρης Καραπάνος υπηρέτησε στο Μικρό Χωριό από το Πάσχα του 1960 ως τις 4 Αυγούστου 1981 οπότε και εκοιμήθη. Ο μακαριστός ιερέας Νίκος Αζακάς υπηρέτησε στο Μικρό Χωριό από τις 7 Ιουλίου 1983 ως την κοίμησή του στις 28 Αυγούστου 2018.\nΑντίστοιχα, σύμφωνα με όσα ανακοίνωσε η Μητρόπολη, την Κυριακή 9 Ιουνίου το απόγευμα, ανάλογη εκδήλωση πραγματοποιήθηκε προς τιμήν του μακαριστού π. Κωνσταντίνου Μπακογιάννη στα Βελωτά Ευρυτανίας, ενώ τη Δευτέρα 10 Ιουνίου το απόγευμα, έγινε αφιέρωμα προς τιμήν του μακαριστού π. Θεοφάνους Τσιαμπόκαλου, στο Βουτύρο Ευρυτανίας.\n(Η πρώτη φωτογραφία είναι του Κώστα Καλαμίδα, η δεύτερη του Βαγγέλη Πλάκα)


Ντοκουμέντο: Τρεις Ήρωες εξιστορούν την Μάχη της ΕΛΔΥΚ τον Αύγουστο του 74 και…Αναρωτιούνται!(Φωτο- Ντοκουμέντο | Greek National Pride\nΜόνο οι Καταδρομείς μας ήταν ο τρόμος και φόβος των Τούρκων …\nΡώτησα τους Ήρωες αν ξαναπήγαν στην Κύπρο από τότε, ο Λοχίας Καρατάσος (φώτο)απάντησε ότι πήγαν δύο φορές το 1999 και το 2016 πήγα να δω τους τάφους ,πήγα και είδα το μέρος που είχα στήσει το αντίσκηνο κάτω από την Ελιά και πολεμούσα επί τρεις ημέρες με το Πολυβόλο !\nPrevious post ← ΜΑΣ ΕΙΧΑΝ ΠΡΟΕΙΔΟΠΟΙΗΣΕΙ ΓΙΑ ΤΟ ΠΥΡΗΝΙΚΟ ΠΡΟΓΡΑΜΜΑ ΤΗΣ ΤΟΥΡΚΙΑΣ\nNext post ΚΥΒΕΡΝΗΣΗ: ΔΕΝ ΘΑ ΕΠΙΤΡΕΨΟΥΜΕ ΚΑΜΙΑ ΑΜΦΙΣΒΗΤΗΣΗ ΔΙΕΘΝΩΝ ΣΥΝΘΗΚΩΝ ΚΑΙ ΣΥΝΟΡΩΝ →


Αγγλικό δημοσίευμα για Βέλλιο | Onsports.gr\nhome ΠοδόσφαιροSuper LeagueΑγγλικό δημοσίευμα για Βέλλιο Κοινοποιήστε\nΑγγλικό δημοσίευμα για Βέλλιο\tΣυντάκτης: Χαρίλαος Λάμπρου\nΤην συμφωνία ανάμεσα στον Ηρακλή, την Έβερτον και τον Απόστολο Βέλλιο επιβεβαιώνει και αγγλική ιστοσελίδα που ασχολείται αποκλειστικά με θέματα των «ζαχαρωτών» (followeverton.com).\tΣυγκεκριμένα, στο κείμενο αναφέρει ότι η Έβερτον απέκτησε τον ελπιδοφόρο επιθετικό, Απόστολο Βέλλιο, δαπανώντας ένα ποσό γύρω στις 250.000 λίρες (290.000 ευρώ περίπου). Πιο κάτω επισημαίνει πως τα «ζαχαρωτά» κέρδισαν τη μάχη από τις Φούλαμ, Μπολόνια, Ολυμπιακό και καταλήγει με την παρουσία του Βέλλιου στο ελληνικό πρωτάθλημα. Τονίζει ότι έχει 22 συμμετοχές στη Σούπερ Λίγκα, μετρώντας τέσσερα τέρματα, ενώ προσθέτει ότι έχει 14 εμφανίσεις με την Εθνική των Νέων, σκοράροντας επτά γκολ.\tΚατηγορία: Super League


sportsthea: Ο "καθρέφτης" του τελικού αγώνα Παλληξουριακός - Πυλαριακός για το τοπικό κυπέλλου\nΟ "καθρέφτης" του τελικού αγώνα Παλληξουριακός - Πυλαριακός για το τοπικό κυπέλλου\nΔιατήρησε το "στέμμα" του..... Κυπελλούχος και φέτος ο Παλληξουριακός\nΟλοκληρώθηκε σήμερα Τετάρτη απόγευμα, το τοπικού κυπέλλο με τη διεξαγωγή της τελευταίας συνάντησης στο Δ.Α.Κ. Αργοστολίου, ανάμεσα σε Παλληξουριακό-Πυλαριακό και τους Ληξουριώτες κυπελλούχους 2018 - 2019.\nΠηγαίνουν για το triple crown οι "Ερυθρόλευκοι"\nΔικό τους μετά το Super Cup και το κύπελλο... Πέτυχαν το 2Χ2 φέτος\nΟ Παλληξουριακός είναι ο φετινός κυπελλούχος στα νησιά μας, αφού πριν από λίγο στον τελικό του τοπικού κυπέλλου, που εγκαινίασε και το ανακατασκευασμένο γήπεδο Αργοστολίου, επικράτησε του Πυλαριακού με σκορ 6-0 και διατήρησε τον τίτλο του, κατακτώντας το παράλληλα για 2η συνεχόμενη χρονιά.\nΟι «ερυθρόλευκοι» της Παλλικής, παραμένουν αήττητοι φέτος στις τοπικές διοργανώσεις και θα συμμετάσχουν την επόμενη ποδοσφαιρική περίοδο στο αναβαθμισμένο κύπελλο Ελλάδος.\nΟ Πυλαριακός, μια κατηγορία πιο κάτω από τον μεγάλο του αντίπαλο, στάθηκε όσο μπορούσε καλύτερα και πάλεψε, όμως η ανωτερότητα των πρωτοπόρων του πρωταθλήματος Α' κατηγορίας, ήταν μεγάλη εξ' ου και το τελικό αποτέλεσμα.\nΣίγουρα αξίζουν πολλά συγχαρητήρια στην ομάδα της Πυλλάρου, αλλά και στον κόσμο της, που της συμπαραστάθηκε σε μεγάλο βαθμό.\nΣε λίγο αναλυτικό ρεπορτάζ και μεγάλα φωτορεπορτάζ από τον τελικό


Θέσεις του Δήμου Πλατανιά για θέματα λειτουργίας των δήμων - Flashnews.gr\nΘέσεις του Δήμου Πλατανιά για θέματα λειτουργίας των δήμων\nΟ Δήμαρχος Πλατανιά και Γραμματέας της ΠΕΔ Κρήτης κ. Μαλανδράκης Ιωάννης ενόψει του Συνεδρίου της ΚΕΔΕ στα Γιάννενα τις 29-30 Μαΐου 2013 και στα πλαίσια των συζητήσεων περί του Ελάχιστου κόστους λειτουργίας των Δήμων και του Νέου συστήματος κατανομής των Κεντρικών Αυτοτελών Πόρων με σχετικό έγγραφό του προς το Υπουργείο Εσωτερικών, την ΚΕΔΕ και την ΠΕΔ Κρήτης έθεσε τις παρακάτω θέσεις – προτάσεις του:\nΣε κάθε περίπτωση οι πόροι οι οποίοι δίνονται στην Αυτοδιοίκηση δεν είναι απλώς ελάχιστοι αλλά υπολείπονται κατά 1 δις, σύμφωνα με τη μελέτη της ΕΕΤΑΑ, από το ελάχιστο κόστος λειτουργίας τους.\nΌσο αφορά τα προτεινόμενα κριτήρια κατανομής και πιο συγκεκριμένα το κριτήριο της Έκτασης ενός Δήμου παρατίθεται η 1η Παρατήρηση:\nΔεν αρκεί μόνο: «η έκταση κάθε Δήμου προκύπτει αθροιστικά από τα οριστικά αποτελέσματα της κατανομής της έκτασης της χώρας κατά βασικές κατηγορίες χρήσης (στατιστική έρευνα χρήσεων γης 2004)», όπως αναφέρει η μελέτη της ΕΕΤΑΑ αλλά η έκταση της οδοποιίας που έχει τεράστιο κόστος συντήρησης.\nΗ 2η Παρατήρηση αφορά τη Δημοτική Αποκέντρωση, η οποία αποτελεί ουσιαστικό κριτήριο κατανομής\nΣτη μελέτη αναφέρεται ότι:\n- Δημοτικές ενότητες (αριθμός ανά Δήμο)\n- Δημοτικές / τοπικές κοινότητες (αριθμός ανά Δήμο)\nΤο πλέον αντιπροσωπευτικό μέγεθος, που επηρεάζει το ελάχιστο κόστος λειτουργίας θεωρείται ο αριθμός των δημοτικών / τοπικών κοινοτήτων στο οποίο άλλωστε ενσωματώνονται οι δημοτικές ενότητες »\nΆποψή μας είναι ότι πρέπει να ληφθεί υπόψη ο αριθμός των τοπικών κοινοτήτων και ειδικότερα των οικισμών\nΗ 3η Παρατήρηση αφορά τον αριθμό κ το κόστος του προσωπικού το οποίο επηρεάζει το κριτήριο κατανομής\nΕκτός από τις αμοιβές μισθοδοσίας μόνιμου και ΙΔΑΧ προσωπικού του Δήμου καθώς και τις Αμοιβές ειδικών συνεργατών και εξωτερικών συνεργατών (πολλοί δήμοι μη έχοντας προσωπικό καταφεύγουν σε παροχή υπηρεσιών για να καλύψουν λειτουργικά κενά π.χ. Ειδικότητες σε μηχανοργάνωση του Δήμου , πληροφορικής, τεχνικές ειδικότητες, κ.α) σοβαρά πρέπει να ληφθεί υπόψη και το κόστος από εξωτερικές υπηρεσίες για να λειτουργήσουν στοιχειωδώς.\nΗ 4η Παρατήρηση αφορά το κριτήριο σχετικά με την Προβληματικότητα\nΣτη μελέτη αναφέρεται ότι: «Θα καλυφθεί από τους νησιωτικούς και ορεινούς δήμους. Για τους τελευταίους υπάρχει πρόβλημα ορισμού, γιατί ο χαρακτήρας του «Καλλικράτη» καλύπτει ελάχιστους και θα πρέπει να αναζητηθούν συνδυασμένα στοιχεία από ΕΛ.ΣΤΑΤ. και Υπ. Αγροτικής Ανάπτυξης (επιδοτήσεις ορεινών και μειονεκτικών περιοχών)\nΠρέπει λοιπόν κατά τη γνώμη μας να υπάρξει επιχορήγηση σε ορεινές και μειονεκτικές περιοχές κ όχι αν ένας δήμος στο σύνολο του έχει χαρακτηριστεί ορεινός ή όχι.(μπορεί να γίνει με το χαρακτηρισμό ανά τοπική κοινότητα)\nΤρίτη, 28 Μαΐου 2013, 16:14


Ανεπιθύμητος στο Ισραήλ ο Γερμανός νομπελίστας Γκίντερ Γκρας. | NO RFID\nΑνεπιθύμητος στο Ισραήλ ο Γερμανός νομπελίστας Γκίντερ Γκρας.\nΑνεπιθύμητο πρόσωπο για το Ισραήλ είναι ο Γερμανός νομπελίστας-συγγραφέας, Γκίντερ Γκρας, μετά τη δημοσίευση ποιήματος στο οποίο χαρακτηρίζει τη χώρα ως «απειλή για την παγκόσμια ειρήνη και «πηγή ενός αναγνωρίσιμου κινδύνου».\nΟ Ισραηλινός υπουργός Εσωτερικών, Ελί Γισάι, σε δηλώσεις του υπογράμμισε ότι θα απαγορευτεί στον Γκρας να επισκεφθεί το Ισραήλ, λόγω της «προσπάθειάς του να υποδαυλίσει το μίσος κατά του ισραηλινού κράτους και του ισραηλινού λαού και έτσι να προωθήσει τις ιδέες που πρέσβευε όταν φορούσε τη στολή των SS». (Αυτήν την παραδοχή είχε κάνει ο Γκρας το 2006).\nΠρόσθεσε, δε, ότι «εάν ο Γκίντερ Γκρας θέλει να συνεχίσει να διαδίδει το στρεβλό έργο του, μπορεί να το κάνει στο Ιράν, όπου τον περιμένει ένα δεκτικό ακροατήριο».\nΤο ποίημα με τίτλο «Τι πρέπει να ειπωθεί» δημοσιεύθηκε την περασμένη εβδομάδα στην εφημερίδα «Sueddeutshe Zeitung».\nby norfid on 08/04/2012 • Μόνιμος σύνδεσμος\nPosted by norfid on 08/04/2012\nΚάρτα αποδείξεων : Χρησιμεύει στον έλεγχο των συνειδήσεων.


Μονώσεις Ταρατσών – Βασικές πληροφορίες - Chroma Decor\nΜονώσεις Ταρατσών – Βασικές πληροφορίες\nΒρίσκεστε εδώ:Αρχική / Μονώσεις / Μονώσεις Ταρατσών – Βασικές πληροφορίες\nΟι μονώσεις ταρατσών αποτελούν μια από τις βασικές υπηρεσίες της εταιρείας μας. Πρόκειται για μια απαραίτητη εργασία σε κάθε χώρο, αφού η ταράτσα είναι το μέρος το οποίο δέχεται όλες τις επιπτώσεις των καιρικών συνθηκών. Βροχή, χιόνι, ήλιος και υψηλές θερμοκρασίες είναι μόνο μερικές από αυτές που σταδιακά μπορεί να οδηγήσουν στην διάβρωση.\nΩστόσο πέραν των ανωτέρω, η ταράτσα αποτελεί και το βασικότερο σημείο ενεργειακής απώλειας. Ένεκα του ότι αποτελεί το υψηλότερο σημείο και μάλιστα συνήθως σε οριζόντια κλίση, συμβάλει στην απώλεια ζέστης τον χειμώνα και την είσοδο ζέστης το καλοκαίρι στο εσωτερικό.\nΕπιλέγοντας τις μονώσεις ταρατσών που σας προσφέρει η εταιρεία μας, μπορείτε να εξασφαλίσετε την μέγιστη προστασία του χώρου σας, να αυξήσετε την ενεργειακή του απόδοση και να εξοικονομήσετε χρήματα. Και όλα αυτά με μια σχετικά μικρή επένδυση. Για περισσότερες πληροφορίες ή για να προγραμματίσουμε ένα ραντεβού στον χώρο σας δεν έχετε παρά να επικοινωνήσετε μαζί μας. Εάν δεν γνωρίζετε πότε θα χρειαστείτε μια μόνωση ταράτσας, δεν έχετε παρά να διαβάσετε παρακάτω.\nΠοια είναι η διαδικασία για τη μόνωση ταράτσας;\nΠροκειμένου να εξασφαλιστούν τα βέλτιστα αποτελέσματα σε κάθε μόνωση ταράτσας, απαιτείται μια σειρά εργασιών από εξειδικευμένου επαγγελματίες. Συγκεκριμένα, το πρώτο και βασικότερο βήμα είναι η λεπτομερής μελέτη του χώρου στον οποίο θα πραγματοποιηθούν οι εργασίες. Ανάλογα με τα ιδιαίτερα χαρακτηριστικά της κατοικίας ή του επαγγελματικού χώρου το είδος της μόνωσης που θα επιλεγεί διαφέρει.\nΜερικά από τα δημοφιλέστερα είδη στις μονώσεις ταρατσών είναι η συμβατική, η ελαφρού τύπου, με αφρομπετόν και με υαλουφάσματα roofglass. Φυσικά δεν υπάρχει κανένας λόγος να μελετήσετε το κάθε είδος από αυτά για να επιλέξετε την πιο κατάλληλη. Αναθέτοντας την μόνωση στους εξειδικευμένους μας επαγγελματίες θα σας εξασφαλίσει και την πλέον ενδεδειγμένη μέθοδο για τον δικό σας χώρο.\nΕν συνεχεία θα γίνει έλεγχος της κλίσης της ταράτσας και αν απαιτείται θα πραγματοποιηθεί η διασφάλιση της κλίσης προκειμένου να απομακρύνονται τα νερά και να αποφύγετε την συσσώρευση υγρασίας. Τέλος, η διαδικασία ολοκληρώνεται με το αστάρωμα και την τοποθέτηση του μονωτικού υλικού.\nΠλεονεκτήματα που προσφέρουν οι μονώσεις ταρατσών\nΗ μόνωση ταράτσας αποτελεί μια εξαιρετική επένδυση αφού η απόσβεσή της θα γίνει σε ελάχιστο χρονικό διάστημα και τα οφέλη που θα σας προσφέρει είναι τεράστια. Μερικά από τα σημαντικότερα πλεονεκτήματα που προσφέρουν οι μονώσεις ταρατσών είναι:\nΒέλτιστες συνθήκες διαβίωσης για εσάς και την οικογένειά σας.\nΠροστασία του χώρου από υγρασία και μούχλα.\nΒελτίωση ενεργειακής απόδοσης – μείωση απωλειών ενέργειας.\nΕξοικονόμηση κατανάλωσης ενέργειας.\nΠότε είναι απαραίτητες οι μονώσεις ταρατσών;\nΟι μονώσεις ταρατσών αποτελούν μιας από τις καλύτερες επενδύσεις ώστε να αναβαθμίσετε ενεργειακά τον χώρο σας και να εξοικονομήσετε χρήματα. Ωστόσο σε κάποιες περιπτώσεις κρίνονται απαραίτητες προκειμένου να αποφύγετε δυσάρεστες συνέπειες. Μερικά από τα σημάδια ότι θα χρειαστείτε τις υπηρεσίες μας είναι η εμφάνιση μούχλας και υγρασίας ή αν διαπιστώνετε απώλειες θερμότητας τον χειμώνα και έντονη ζέστη το καλοκαίρι.\nΤο κόστος για τις εργασίες που απαιτούνται σε μια μόνωση ταράτσας δεν είναι σταθερό και εξαρτάται από διάφορους παράγοντες. Οι βασικότεροι από αυτούς είναι το είδος των υλικών που θα χρησιμοποιηθούν και φυσικά το είδος της μόνωσης. Μάλιστα, οι τιμές των μονωτικών υλικών διαφέρουν αρκετά από εταιρεία σε εταιρεία.\nΗ εταιρεία μας σας παρέχει την καλύτερη σχέση ποιότητας τιμής και αναλαμβάνει να ολοκληρώσει την μόνωση της ταράτσα σας με τον πλέον κατάλληλο τρόπο. Εάν ενδιαφέρεστε για περισσότερες πληροφορίες θα χαρούμε να επικοινωνήσετε μαζί μας.


Μέθοδοι Ανάλυσης Συγκριτικής Γονιδιωματικής - PDF\nΜέθοδοι Ανάλυσης Συγκριτικής Γονιδιωματικής\nDownload "Μέθοδοι Ανάλυσης Συγκριτικής Γονιδιωματικής"\n1 ΓΕΩΠΟΝΙΚΟ ΠΑΝΕΠΙΣΤΗΜΙΟ ΑΘΗΝΑΣ ΤΜΗΜΑ ΒΙΟΤΕΧΝΟΛΟΓΙΑΣ ΙΕΡΑ ΟΔΟΣ 75, ΑΘΗΝΑ Μεταπτυχιακή Διατριβή για το Μεταπτυχιακό Δίπλωμα Ειδίκευσης (Μ.Δ.Ε) "Εφαρμογές της Βιοτεχνολογίας στη Γεωπονία" Μέθοδοι Ανάλυσης Συγκριτικής Γονιδιωματικής ΚΩΝΣΤΑΝΤΙΝΟΣ ΜΠΟΥΓΙΟΥΚΟΣ Αθήνα, 2014\n2 Table of Contents 1 ΕΙΣΑΓΩΓΉ ΠΡΏΤΟ ΜΈΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΉ ΒΆΣΕΙΣ ΔΕΔΟΜΈΝΩΝ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΉΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΉΣ Βάσεις δεδομένων γονιδιωμάτων φυτών Η βάση γονιδιωμάτων φυτών PlantGDB Η βάση συγκριτικής γονιδιωματικής φυτών GreenPhyllDB Βάσεις δεδομένων μικροοργανισμών Η ολοκληρωμένη βάση γονιδιωμάτων μικροοργανισμών Η βάση συγκριτικής γονιδιωματικής Xbase ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΉ ΓΩΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΉ ΦΥΤΏΝ Συγκριτική γονιδιωματική για τον προσδιορισμό της προέλευσης των γονιδιωμάτων καλλιεργούμενων φυτών Συκριτική γονιδιωματική στην χαρτογράφηση γενετικών χαρακτήρων στα φυτά Σύγχρονες πηγές συγκριτικής γονιδιωματικής στα φυτά Η βάση Phytozome ΔΕΎΤΕΡΟ ΜΈΡΟΣ ΕΙΣΑΓΩΓΉ ΜΈΘΟΔΟΙ ΑΝΆΛΥΣΗΣ ΟΜΟΙΌΤΗΤΑΣ ΑΛΛΗΛΟΥΧΙΏΝ Μέθοδοι στοίχισης βιολογικών ακολουθιών Τα COGs (clusters of orthologus groups) και η βάση δεδομένω τους Διαχωρισμός ορθόλογων / παράλογων ΜΈΘΟΔΟΙ ΑΝΑΚΑΤΑΣΚΕΥΉΣ ΕΞΕΛΙΚΤΙΚΏΝ ΣΧΈΣΕΩΝ ΠΟΥ ΒΑΣΊΖΟΝΤΑΙ ΣΕ ΟΛΌΚΛΗΡΑ ΓΟΝΙΔΙΏΜΑΤΑ ΜΈΘΟΔΟΙ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΉΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΉΣ ΠΟΥ ΔΕΝ ΒΑΣΊΖΟΝΤΑΙ ΣΤΗΝ ΟΜΟΙΌΤΗΤΑ ΜΕΤΑΞΎ ΑΚΟΛΟΥΘΙΏΝ Μέθοδοι λειτουργικού προσδιορισμού βιολογικών ακολουθιών Μέθοδοι λειτουργικής φυλογονιδιωματικής ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΈΣ ΜΈΘΟΔΟΙ ΠΟΥ ΠΡΟΣΔΙΟΡΊΖΟΥΝ ΛΕΙΤΟΥΡΓΙΚΈΣ ΑΚΟΛΟΥΘΊΕΣ Η μέθοδος Rosetta Stone Η μέθοδος του φυλογενετικού προφίλ Η μέθοδος της συντηρημένης μικρο-συντενίας Η μέθοδος του οπερονίου ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΈΣ ΜΈΘΟΔΟΙ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΉΣ ΑΝΆΛΥΣΗΣ ΥΠΟΛΟΓΙΣΤΙΚΆ ΚΑΙ ΑΛΓΟΡΙΘΜΙΚΆ ΠΡΟΒΛΉΜΑΤΑ ΣΤΗΝ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΉ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΉ BLAST και BLASTphemy ΤΡΊΤΟ ΜΈΡΟΣ ΣΧΕΔΙΆΖΟΝΤΑΣ ΠΕΙΡΆΜΑΤΑ ΕΛΈΓΧΟΥ ΣΕ ΑΝΑΛΎΣΕΙΣ ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΉΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΉΣ ΧΡΉΣΗ ΡΟΉΣ ΑΝΆΛΥΣΗΣ (PIPELINE) ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΉΣ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΉΣ ΣΤΗ ΧΑΡΤΟΓΡΆΦΗΣΗ ΣΥΜΠΕΡΆΣΜΑΤΑ Η ΣΥΓΚΡΙΤΙΚΉ ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΉ ΣΤΗΝ ΜΕΤΆ-ΓΟΝΙΔΙΩΜΑΤΙΚΉ ΕΠΟΧΉ Η πρωτοβουλία μοντελοποίησης του iplant ΠΑΡΑΡΤΉΜΑΤΑ...I ii\n3 7 ΒΙΒΛΙΟΓΡΑΦΊΑ...II iii\n4 List of Figures List of Tables Appendices Appendix I: Heading of this appendix...i iv\n5 List of Abbreviations and Symbols JGI Joint Genome Institute v\n6 1 ABSTRACT In the context of this study we deal with 3 concepts in studying analysis methods of comparative genomics. Firstly, we review a set of online resources that provide data and valuable precomputed results of comparative genomics studies. We critically review and evaluate a wide range of analysis tools and methods for comparative genomics and elaborate with regards to the usage of these methods in the routine work of researchers of any level of expertise. The set of methods that we present in this study create a sufficient corpus of knowledge and can provide a researcher with the necessary familiarity they need in order to perform everyday advanced comparative genomic analysis. We focus more intensively into methods that involve any kind of phylogenetics analysis in comparative genomics such as phylogenomics and ortholog/paralog detection, as we reckon that evolutionary biology has been gravely transformed with the advent of genomics and vice versa. Finally we present the outcome of two experimental methods that we have developed independently, are heavily relied on comparative genomics analysis and have been used in the identification of microrna targets in mammalian genomes and on the novel molecular markers detection in plants that lack a complete reference genomic sequence. vi\n7 ΠΕΡΙΛΗΨΗ Στο πλαίσιο αυτής της μελέτης θα ασχοληθούμε με 3 έννοιες της μελέτης των μεθόδων ανάλυσης της συγκριτικής γονιδιωματικής. Πρώτον, εξετάζουμε ένα σύνολο online πηγών που παρέχουν στοιχεία και πολύτιμα προϋπολογισμένα αποτελέσματα από μελέτες της συγκριτικής γονιδιωματικής. Δευτερον, έχουμε εξετάσει με κριτικό πνεύμα και αξιολογήσει ένα ευρύ φάσμα εργαλείων ανάλυσης και μεθόδων για την συγκριτική γονιδιωματική και τα έχουμε επεξεργαστεί σε σχέση με τη χρήση των μεθόδων αυτών στην καθημερινή εργασία ερευνητών με οποιοδήποτε επίπεδο εξειδίκευσης. Το σύνολο των μεθόδων που παρουσιάζονται σε αυτή τη μελέτη μπορεί να δημιουργήσει ένα επαρκές σώμα γνώσεων και μπορεί να παρέχει στους ερευνητής την αναγκαία γνώση που χρειάζονται για να πραγματοποιούν καθημερινές προηγμένες αναλυσεις συγκριτικής γονιδιωματικής. Έχουμε επικεντρωθεί περισσότερο εντατικά σε μεθόδους που περιλαμβάνουν κάθε είδους φυλογενετική ανάλυση στη συγκριτική γονιδιωματική όπως phylogenomics και ανίχνευση ορθολόγων/παραλόγψν ακολουθειών, καθώς εκτιμούμε ότι η εξελικτική βιολογία έχει μετασχηματιστεί σε πολύ μεγάλο βαθμό με την έλευση της γονιδιωματικής και αντίστροφα. Τέλος, παρουσιάζουμε τα αποτελέσματα των δύο πειραματικών μεθόδων που έχουμε αναπτύξει ανεξάρτητα, και οι οποίες στηρίχθηκαν σε μεγάλο βαθμό στη χρήση μεθόδων συγκριτικής γονιδιωματικής ανάλυσης και έχουν χρησιμοποιηθεί για τον εντοπισμό των στόχων των microrna σε γονιδιώματα θηλαστικών και στον εντοπισμό νέων μοριακών δεικτών σε φυτά που δεν έχουν πλήρη γονιδιωματική αλληλουχία αναφοράς. vii\n8 2 Εισαγωγή Μία από τις πιο ιστορικές και διαδεδομένες μεθόδους στην βιολογία είναι η συγκριτική μέθοδος [Harvey & Pagel 1991]. Η συγκριτική μέθοδος αποτελεί παράδοση για τη βιολογία από τις εποχές ακόμα και πριν τον Δαρβίνου. Ελλείψει άλλων δεδομένων, η συγκριτική ανατομία αποτελούσε ένα από τα πιο ισχυρά εργαλεία στα χέρια των βιολόγων των περασμένων αιώνων και αποτέλεσε τη βάση για την μελέτη των απολιθωμάτων και την ανάπτυξη της εξελικτικής βιολογίας. Υπήρξε πάντα προσφιλής και συνηθισμένη διαδικασία για τους βιολόγους η σύγκριση χαρακτήρων διαφορετικών οργανισμών. Χρησιμοποιώντας διαφόρων ειδών ομόλογους χαρακτήρες, χαρακτήρες που έχουν αποκλίνει από κάποια κοινή προγονική δομή λόγω διαφόρων εξελικτικών αλλαγών (ειδογένεση, συσσώρευση μεταλλάξεων, αποκλίνουσα ή συγκλίνουσα εξέλιξη), η βιολογική έρευνα ήταν σε θέση να ερμηνεύσει μια σειρά φαινομένων αναφορικά με την φυσιολογία και την εξέλιξη των οργανισμών. Με την αλλαγή παραδείγματος [Gilbert 1991] που επέφερε στη βιολογία η έναρξη και ολοκλήρωση των προγραμμάτων αλληλούχησης εκατοντάδων γονιδιωμάτων πολλών ευκαριωτικών και πολλών περισσοτέρων προκαρυωτικών οργανισμών αλλά και την αναμονή ολοκλήρωσης των εργασιών αλληλούχησης πολλών περισσοτέρων, οι viii\n9 βιολογικές επιστήμες βρέθηκαν μπροστά σε μια δεξαμενή δεδομένων άνευ προηγουμένου μεγέθους. Η εφαρμογή λοιπόν της πιο ιστορικής, διαδεδομένης και πιο συνηθισμένης για τους βιοεπιστήμονες μεθόδου, της συγκριτικής μεθόδου, ήταν αναμενόμενη και προέκυψε χωρίς καθυστέρηση. Η εφαρμογή όλων των αρχών αλλά και του θεωρητικού υπόβαθρου της συγκριτικής μεθόδου στη σύγχρονη μεταγονιδιωματική εποχή (post-genomics era), η ανάλυση, η σύγκριση και ο σχολιασμός δηλαδή μεγάλων τμημάτων των τεράστιων ακολουθιών που έχουν κάνει διαθέσιμες τα προγράμματα των γονιδιωμάτων, έδωσε γέννηση σε ένα εξαιρετικά ενδιαφέρον αντικείμενο της σύγχρονης βιολογίας τη συγκριτική γονιδιωματική (comparative genomics). Ως συγκριτική γονιδιωματική μπορούμε να ορίσουμε πολύ απλά τη συγκριτική μελέτη ολοκληρωμένων ή τμημάτων (διαφόρων μεγεθών και δομής) γονιδιωμάτων που προέρχονται από δύο ή περισσοτέρων είδη. Χρησιμοποιώντας τα λόγια ενός από τους πρωτοπόρους αυτού του πεδίου του Russ Altman από το πανεπιστήμιο του Stanford μπορούμε να δώσουμε έναν ελεύθερο ορισμό στον όρο συγκριτική γονιδιωματική. Η συγκριτική γονιδιωματική μπορεί να οριστεί ως η σύγκριση γονιδιωμάτων σε μεγάλη κλίμακα, με σκοπό την κατανόηση της βιολογίας των γονιδιωμάτων ξεχωριστά όσο και την εξαγωγή γενικών συμπερασμάτων που αφορούν ομάδες γονιδιωμάτων Η βασικές αρχές που διέπουν τη συγκριτική γονιδιωματική είναι εύλογα κατανοητές. Τα κοινά χαρακτηριστικά δύο (ή περισσοτέρων) οργανισμών συχνά κωδικοποιούνται από τις ακολουθίες DNA που είναι συντηρημένες μεταξύ των ειδών. Πιο συγκεκριμένα, τα τμήματα ακολουθιών DNA, που κωδικοποιούν για πρωτεΐνες και RNA που είναι υπεύθυνα για διάφορες λειτουργίες και είναι συντηρημένες από τον τελευταίο κοινό πρόγονο πρέπει να έχουν συντηρηθεί εξελικτικά στις σύγχρονες ακολουθίες γονιδιωμάτων. Παρόμοια, τα τμήματα εκείνα του γονιδιώματος που ρυθμίζουν την έκφραση των γονιδίων, τα οποία εκφράζονται παρόμοια μεταξύ δύο (ή περισσοτέρων) συγγενικών ειδών αναμένεται να έχουν και αυτές ένα βαθμό ομοιότητας. Αντιθέτως, ακολουθίες που κωδικοποιούν (ή ρυθμίζουν την έκφραση) πρωτεϊνών και RNA υπεύθυνων για διαφορετικές λειτουργίες ανάμεσα σε είδη με τη σειρά τους είναι δυνατόν να χαρακτηριστούν από τη συγκριτική ανάλυση, ως τμήματα που δεν μοιράζονται κάποιες ελληλουχικές ομοιότητες. Η συγκριτική γονιδιωματική έχει χαρακτηριστεί σαν το Ιερό Δισκοπότηρο της σύγχρονης έρευνας στις βιοεπιστήμες. Παρουσιάστηκε ως το επόμενο μεγάλο βήμα ix\n10 μετά την ολοκλήρωση των προγραμμάτων αλληλούχησης και σαν τον τομέα εκείνο που θα μπορέσει να αξιοποιήσει και να δώσει όσο το δυνατόν περισσότερες πληροφορίες μέσα από τον κυκεώνα των δεδομένων (sequencing data) που έχουν κατακλύσει τη σύγχρονη βιολογική έρευνα. Δεν είναι τυχαίο ότι συμπεριλήφθηκε στον κατάλογο των 10 πιο καυτών ερευνητικών πεδίων του κορυφαίου επιστημονικού περιοδικού Science για το 2003 [Magazine 2002]. Μέχρι σήμερα έχουν εφαρμοστεί αρκετές μέθοδοι συγκριτικής γονιδιωματικής αλλά χωρίς να ονομάζονται έτσι. Οι σύγχρονοι ερευνητές των βιοεπιστημών χρησιμοποιούν σε καθημερινή βάση και σε επίπεδο ρουτίνας πλέον μεθόδους για τοπική ή και συνολική στοίχιση ακολουθιών (local and global alignment tools) και πολλαπλής στοίχισης ακολουθιών (multiple sequence alignment) τεχνικές και αλγόριθμοι που έχουν αναπτυχθεί εδώ και αρκετά χρόνια αλλά δεν κατατάσσονταν συστηματικά στο πεδίο της συγκριτικής γονιδιωματικής. Στο γενικό πλαίσιο της ομολογίας μεταξύ ακολουθιών και της εξελικτικής τους συγγένειας αυτές οι μέθοδοι αποτελούν τον πρόδρομο της συγκριτικής γονιδιωματικής. Επίσης όσον αφορά την πρόβλεψη της τριτοταγούς δομής πρωτεϊνών οι μέθοδοι που στηρίζονται στους αλγόριθμους του PSI- BLAST (Position Specific Iteration BLAST) αποτελούν και αυτές προάγγελους αλλά και την υποδομή των πιο εξελιγμένων σημερινών μεθόδων. Τέλος μέθοδοι συγκριτικής γονιδιωματικής χωρίς να ονομάζονται έτσι αποτελούν και οι μέθοδοι που ασχολούνται με την πρόβλεψη και την αναζήτηση μοτίβων πρόσδεσης μεταφραφικών παραγόντων (transcription factor binding sites ή TFBS) χρησιμοποιώντας πολλαπλές ακολουθίες και χρησιμοποιούνται για την εύρεση cis-ρυθμιστικών περιοχών ανωφορικά (upstream) των προαγωγέων (promoters) γονιδίων. Συνοπτικά οι σύγχρονες μέθοδοι της συγκριτικής γονιδιωματικής στοχεύουν στα ακόλουθα: Στην ανακατασκευή των προτύπων εξέλιξης οικογενειών γονιδίων (gene families). Μέσα από αυτό είναι δυνατή η ταξινόμηση των γονιδίων σε ομάδες (gene clusters) αλλά και η αποσαφήνιση του λειτουργικού τους ρόλου. Μέσα από τη συστηματική μελέτη της εξέλιξης και της διασποράς των γονιδίων σε μεγάλες οικογένειες είναι δυνατή ο λειτουργικός τους σχολιασμός (functional annotation) και ο προσδιορισμός της λειτουργίας τους (functional assignment). x\n11 Στην αποτίμηση του ρόλου εξελικτικών διαδικασιών στο επίπεδο της δομής του γονιδιώματος (διπλασιασμοί, εισαγωγές, ελλείψεις, μεταθέσεις γονιδίων και φαινόμενα οριζόντιας μεταφοράς) και στην διαμόρφωση των οργανισμών. Στον προσδιορισμό cis-ρυθμιστικών στοιχείων μέσω φυλογενετικών αποτυπωμάτων. Η μέθοδος συγκριτικής αλληλούχησης (comparative sequencing), όπου γονιδιωματικές ακολουθίες συγκρίνονται μεταξύ διαφορετικών ακολουθιών για συντηρημένες μη κωδικές περιοχές, έχει αποδειχθεί σαν ένα δυνατό εργαλείο για την αναγνώριση cis-ρυθμιστικών στοιχείων. Στην αναγνώριση ομάδων γονιδίων που μας δίνουν ενδείξεις για: 1. Θετική επιλογή (positive selection). 2. Μετατροπή γονιδίων (gene conversion). 3. Οριζόντια μεταφορά (horizontal transfer). 4. Συντονισμένη εξέλιξη (concerted evolution). Στην ανακατασκευή φυλογενετικών σχέσεων χρησιμοποιώντας πολλαπλές αλληλουχίες γονιδίων (ευκαρυωτικούς) ή/και το σύνολο του γονιδιώματος των οργανισμών (προκαρυωτικούς). Οι προσπάθειες αυτές εντάσσονται στον κλάδο της φυλογονιδιωματικής (phylogenomics) [Eisen 1998]. Τέλος σημαντικά τεχνικής φύσης προβλήματα και πεδία έρευνας πάνω στη συγκριτική γονιδιωματική αποτελούν: 1. Οι αλγόριθμοι για τη στοίχιση πολύ μεγάλων γονιδιωματικών ακολουθιών. 2. Προσεγγίσεις μέσω της συγκριτικής γονιδιωματικής για τον εντοπισμό γονιδίων (gene finding). Και την δημιουργία γενετικών δεικτών (genetic markers). 3. Προσεγγίσεις μέσω της συγκριτικής γονιδιωματικής στον καθορισμό λειτουργιών (funtional genomics) 4. Συγκριτικές προσεγγίσεις στην αναγνώριση ρυθμιστικών περιοχών στο γονιδίωμα. 5. Συγκριτικές προσεγγίσεις για την δράση της φυσικής επιλογής στα γονιδιώματα. Στα πλαίσια της παρούσας εργασίας έχει γίνει μια προσπάθεια να παρουσιαστούν οι πιο διαδεδομένες εφαρμογές, εργαλεία και μέθοδοι της συγκριτικής γονιδιωματικής καθώς και να ταξινομηθούν και να αξιολογηθούν οι εκάστοτε δυνατότητες τους. Το xi\n12 πρώτο μέρος της μελέτης αποτελεί μια ενδελεχή ανασκόπηση όλων των σύγχρονων (και όχι τόσο σύγχρονων, μερικές από τις βασικές μεθόδους έχουν εμφανιστεί εδώ και πάνω από 15 χρόνια) μεθόδων και εφαρμογών συγκριτικής γονιδιωματικής. Στο δεύτερο μέρος γίνεται μια ιδιαίτερη αναφορά, παρουσίαση και αξιολόγηση όλων εκείνων των μεθόδων της συγκριτικής γονιδιωματικής που περιλαμβάνουν κάποιου είδους φυλογενετική/εξελικτική ανάλυση (φυλογονιδιωματική phylogenomics, φυλογενετικά αποτυπώματα phylogenetic footprinting κ.α.) η ιδιαίτερη σχέση ανάμεσα στη συγκριτική γονιδιωματική και την εξελικτική βιολογία και η αλληλοϋποστήριξη των δύο πεδίων μεταξύ τους είναι από τα πιο ενδιαφέροντα και ελπιδοφόρα επιτεύγματα της σύγχρονης βιολογικής έρευνας [Koonin,Aravind & Kondrashov 2000]. Στο τρίτο μέρος παρουσιάζονται: α) ένα μοντέλο για τη διενέργεια αρνητικών πειραμάτων ελέγχου (negative control experiments) σε εφαρμογές συγκριτικής γονιδιωματικής και β) μια εαφρμογή μια σειράς μεθόδων της συγκριτικής γονιδιωματικής στην χαρτογράφηση γονιδίων και την δημιουργία γενετικών χαρτών και δεικτών με Next Generation Sequence (NGS) ανάλυση σε οργανισμούς χωρίς δημοσιευμένα γονιδιώματα. xii\n13 3 Πρώτο Μέρος 3.1 Εισαγωγή Στο πρώτο μέρος της εργασίας θα γίνει μια παρουσίαση των πιο σημαντικών ζητημάτων που άπτονται της συγκριτικής γονιδιωματικής. Θα παρουσιαστούν οι σύγχρονοι τρόποι πρόσβασης στις βάσεις δεδομένων των πιο σημαντικών γονιδιωμάτων και οι τρόποι να εκμεταλλευτούμε τα πρωτογενή εργαλεία για συγκριτική ανάλυση που μας παρέχουν πολλές από αυτές. Η ανάπτυξη των συγχρόνων βάσεων δεδομένων των γονιδιωμάτων δεν σταματά στην απλή αποθήκευση των γενομικών αλληλουχιών αλλά έχει καταφέρει να παρέχει και αρκετά εργαλεία τόσο όσον αφορά τον σχολιασμό των γονιδιωμάτων (genome annotation) όσο και τη σχεδίαση λεπτομερών γενετικών χαρτών (maping). Στη συνέχεια θα παρουσιαστούν οι μέθοδοι σύγκρισης ολόκληρων γονιδιωμάτων (whole genome comparisons) και τα επιτεύγματα τους στη λειτουργική γονιδιωματική (functional genomics) και την διερεύνηση της εξέλιξης των γονιδιωμάτων (genome evolution). Το κεφάλαιο θα κλείσει με μια ανασκόπηση, ταξινόμηση και αξιολόγηση των πιο σημαντικών και ελπιδοφόρων μεθόδων ανάλυσης και των εφαρμογών τους. Σκοπός του κομματιού αυτού είναι τόσο να κάνει μια ενδελεχή παρουσίαση των πηγών και των μεθόδων που χρησιμοποιούνται για την πρόσκτηση και την ανάκτηση xiii\n14 δεδομένων και δομημένης γνώσης καθώς και να τις αξιολογήσει όσο και να επισημάνει κάποιες γενικές αρχές λειτουργίας τους που θα βοηθήσουν ερευνητές που δεν είναι εξοικειωμένοι με την βιοπληροφορική να είναι σε θέση να κατανοήσουν και να μπορούν να εντάξουν τις μεθόδους και τις πηγές αυτές στην καθημερινή ερευνητική τους πρακτική. Το σύνολο των δεδομένων που παρουσιάζονται στο πρώτο μέρος είναι χρήσιμο να διαβαστεί και να κατανοηθεί κάτω από το πρίσμα ενός απλού μαθηματικού μοντέλου που συνδέει τις φυλογενετικές αποστάσεις και το μέγεθος των συντηρημένων περιοχών που χρειάζεται να μελετηθούν με τον αριθμό των γονιδίων που απαιτείται να συγκριθούν [Eddy 2005]. Το μοντέλο προσδιορίζει κάτι που διαισθητικά είναι αναμενόμενο, ότι για μια δεδομένη φυλογενετική απόσταση ο αριθμός των γονιδιωμάτων που απαιτείται κλιμακώνεται αντίστροφα με το μέγεθος των στοιχείων σύγκρισις που μελετώνται, δηλαδή για την μελέτη μονηρών νουκλεοτιδικών πολυμορφισμών (SNPs) απαιτούνται πολύ περισσότερα γονιδιώματα από ότι για τη μελέτη ρυθμιστικών περιοχών ή τη μελέτη της δομής (εξόνια-εσόνια) των γονιδίων. Αυτή η αντίστροφα κλιμακούμενη συμπεριφορά είναι χρήσιμη για την κατανόηση της φύσης των πηγών δεδομένων καθώς και για το σχεδιασμό πειραμάτων συγκριτικής γονιδιωματικής οργανσιμών. 3.2 Βάσεις Δεδομένων Συγκριτικής Γονιδιωματικής Η σύγχρονη συγκριτική γονιδιωματική εκμεταλλευόμενη τις εξελίξεις στην διαχείριση συστημάτων βάσεων δεδομένων καθώς και στις τεχνολογίες διαχείρισης και απεικόνισης δεδομένων έχει κάνει διαθέσιμες πολλές ενδιαφέρουσες υλοποιήσεις συγκέντρωσης δεδομένων σε βάσεις δεδομένων. Βάσεις οι όποιες πλέον εκτός από αποθήκευση απλά βιολογικών ακολουθιών στοχεύουν στο να παραγάγουν γνώση και πληροφορία και να την κάνουν διαθέσιμη αλλά και ορατή (μέσω σύγχρονων τεχνικών αναπαράστασης) στου ερευνητές των βιοεπιστημών. Τέτοιες πηγές πληροφορίας υπάρχουν ελεύθερες στο διαδίκτυο τόσο για προκαρυωτικούς οργανισμούς όσο και για ζώα και φυτά. Στην συνέχεια αυτού του μέρους θα παρουσιαστούν τα σημαντικότερα παραδείγματα που είναι διαθέσιμα, με μια έμφαση σε φυτά και μικροοργανισμούς, σε μια προσπάθεια αυτές οι πηγές να γίνουν εύκολα διαθέσιμες αλλά και να χρησιμοποιηθούν από ερευνητές των βιοεπιστημών που δεν είναι εξοικειωμένοι με τις μεθόδους και τις πηγές δεδομέων της βιοπληροφορικής. xiv\n15 3.2.1 Βάσεις δεδομένων γονιδιωμάτων φυτών Η βάση γονιδιωμάτων φυτών PlantGDB [Duvick et al. 2008] είναι η νο1 κατεξοχήν σύγχρονη βάση που εξειδικεύεται πλήρως στην συγκριτική γονιδιωματική των φυτών Η βάση συγκριτικής γονιδιωματικής φυτών GreenPhyllDB g [Rouard et al. 2011]. Η βάση αυτή εξειδικεύεται περισσότερο στη λειτουργική γονιδιωματική και στην ανάλυση των εξελικτικών σχέσεων των φυτών μέσω της συγκριτικής γονιδιωματικής. Είναι εξαιρετικά χρήσιμη για de-novo εύρεση γονιδίων σε μη χαρτογραφημένα είδη Βάσεις δεδομένων μικροοργανισμών Η ολοκληρωμένη βάση γονιδιωμάτων μικροοργανισμών [Uchiyama,Mihara,Nishide & Chiba 2013]. Περιέχει ολοκληρωμένα γονιδιώματα μικροοργανισμών και επιτρέπει την απευθείας ανάλυση ορθόλογων παράλογων ακολουθιών ελεύθερα από το web-interface της Η βάση συγκριτικής γονιδιωματικής Xbase [Chaudhuri & Pallen 2006]. Περιέχει τόσο ολοκληρωμένα όσο και μη ολοκληρωμένα και κομμάτια από γονιδιώματα. Αποτελεί μια συλλογή απο άλλες βάσεις δεδομένων, μια μέτα-βάση δεδομένων. 3.3 Συγκριτική Γωνιδιωματική Φυτών Πολλά φυτά έχουν ορισμένες ιδιαιτερότητες στα γονιδιώματα τους που τα κάνουν να αποτελούν ενδιαφέροντα πεδία για την εφαρμογή σύγχρονων μεθόδων συγκριτικής γονιδιωματικής. Τα χαρακτηριστικά αυτά περιλαμβάνουν: το συγκριτικά πολύ μεγάλο μέγεθος των γονιδιωμάτων πολλών καλλιεργούμενων φυτών (π.χ. Όλα τα σιτηρά εκτός από το ρύζι) είναι γεμάτα με επαναλαμβανόμενες ακολουθίες DNA και πολλών ειδών μεταθετά στοιχεία. Επιπλέον τα γονιδιώματα όλων των συγχρονων καλλιεργούμενων φυτών έχουν προκύψει από πολλαπλούς αρχαίους συνολικούς διπλασιασμούς τους γονιδιώματος (whole genome duplications) [Cui et al. 2006] οι οποίοι έχουν συμβεί πέραν της μιας φοράς στο σύνολο της εξελικτικής τους ιστορίας και σε xv\n16 κάποιου από τους παρελθόντες κοινούς προγόνους των σύγχρονων φυτών [Schmidt 2002] Συγκριτική γονιδιωματική για τον προσδιορισμό της προέλευσης των γονιδιωμάτων καλλιεργούμενων φυτών. Η προέλευση των γονιδιωμάτων των σημαντικότερων καλλιεργούμενων φυτών μας προσφέρει δύο πλεονεκτήματα. Πρώτον, η προέλευση και οι εξελικτικές σχέσεις των γονιδιωμάτων μεταξύ τους μπορεί να δώσουν πολύτιμες πληροφορίες σε πειράματα βελτίωση φυτών αλλά και σε εισαγωγή αγρονομικών χαρακτήρων με οικονομικό ενδιαφέρον. Δεύτερον, γνωρίζοντας την εξελικτική πορεία ενός σύγχρονου καλλιεργούμενου φυτού αλλά και των παθογόνων του μπορεί κανείς να αναπτύξει πολύ πιο αποτελεσματικά και ολοκληρωμένα προγράμματα τόσο καλλιέργειας όσο και καταπολέμησης των παθογόνων των φυτών. Συνεξέλιξη φυτού / παθογοόνου... σημασίες της ανακατασκευής της εξελικτικής ιστορίας των φυτικών γονιδιωμάτων Συκριτική γονιδιωματική στην χαρτογράφηση γενετικών χαρακτήρων στα φυτά. Ανάπτυξη COS (Conserved Ortholog Set) markers. Χαρτογράφηση με χρήση συντενικών χαρακτηριστικών σε είδη που δεν έχουν πλήρως αναγνωσμένα γονιδιώματα... κλπ. Κλπ Σύγχρονες πηγές συγκριτικής γονιδιωματικής στα φυτά Η βάση Phytozome [Goodstein et al. 2012] αναπτύχθηκε από το Joint Genome Institute (JGI) και αποτελεί την πιο σύγχρονη πηγή δεδομένων και γνώσης όσον αφορά την συγκριτική γονιδιωματική φυτών. Έχει εξαιρετική ικανότητα για πολλά προ-υπολοσμένα καθημερινές δουλείες ρουτίνας που μπορεί να χρειαστεί ένας γονιδωματικός βιολόγος και πολύ καλή προγραμματική πρόσβαση. Προσφέρει την εξελικτική ιστορία κάθε αναγνωρισμένου γονιδίου στα φυτά που περιέχει τόσο στο επίπεδο της ακολουθίας όσο και στο επίπεδο της πρωτεϊνικής οικογένειας μέχρι την γονιδιωματική οικογένεια. xvi\n17 4 Δεύτερο Μέρος 4.1 Εισαγωγή Στο μέρος αυτό θα επιχειρηθεί μια ευρεία ανασκόπηση, ερμηνεία και αξιολόγηση των αναλυτικών (μαθηματικών και υπολογιστικών) μεθόδων ανάλυσης στη συγκριτική γονιδιωματική. Ξεκινώντας από την υλοποίηση της εφαρμογής της συγκριτικής μεθόδου πάνω στις ελεύθερα προσβάσιμες πλήρης γονιδιωματικές ακολουθίες εκατοντάδων οργανισμών, και τις πρώτες προσπάθειές στοίχισης ακολουθιών η ερμηνία των μεθόδων θα φτάσει μέχρι τις πιο εξελιγμες σύγχρονες μεθόδους συγκριτικής φυλογονιδιωματικής. Τα προγράμματα αποκωδικοποίησης των γονιδιωμάτων οργανισμών έχουν φτάσει πια στην μέτα- εποχή τους (post-genomics era) που σημαίνει ότι τα προβλήματα της ανάγνωσης και συναρμολόγησης ενός γονιδιώματος αποτελούν πλέον προβλήματα ρουτίνας και τα ανοιχτά ζητήματα και ερωτήματα αιχμής συγκεντρώνονται στο πεδίο της λειτουργικής, ρυθμιστικής και εξελικτικής ανάλυσης των γονιδιωμάτων. Και για τις τρεις αυτές κατηγορίες προβλημάτων (που αυθαίρετα τις ξεχωρίζουμε εδώ καθώς στην πράξη αποτελούν κομμάτια της έρευνας της ολοκληρωμένης βιολογίας -integrative biology) οι μέθοδοι συγκριτικής γονιδιωματικής προσφέρουν ανεκτίμητα εργαλεία ανάλυσης. Οι διάφορες αυτές ερωτήσεις μπορεί να αρχίσουν να διερευνόνται αποτελεσματικά συγκρίνοντας απλά -μέσω των διαδεδομένων αλγόριθμων στοίχισης- γονιδιώματα από οργανισμούς σε διαφορετικές φυλογενετικές ποστάσεις μεταξύ τους. Ξεχωρίζουμε 3 κατηγορίες οι οποίες αλληλοεπικαλύπτονται με τις 3 κατηγορίες ανάλυσρων που μόλις αναφέρθηκαν. xvii\n18 Μακρινές φυλογενετικές αποστάσεις (πάνω από 1 δισεκατομμύριο χρόνια) Συγκρίνοντας γονιδιώματα οργανισμών που έχουν διαχωριστεί εξελικτικά για πάνω απο 1 δις χρόνια μπορούμε να αποκτήσουμε μια πλατιά εικόνα για τα είδη των γονιδίων που μοιράζονται μεταξύ τους οι οργανισμοί. Συνήθως τέτοια γονίδια έχουν λειτουργίες διαχείριστικες (housekeeping) και εκφράζονται συνεχώς στους οργανισμούς. Για παράδειγμα το μη πλεονάζων σετ γονιδίων από τη δροσόφιλα (Drosophila melanogaster) και τον σκουλήκι (Caenorabditis elegans) έχει σχεδόν το ίδιο μέγεθος και είναι το διπλάσιο (και για τους δύο οργανισμούς) από αυτό της ζύμης (Saccharomyces serevisiae). Παρατηρούμε λοιπόν ότι ακόμα και για 3 τόσο καλά μελετημένους οργανισμούς μπορεί κανείς να δει ότι η μεγαλύτερη αναπτυξιακή πολυπλοκότητα και τα πιο σύνθετα μονοπάτια μεταγωγής σήματος στα δύο είδη του ζωικού βασιλείου απαιτεί τα διπλά γονίδια από ότι ο μονοκύτταρος ευκαρυότης της ζύμης [Rubin et al. 2000]. Η συγκριτική γονιδιωματική μας δείχνει μια εικόνα της δροσόφιλας, που είναι ένα μετάζωο με πολύπλοκη ανάπτυξη και εξελιγμένο νευρικό σύστημα απαιτεί μόλις 2 φορές περισσότερα γονίδια από τον απλό ευκαρυώτη της ζύμης, αυτό βοήθα στο να κατανοήσουμε ότι η πολυπλοκότητα και η μεταβλητότητα μεταξύ των ευκαρυώτικών οργανισμών δεν οφείλετε αποκλειστικά στο γονιδίωμα τους αλλά στο πως αυτό εκφράζεται και ρυθμίζεται. Σημειώνουμε εδώ ότι σε τέτοιες μεγάλες φυλογενετικές αποστάσεις οι γονιδιακές ακολουθίες που κωδικοποιούν πρωτεΐνες εμφανίζουν ομοιότητες που μπορούν να ανιχνευθούν από τα προγράμματα στοίχισης αλλά τόσο η σειρά των γονιδίων στο γονιδίωμα (synteny) όσο και η συντήρηση ρυθμιστικών περιοχών δεν είναι συντηριμένες. Ενδιάμεσες φυλογενετικές αποστάσεις (μεταξύ 80 και 200 εκατομμυρίων χρόνων) Σε αυτό το βαθμό διαχωρισμού των οργανισμών αναμένεται οι κωδικές ακολουθίες να εμφανίζουν ένα βαθμό απόκλισης και συσσώρευσης μεταλλαγών στατιστικά μικρότερο από ότι οι μη κωδικές περιοχές (σύμφωνα με τη θεωρία της ουδετερότητας των μεταλλαγών). Οι συγκριτική γονιδιωματική μπορεί να αποκαλύψει όχι μόνο τις λειτουργικές (και ως εκ τούτου συντηρημένες) περιοχές των γονιδιωμάτων αλλά συμβάλει στην αναγνώριση της δομής των κωδικών περιοχών (όπως εξόνια - εσόνια), του σχολιασμού της λειτουργίας τους καθώς και στον προσδιορισμό ορισμένων ρυθμιστικών τους περιοχών. Χαρακτηριστικά παραδείγματα αποτελούν οι συγκρίσεις που γοxviii\n19 νιδιώματος του ποντικιού με το ανθρώπινο [Consortium et al. 2002] αλλά και την πρόβλεψη της λειτουργίας γονιδιωματικών περιοχών με τη σύγκριση των γονιδιωμάτων των 2 πιο διαδεδομένων οργανισμών στις ζύμες [Cliften et al. 2001]. Κοντινές φυλογενετικές αποστάσεις (μεταξύ 5 και 10 εκατομμυρίων χρόνων). Οι συγκρίσεις γονιδιωμάτων σε αυτή την κλίμακα διαχωρισμού συμβάλει στο μεγαλύτερο βαθμό στο να μελετηθούν οι κομβικές διαφορές στις ακολουθίες που κάνει τους οργανισμούς διαφορετικούς. Για παράδειγμα μεταξύ του ανθρώπου και του χιμπαντζή που τους χωρίζει μόλις 1% διαφορές στο γονιδίωμα, οι συγκριτικ μελέτες μπορούν να αποκαλύψουν πέρα από τις νουκλεοτιδικές (και αμινοξικές διαφορές) στις κωδικές περιοχές και τις διαφορές στις ρυθμιστικές περιοχές αλλά και πως αυτές επηρεάζουν την διαφορική έκφραση των γονιδίων στην οποία οφείλετε το συντριπτικά μεγαλύτερο μέρος των διαφορών μεταξύ των δύο αυτών ανεπτυγμένων οργανισμών. Συνοπτικά οι συγκρίσεις μεταξύ των γονιδιωμάτων σε διαφορετικές κλίμακες διαχωρισμού των ειδών και φυλογενετικές αποστάσεις απαντά σε 3 διαφορετικές όσο και σημαντικές ομάδες προβλημάτων και αποτελεί ένα από τα πιο πολύπλευρα και ισχυρά εργαλεία συγκριτικής ανάλυσης των γονιδιωμάτων όπως παρουσιάζονται στην εικόνα 4. Εικόνα 4: Η σύγκριση γονιδιωμάτων σε διάφορες φυλογενετικές αποστάσεις επιτρέπει την αντιμετώπιση ανάλογων ερωτημάτων (τροποποιημένη από [Hardison 2003] ). xix\n20 Στη συνέχεια του δεύτερου μέρους θα παρουσιαστούν και αναλυθούν μέθοδοι ανάλυσης συγκριτικής γονιδιωματικής που βασίζονται στην αλληλουχικής ομοιότητας, αντιθέτως μέθοδοι που δεν στηρίζονται στην αλληλουχική ομοιότητα, μέθοδοι προσδιορισμού λειτουργίας και θα γίνει μια μικρή αναφορά και ανασκόπηση στα αλγοριθμικά προβλήματα που αντιμετωπίζει η συγκριτική γονιδιωματική. Σκοπός αυτών των μεθόδων είναι να χρησιμοποιήσουν ένα σύνολο γονιδιωμάτων προερχόμενο από διάφορες φυλογενετικές κλίμακες από κοινού με τέτοιο τρόπο ώστε να κατανοήσουμε καλύτερα τα μεμονωμένα γονιδιώματα [Haubold & Wiehe 2004]. 4.2 Μέθοδοι ανάλυσης ομοιότητας αλληλουχιών Ο βασικός κορμός των μεθόδων ανάλυσης στη συγκριτική γονιδιωματική αποτελείται απο μεθόδους που βασίζονται στην ανάλυση, ποσοτικοποίηση και στατιστική σημαντικότητα της σύγκρισης ομοιοτήτων και διαφορών μεταξύ ακολουθιών (τόσο γονιδίων και γονιδιωμάτων όσο και πρωτεϊνών). Ο τομέας της ανάλυσης ομοιότητας και ομολογίας μεταξύ ακολουθιών αποτελεί τη βάση ανάπτυξης και δομικό λίθο ανάπτυξης της συγκριτικής γονιδιωματικής. Οι βιολογικές ακολουθίες προέρχονται και έχουν δομηθεί από την συνεχιζόμενη βιολογική εξέλιξη των οργανισμών και ως εκ τούτου η ομοιότητα που εμφανίζουν στην ακολουθία τους είναι αποτέλεσμα κάποιας κοινής καταγωγής. Ομολογία λοιπόν για τη βιολογία σημαίνει κοινή καταγωγή και η ομοιότητα είναι απλά ένα αποτέλεσμα. Οι δύο έννοιες δεν πρέπει να συγχέονται καθώς η ομοιότητα αναφέρεται στην ποσοτικοποίηση της σύγκρισης ακολουθιών ενώ η ομολογία στην κοινή τους καταγωγή. Οι βιολογικές ακολουθίες μπορεί να έχουν δύο κοινή καταγωγή με δύο τρόπους: είτε από κάποιο γεγονός ειδογένεσης οπότε οι ομόλογες ακολουθίες ονομάζονται ορθόλογες είτε από κάποιο γεγονός διπλασιασμού οπότε και ονομάζονται παράλογες. Ο διαχωρισμός ορθόλογων παράλογων ακολουθιών είναι σημαντικός για την αναγνώριση λειτουργιών των γονιδίων, απασχολεί ένα μεγάλο κομμάτι των μεθόδων της συγκριτικής γονιδιωματικής και θα αναφερθούμε εκτενέστερα σε επόμενο τμήμα αύτου του μέρους Μέθοδοι στοίχισης βιολογικών ακολουθιών. Το πρώτο και σημαντικό βήμα στην συγκριτική ανάλυση ακολουθιών αποτελούν οι μέθοδοι στοίχισης (sequence alignment methods). Οι υπολογιστικές μέθοδοι στοίχισης προσβλέπουν στην λύση του προβλήματος της μέγιστης κοινής υποακολουθίας xx\n21 μεταξύ δύο ακολουθιών (the largest common substring problem [Gusfield 1997]) ο τρόπος με τον οποίο το λύνουν τις ξεχωρίζει σε: 1. Τοπική η ολική στοίχιση: Με την τοπική στοίχιση (local alignment) οι αλγόριθμοι στοίχισης επιδιώκουν την μέγιστη δυνατή κάλυψη όσο το δυνατό περισσοτέρων νουκλοετιδίων/αμινοξέων. Οι αλγόριθμοι ολικής στοίχισης (global alignment) επιδιώκουν την στοίχιση όλων των αμινοξέων/νουκλεοτιδίων στις ακολουθίες. 2. Πολλαπλή ή δυαδική στοίχιση: Η δυαδική στοίχιση (pairwise alignment) υπολογίζει περιοχές ομοιότητας μεταξύ δύο μόνο ακολουθιών ενώ η πολλαπλή στοίχιση (multiple alignment) περιλαμβάνει την στοίχιση πολλών ακολουθιών μεταξύ τους και απαιτεί ως εκ τούτου την δυαδική στοίχιση όλων των ζευγαριών ακολουθιών μεταξύ τους. Στη συνέχεια θα εστιάσουμε στην (τοπική αλλά και ολική μερικές φορές) πολλαπλή στοίχιση καθώς αποτλεί μια κομβική κατηγορία μεθόδων στη συγκριτική γονιδιωματική. Τόσο από μόνη της αποτελεί ένα σημαντικό εργαλείο για να προσδιοριστούν συντηρημένες περιοχές μεταξύ ομόλογων ακολουθιών αλλά και για να αποκαλυφθεί η εξελικτική ιστορία γονιδιωμάτων αλλά η πολλαπλή στοίχιση ακολουθιών αποτελεί το εναρκτήριο βήμα για αρκετές πιο ανεπτυγμένες μεθόδους συγκριτικής γονιδιωματικής, όπως το φυλογενετικο προφίλ και η δημιουργία πρωτεϊνικών/γονιδιακών οικογενειών (COGs [Tatusov et al. 2003]) Τα COGs (clusters of orthologus groups) και η βάση δεδομένω τους. Ένα από τα πιο επιτυχημένα εγχειρήματα της συγκριτικής γονιδιωματικής και ταυτόχρονα μια από τις πιο διαδεδομένες πηγές της είναι τα GOGs [Tatusov,Koonin & Lipman 1997] (clusters of orthologues groups) και η βάση δεδομένων του GOG database [Tatusov et al. 2003]. Ένα GOG αποτελείτε από ακολουθίς γονιδίων που έχουν χαρακτηριστεί ως ορθόλογες με υπολογιστικές μεθόδους (Best Reciprocal Blast Hit) και τα ορθόλογα αυτά γονίδια απαντώνται σε τουλάχιστον 3 διαφορετικά φύλα οργανισμών. Ξεκινώντας από αυτόν τον απλό ορισμό και αναπτύσσοντας τη ανάλυση και τη βάση δεδομένων τους τα GOGs αποτέλεσαν ένα από τα πρώτα δομικά στοιχεία της συγκριτικής γονιδιωματικής και ενώ ξεκίνησαν από ~720 οικογένειες GOG στην αρχική δημοσίευση αυτή τη στιγμή η GOG database περιέχει εκατομμύρια COGs από πολλές εκατοντάδες οργανισμούς καθώς και έναν βελτιωμένο αλγόριθμο εύρεσης COGs [Kristensen et al. 2010]. xxi\n22 4.2.3 Διαχωρισμός ορθόλογων / παράλογων. Ο διαχωρισμός ορθόλογων και παράλογων ακολουθιών στην συγκριτική γονιδιωματική αποτελεί ένα από τα πιο δύσκολα προβλήματα, που όμως η επίλυση του θα έχει να προσφέρει εξαιρετική βελτίωση στον τρόπο προσδιορισμού της λειτουργίας των γονιδιακών ακολουθιών. Πέρα από την αναγνώριση των COGs που περιγράφτηκε στην προηγούμενη ενότητα υπάρχουν πολύ πιο εξειδικευμένες μέθοδοι της συγκριτικής γονιδιωματικής και πηγές στο διαδίκτυο που προσφέρουν εξειδικευμένη αναγνώρηση, σχολιασμό και ανάλυση ορθόλογων ακολουθιών. Ο ορισμός μιας ορθόλογης ακολουθίας δόθηκε πρώτη φορά από τον W. Fitch  και μάλιστα χρειάστηκε να ξαναεπαναλάβει την αρχική του θέση καθώς με την εμφάνιση πολλών νέων πλήρως αναγνωσμένων γονιδιωμάτων άρχισε να επικρατεί σύγχυση στον κλάδο της εξελικτικής γονιδιωματικής. Η περιγραφή του Jensen στο [Jensen 2001] στηρίζεται στην ερμηνεία του Fitch και προσφέρει μια συμπαγή και ακέραια απάντηση στο πρόβλημα που προέκυψε μεταξυ εξελικτικών και γονιδιωματικών βιολόγων. Η εικόνα 5, παρουσιάζει την εξήγηση του Jensen που διευκρινίζει πλήρως τον διαχωρισμό ορθόλογων και παράλογων ακολουθιών. Εικόνα 5: Ο διαχωρισμός σε ορθόλογα και παράλογα στηρίζεται στην εξελικτική πορείς των ακολουθιών και στο αν είναι προϊόντα ειδογένεσης ή διπλασιασμού. Στο παράδειγμα μας το γονίδιο Α1 έχει 3 ορθόλογα γονίδια στο είδος C αλλά από αύτο μόνο το ένα είναι ορθόλογο με το Β1. Επίσης το Β2 έχει δύο ορθόλογα στο είδος C και ένα παράλογο το C1. Τέλος όλα τα γονίδια στο είδος C είναι παράλογα μεταξύ τους. Μετά την απαραίτητη διευκρίνιση στην ορολογία ήταν ζήτημα χρόνου να αρχίσουν να αναπτύσσονται οι πρώτοι αλγόριθμοι εύρεσης ορθόλογων που να χρησιμοποιούν και να μπορούν να αντεπεξέλθουν στην υψηλή απόδοση των high-throuput μεθόδων. Ο πιο κλασικος αλγόριθμος χρησιμοποιεί μια τεχνική ομαδοποίησης που ονομάζεται Markov Clustering (MCL) για να προσδιορίσει ευριστικά ορθόλογες ακολουθίες σε μεγάλα σετ δεδομένων, ονομάζεται OrthoMCL [Li,Stoeckert & Roos 2003] και είναι ο πιο ευρέως διαδεδομένος αλγόριθμος για high-throuput χαρακτηρισμό ορθόλογων. xxii\n23 Παράλληλα έχουν αναπτυχθεί πλούσιες διαδικτυακές πηγές που περιέχουν ήδη υπολογισμένα μεγάλα σετ ορθόλογων ακολουθιών από πολλά μοντέλα οργανισμούς, η πιο διαδεδομένη βάση που περιέχει ήδη υπολογισμένες ορθόλογες ακολουθίες και από όπου μπορεί να πραγματοποιηθεί απευθείας αναζήτηση με μια οποιαδήποτε αλληλουχία (πρωτεΐνης ή DNA) που έχει ενδιαφέρον, είναι η OrthoDB[Kriventseva et al. 2014]. Η βάση ήδη περιέχει στην τελευταία της έκδοση 3027 (2627 βακτήρια) ολοκληρωμένα γονιδιώματα με τις ομάδες των ορθόλογων τους ιεραρχικά ομαδοποιημένες. 4.3 Μέθοδοι ανακατασκευής εξελικτικών σχέσεων που βασίζονται σε ολόκληρα γονιδιώματα. Η ανάγνωση της πλήρους ακολουθίας πολλών γονιδιωμάτων από όλα τα εξελικτικά φύλα προσδίδει πλέον στη φυλογενετική μια σημαντική ευκαιρία να αναπτυχθεί από μια επιστήμη που μελετούσε την εξέλιξη συγκεκριμένων κομματιών DNA, (κυριώς γονίδια) σε μια επιστήμη που πλέον χρησιμοποιεί το σύνολο της γενετικής πληροφορίας που κληρονομεί ένας οργανισμός για να προσδιορίζει την εξελικτική του πορεία. Έτσι η φυλλογενετική ολοκληρωμένων γονιδιωμάτων (whole genome phylogenetics) είναι πλέον η κυρίαρχη προσέγγιση για την ανακατασκευή φυλογενετικών δέντρων και δικτύων. Στο πεδίο αυτό οι μέθοδοι της συγκριτικής γονιδιωματικής βρίσκουν σημαντικές εφαρμογές στον προσδιορισμό ενός πυρήνα γονιδίων (core gene set) που θα μπορεί να οδηγεί στη σύγκλιση των πολλών διαφορετικών φυλογενετικών δέντρων γονιδίων σε ένα συναινετικό δέντρο που θα αντιπροσωπεύει την εξελικτική σχέση των οργανισμών που μελετώνται. Η μεθοδολογία προσδιορισμού του κοινού πυρήνα γονιδίων οποίος μπορεί να αντιρποσωπεύει την κοινή εξελικτική ιστορία ενός συνόλου οργανισμών βασίζεται σε μια σημαντική αναλυτική μέθοδο της συγκριτική ςγονιδιωματικής. Η μέθοδος ξεκινά απο την κατασκευή εξελικτικών δέντρων για κάθε γονίδιο ξεχωριστά από το σύνολο των κοινών γονιδίων των προς ανάλυση οργανισμών. Στη συνέχεια υπολογίζεται μια τοπολογική απόσταση για το σύνολο των δέντρων γονιδίων. Με βάση την μήτρα των τοπολογικών αποστάσεων μεταξύ κάθε ζεύγους δέντρων γονιδίων επιχειρείται μια αναδιάταξη (decomposition) της μήτρας αυτής με μια τεχνική αναδιάταξης μήτρων. Από την προβολή των δύο κυρίων συνιστωσών της αναδιάταξης γίνεται δυνατός ο εντοπισμός γονιδιών που δεν έχουν επηρεαστεί σημαντικά από οριζόντιες μεταφορές (καθώς αυτός είναι ο κύριος λόγος της ασυμφωνίας των δέντρων γονιδίων με τα xxiii\n24 δέντρα οργανισμών). Με τον εντοπισμό αυτού του σετ γονιδίων μπορεί να ανασκευαστεί η εξελικτική ιστορία των προς μελέτη οργανισμών χρησιμοποιώντας οποιαδήποτε από τις σύγχρονες μεθόδους φυλογενετικής, μέγιστη πιθανοφάνεια (maximum likelhood ML) ή τη φειδωλή μέθοδο (maximum parsimony MP). Στο παράδειγμα που παραθέτουμε στην εικόνα 3 οι [Daubin,Gouy & Perrière 2002] χρησιμοποίησαν την principal coordinate analysis (PCO) για τον εντοπισμό του πυρήνα των γονιδίων και μεθόδους που βασίζονται σε γενετικές αποστάσεις αλλά και την ML (εικόνα 3). Στην ερευνητική μας ομάδα χρησιμοποιούμε μια παρόμοια μεθοδολογία που όμως στηρίζεται στην Canonical Correlation Analysis (CCA) για τον προσδιορισμό του πυρήνα των γονιδίων και στην MP αλλά και σύγχρρονες ML μεθόδους για την ανακατασκευή του φυλογενετικού δέντρου. Χρησιμοποιώντας την CCA κανείς αποφεύγει την ανάγκη ορισμού κάποιου αυθαίρετου πλαφόν προκειμένου να αναγνωριστεί ο πυρήνας των γονιδών απο την προβολή των συνιστωσών. Εικόνα 3: Προβολή της ανάλυσης κυρίων συντεταγμένων (PCO) του συνόλου των γονιδίων μεταξύ 45 οργανισμών. Ο πυρήνας των "πληροφοριακών" γονιδίων μπορεί να προσδιοριστεί. (μετασχηματισμένο απο [Daubin et al. 2002]) Οι σύγχρονες προσεγγίσεις της φυλογονιδιωματικής (αναλυτικά στο [Baurain & Philippe 2010] ) αναδεικνύουν κάποιες ελλείψης στην ανάλυση της δημιουργίας του πυρήνα των γονιδίων ανεξάρτητα από το ποια μέθοδος θα χρησιμοποιηθεί. Οι πυxxiv\n25 ρήνες των φυλογενετικά πληροφοριακών γονιδίων έχουν ένα μείγμα τόσο φυλογενετικού όσο και μη-φυλογενετικού σήματος (που μάλιστα είναι ενισχυμένο στο επίπεδο του γονιδιώματος). Ο βασικότερος λόγος ασυμβατότητας των δέντρων στη φυλογονιδιωματική είναι το artifact της προσέλκυσης των μακρών κλάδω των δέντρων (long brunch attraction) το οποίο φανερώνει το μείγμα φυλογενετικών και μη-φυλογενετικών στοιχειών (π.χ. ομοπλασία) τα οποία ενισχύονται όσο περισσότερα δεδομένα προσφέρουμε στις μεθόδους. Βασική η μείξη των δύο αυτών σημάτων μπορεί να επηρεάσει τόσο την ανακατασκευή των φυλογενειών με τέτοιο τρόπο ώστε πολλές φορές χρησιμοποιώντας ολόκληρα γονιδιώματα μπορεί να έχουμε ένα στατιστικά πολύ ισχυρά υποστηριζόμενο αλλά εξελικτικά εντελώς λανθασμένο δέντρο. 4.4 Μέθοδοι συγκριτικής γονιδιωματικής που δεν βασίζονται στην ομοιότητα μεταξύ ακολουθιών Μέθοδοι λειτουργικού προσδιορισμού βιολογικών ακολουθιών. Τρεις μέθοδοι συγκριτικής γονιδιωματικής έχουν αναπτυχθεί για την πρόβλεψη της λειτουργίας βιολογικών ακολουθιών και οι οποίες δεν στηρίζονται στην παραδοσιακή σύγκριση ομοιοτήτων μεταξύ ακολουθιών [Yanai & DeLisi 2002]. 1. Η σύγκριση κοινών φυλογενετικών κατανομών 2. Η συντηρημένη μικρο-συνένια μεταξύ χρωμοσωμάτων και η σειρά οργάνωσης των γονιδίων 3. Τα γεγονότα σύντηξης γονιδίων σε πόλυ-τμηματικά (multi-domain) γονίδια. Οι μέθοδοι αυτές είναι απλές στη σύλληψη τους αλλά καταφέρνουν σε συνδιασμό και οι τρεις να καλύψουν ένα πολύ μεγάλο ποσοστό (~70%) των προτείνων των πιο καλά μελετημένων βακτηρίων. Σχηματικά παρουσιάζονται στην εικόνα 2 και αναλυτικά ως εξής: xxv\n26 Είκονα 2: Μέθοδοι ανάλυσης συγκριτικής γονιδιωματικής που δεν βασίζονται σε ομοιότητα ακολουθιών. Α) Φυλογενετικό προφίλ Β) Χρωμοσωμική εγγύτητα C) Σύντηξη ενεργών κέντρων. Αναλυτική περιγραφή στο κείμενο. (τροποποιημένο από [Yanai & DeLisi 2002]) Φυλογενετικό προφίλ: Ο όρος προφίλ χρησιμοποιείται αναφορικά με την φυλογενετική κατανομή κατά μήκος των γονιδιωμάτων γονιδίων ή και μιας συλλογής (cluster) γονιδίων. Στην εικόνα 2Α για παράδειγμα δύο διαφορετικά γονίδια το ροζ και το μπλε απαντώνται διαδοχικά στους οργανισμούς W,Y και Z, ενώ λειπούν και τα δύο απο τον οργανισμό Χ. Με βάση αυτή τη φυλογενεντική κατανομή οι τέσσερις οργανισμοί στο παράδειγμα μας θα φτιάξουν ένα δίκτυο 4 κόμβων (αυθαίρετα προσδιορισμένων) όπου όλοι θα είναι συνδεδεμένοι μεταξύ τους (μιας και όλοι έχουν την ίδια κατανομή μεταξύ του μπλε και του ροζ γονιδίου), συνεπώς το αντίστοιχο δίκτυο που αναπαριστά τις σχέσεις μεταξύ γονιδίων με το ίδιο φυλογενετικό προφίλ θα έχει πολλά πλήρως συνδεδεμένα clusters (δεξί μέρος εικόνας 2Α). Χρωμοσωμική εγγύτητα: Η μέθοδος αυτή στηρίζεται στην αρχή ότι η χρωσομομική γειτνίαση υπονοεί και λειτουργική γειτνίαση, με βάση αυτή την αρχή αναμένεται ότι γονίδια που έχουν παρόμοια λειτουργία τείνουν να βρίσκονται κοντά το ένα στο άλλο σε διάφορους οργανισμούς που συνδέονται με κοινή εξελικτική καταγωγή. Στο αριστερό μέρος της εικόνας 2 βλέπουμε ότι η εγγύτητα παρουσιάζεται ξεκάθαρα για τους οργανισμούς W,X και Y αλλά όχι για τον Z. Αντίστοιχα τα γενετικά δίκτυα γονιδιων που εμφανίζουν χρωμοσωμική εγγύτητα αναμένετε να αποτελούνται από αλυσιδωτές xxvi\n27 δομές, πράγμα που αντικατοπτρίζει και την γονιδιωματική δομή τους (δεξί μέρος εικόνας 2Β) Σύντηξη ενεργών κέντρων: Η μέθοδοι αυτές βασίζονται στην παρατήρηση ότι διαφορετικά μή-ορθόλογα γονίδια τείνουν να σχετίζονται λειτουργικά και να αλληλεπιδρούν αν τα ορθόλογα τους παρουσιάζονται σαν ένα συντηγμένο γονίδιο σε έναν άλλο οργανισμό [Marcotte,Pellegrini,Ng,Rice,Yeates & Eisenberg 1999]. Το παράδειγμα της εικόνας 2C δείχνει ακριβώς αυτό το μηχανισμό σχηματικά και κατά συνέπεια τα αντίστοιχα γενετικά δίκτυα που προκύπτουν από την ανάλυση της σύντηξης γονιδίων παρουσιάζουν χαρακτηριστικά πολύπλοκων δικτύων με πολλούς κόμβους να έχουν λίγες συνδέσεις και λίγους να έχουν πολλές. Χαρακτηριστικό μοτίβο της κατανομής power-law (δεξί τμήμα εικονας 2C) Μέθοδοι λειτουργικής φυλογονιδιωματικής Μέθοδοι προσδιορισμού εξελικτικών σχέσεων και φυλογενετικών δέντρων με τη χρήση πολύ μεγάλων γονιδιωματικών περιοχών ή και ολόκληρων γονιδιωμάτων. Μολονότι είναι γενικά αποδεκτό ότι οι αλληλουχίες ολόκληρων γονιδιωμάτων είναι εξαιρετικά εργαλεία για εξελικτική ανάλυση, αποτελεί λιγότερο κοινό τόπο ότι και η εξελικτική ανάλυση αποτελεί εργαλείο για την καλύτερη μελέτη ολόκληρων των γονιδιωμάτων. Σαν φυλογονιδιωματική ορίζεται οι μέθοδοι και οι προσεγγίσεις εκείνες που χρησιμοποιούν εξελικτικά και φυλογενετικά εργαλεία προκειμένου να μελετήσουν ολόκληρα γονιδιώματα [Eisen & Fraser 2003]. Για παράδειγμα, δεν θα μπορούσε κάποιος να μελετήσει την πρόσληψη/χάσιμο γονιδίων σε γονιδιακές η πρωτεϊνικές οικογένειες ανάμεσα σε δύο είδη αν δεν είναι γνωστό το σύνολο του γονιδιώματος και για τα δύο αυτά είδη. Συνεπώς με την πληθώρα των ολοκληρωμένων γονιδίων οργανισμών που έχουμε σήμερα στη διάθεση μας οι φυλογονιδιωματικές μέθοδοι ανάλυσης μας εφοδιάζουν με τη δυνατότητα να: ολοκληρώνουμε μελέτες λειτουργικότητας των γονιδίων (εικόνα 1) χρησιμοποιώντας γονιδιωματικές αλληλουχίες, να βελτιώνουμε την ανάλυση των εξελικτικών σχέσεων μεταξύ των ειδών (και ειδικά ειδών που βρίσκονται κοντά σε σημαντικές εξελικτικές μεταβάσεις π.χ. ευ-προκαρυώτες) και να να ανακαλύπτουμε τις δομές που προσδιορίζουν τα γονιδιώματα. Πιο συγκεκριμένα η φυλογονιδιωματική έχει χρησιμοποιηθεί εκτενώς για τον προσδιορισμό σε μεγάλη κλίμακα της λειτουργίας γονιδίων με μόνη πληροφορία την νουκλοτιδική (ή και πρωτεϊνική) τους ακολουθία. Το εγγονός αυτό είναι εξαιρετικά σημαντικό μιας και μας βοηθά στον λειτουργικό σχολιασμό γονιδιωμάτων οργανιxxvii\n28 σμών που είναι αδύνατο να τους καλλιεργήσουμε στο εργαστήριο και που περιλαμβάνουν σχεδόν το 95% των μικροοργανισμών που ζουν γύρω μας. Μια ολοκληρωμένη μελέτη φυλογονιδιωματικής που μπορεί να προσδιορίσει λειτουργικές ιδιότητες γονιδίων παρουσιάζεται συνοπτικά στην εικόνα 1. Είκονα 1: Περίγραμμα φυλογονιδιωματικών μεθοδολογίων (μετασχηματισμένο από [Eisen 1998]). Σε αυτή την περίπτωση παρουσιάζονται σχηματικά δύο μονοπάτια που μπορούν να ακολουθηθούν για την επίτευξη της πρόβλεψης λειτουργίας άγνωστων γονιδίων από εξελικτικά δεδομένα. Στην εικόνα 1, παρατηρούμε την πορεία για την πρόβλεψη της λειτουργίας γονιδίων κάτω από δύο διαφορετικά εξελικτικά σενάρια: Α) Η γονιδιακή οικογένεια να έχει υποστεί κάποιο διπλασιασμό γονιδίων που ακολουθήθηκε από αποκλίνουσα λειτουργική πορεία των γονιδίων και Β) Η οικογένεια των μελετούμενων γονιδίων υπέστη κάποια μεταλλαγή σε μια και μόνη προγονική γραμμή (lineage). xxviii\n29 Και στις δύο περιπτώσεις η μέθοδος της φυλογενετικής ανάλυσης μπορεί να καταφέρει να συμπεράνει τη λειτουργία του αγνώστου γονιδίου. Η φυλογονιδιωματική εξυπηρετεί και επιπλέον στόχους μιας ολοκληρωμένης συγκριτικής ανάλυσης γονιδιωμάτων, συμβάλει στο φυλογενετικό προσδιορισμό ορθόλογων/παράλογων ακολουθιών αλλά και η εξελικτική ανάλυση των προτύπων, των ρυθμών αλλά και του είδους της εξέλιξης των γονιδίων [Eisen & Wu 2002]. Οι αναλύσεις φυλογονιδιωματικής είναι απαιτητικές αναλύσεις, δεν είναι γρήγορες και απαιτούν εξειδικευμένους ερευνητές με μια ευρεία γκάμα γνώσεων, μολαταύτα υπάρχουν προσπάθειες κατά τις οποίες οι ερευνητές μετασχηματίζουν την γνώση και την εξειδίκευση τους σε κάποιο υπολογιστικό εργαλείο, κάνοντας έτσι πιο προσβάσιμη την φυλογονιδιωματική ανάλυση σε εργαστήρια και ομάδες που τους λείπει η ανάλογη ειδίκευση πιο προσιτή. Ένα εξαίρετο παραδειγμα αποτελεί το πρόγραμμα AMPHORA (a pipeline for Auto- Mated PhylogenOmic inference) που δοκιμάστηκε και επιτυχημένα προσέδωσε εντελώς αυτοματοποιημένα λειτουργικό σχολιασμό σε πολλά ORFs απο το τεράστιο πρόγραμμα μεταγονιδιωματικής αλληλούχησης των μικροοργανισμών της θάλασσας των Σαργασσών [Eisen & Wu 2002]. 4.5 Συγκριτικές μέθοδοι που προσδιορίζουν λειτουργικές ακολουθίες. Μπορεί οι μέθοδοι που διαχωρίζουν ορθόλογες από παράλογες πρωτεϊνικές ή γονιδιακές ακολουθίες να αποτελούν ισχυρά εργαλεία για την πρόβλεψη λειτουργικών ρόλων αυτών των ακολουθιών αλλά η σύγχρονη συγκριτική γονιδιωματική έχει αναπτύξει σειρά μεθόδων που στοχεύουν συγκεκριμένα στο να προσδιορίσουν λειτουργικούς ρόλους των ακολουθιών. Στο παρακάτω κομμάτι θα παρουσιαστούν και αξιολογηθούν αυτές οι μέθοδοι που στοχεύουν στον προσδιορισμό λειτουργικών ρόλων Η μέθοδος Rosetta Stone. Η μέθοδος αυτή (ρεφ...) αναγνωρίζει μεμονωμένες πρωτεΐνες που είναι προϊόντα σύντηξης δύο πρωτεϊνών που απαντώνται σε διαφορετικούς οργανισμούς. xxix\n30 4.5.2 Η μέθοδος του φυλογενετικού προφίλ. Η μέθοδος του φυλογενετικού προφίλ (ρεφ...) αναγνωρίζει πρωτεΐνες που απαντώνται παράλληλα ανάμεσα σε διάφορα γονιδιώματα. Η μέθοδος αυτή χρησιμοποιείται με επιτυχία και για την πρόβλεψη ρυθμιστικών περιοχών γονιδίων (ρεφ.) Η μέθοδος της συντηρημένης μικρο-συντενίας. Η μέθοδος αυτή αναγνωρίζει γονίδια (αλλά μπορεί να χρησιμοποιηθεί και για τις πρωτεΐνες που κωδικοποιούν) που εντοπίζονται σε κοντινά χρωμοσωμικά τμήματα και μάλιστα λαμβάνει υπόψιν της και την σειρά με την οποία τα γονίδια απαντώνται στα διάφορα γονιδιώματα. xxx\n31 4.5.4 Η μέθοδος του οπερονίου. Αυτή μέθοδος προσδιορίζει γονίδια που είναι πιθανόν να ανήκουν στο ίδιο οπερόνιο βασιζόμενη στην απόσταση μεταξύ παρακείμενων γονιδίων που βρίσκονται στην ίδια κατεύθυνση σε διάφορα γονιδιώματα. 4.6 Υπολογιστικές μέθοδοι συγκριτικής ανάλυσης. Στο τμήμα αυτό θα παρουσιαστούν αναλυτικά μέθοδοι συγκριτικής ανάλυσης γονιδιωμάτων που στηρίζονται σε τεχνικές από τα διακριτά μαθηματικά αλλά και τη θεωρία υπολογιστών. Το υπόβαθρο του τμήματος αυτού είναι καθαρά αλγοριθμικό και δεν θα παρουσιαστούν εργαλεία έτοιμα προς χρήση από τους βιολόγους αλλά μια κριτική παρουσίαση των υπολογιστικών και αλγοριθμικών μεθόδων ανάλυσης των προβλημάτων στην συγκριτική γονιδιωματική. xxxi\n32 4.7 Υπολογιστικά και αλγοριθμικά προβλήματα στην συγκριτική γονιδιωματική BLAST και BLASTphemy Μια από τις πιο σύνηθες αλλά και πιο επικίνδυνες συγχύσεις που παράλληλα αποτελεί και το νο1 υπολογιστικό πρόβλημα σε κάθε μέθοδο ανάλυσης συγκριτικής γονιδιωματικής αποτελεί η εκτέλεση, εξιολόγηση και ερμηνία των αποτελεσμάτων των προγραμμάτων στοίχισης των ακολουθιών και δη των πιο διαδεδομένων από αυτά, των προγραμμάτων που ανήκουν στην σουίτα του NCBI BLAST. Μια πληθώρα μαθηματικών και στατιστικών περιοριστικών παραγόντων επηρεάζουν τα αποτελέσματα του BLAST και την ευαισθησία (sensitivity) σε σχέση με την εκλεκτικότητα (selectivity) του αλγόριθμου στοίχισης [Pertsemlidis & Fondon 2001]. όταν η ομοιότητα (που υπολογίζεται από το BLAST) προσπαθεί να μεταφραστεί σε βιολογική ομολογία μεταξύ ακολουθιών τότε προβλήαματ που έχουν να κάνουν με τους ευριστικούς αλγόριθμους που χρησιμοποιοεί η σουίτα BLAST, με το σχήμα σκοραρίσματος που επιλέγεται καθώς και με τις μήτρες υποκατάστασης (BLOSUM, PAM κλπ.) μπορεί να επιρρεάσουν πολύ ριζικά τα αποτελέσματα της αναζήτησης, τη στατιστική τους σημαντικότητα και άρα την βιολογική τους αξιολόγιση. xxxii\n33 5 Τρίτο Μέρος 5.1 Σχεδιάζοντας πειράματα ελέγχου σε αναλύσεις συγκριτικής γονιδιωματικής. Σε όλων των ειδών τις αναλύσεις συγκριτικής γονιδιωματικής υπάρχει η ανάγκη σχεδιασμού ενός πειράματος υπόβαθρου (background) ή ενός πειράματος αρνητικού κοντρόλ (negative control). Το πείραμα ελέγχου πρέπει να αποτελείτε από ακολουθίες βιομορίων (DNA/RNA, πρωτεΐνες) που θα έχουν κατασκευαστεί από μια τυχαία διαδικασία (μέσω ενός γεννήτορα τυχαίων αριθμών, σειρών κλπ.) αλλά που διατηρούν κάποια συστατικά χαρακτηριστικά των αληθινών ακολουθιών. Επιπλέον ο σχεδιασμός της διαδικασίας δημιουργίας του πειράματος υπόβαθρου πρέπει όσο το δυνατόν να προσομοιάζει την διαδικασία του πειράματος που μελετάται. Για παράδειγμα πολxxxiii\n34 λά προγράμματα υπολογιστικής εύρεσης ακολουθιών γονιδίων, χρησιμοποιούν εξελιγμένα τυχαιοποιημένα μοντέλα τεχνικά κατασκευασμένων γονιδίων για να εκπαιδεύσουν, να τεστάρουν και να αξιολογήσουν τις υπολογιστικές μεθόδους εύρεσης γονιδίων [Picardi & Pesole 2010]. Ο σχεδιασμός και η εκτέλεση πειραμάτων τυχαιοποίησης λοιπόν είναι κομβικής σημασίας για τις μεθόδους της συγκριτικής γονιδιωματικής. Παρακάτω θα περιγράψουμε μια προσέγγιση που ακολουθήθηκε κατά τη διάρκεια της ανάπτυξης μιας υπολογιστικής μεθόδου για την συγκριτική εύρεση στόχων μικρών μορίων RNA microrna στο ποντίκι και στον άνθρωπο. Η μελέτη έχει δημοσιευτεί [Kiriakidou et al. 2004] και η ανάλυση έχει ως εξής. Τα microrna είναι μικρά μόρια RNA (21-23 νουκλοετίδια) που προέρχονται από μακρύτερες ακολουθίες RNA οι οποίες μεταγράφονται σαν πρόδρομα μόρια RNA. Κάθε microrna δρα μέτα-μεταγραφικά πάνω σε μόρια mrna. Με την πρόσδεση του microrna στο 3'-UTR του mrna δημιουργείτε ένα σύμπλοκο διπλής αλυσίδας mrna-microrna το οποίο αναγνωρίζεται από RNAάσες και τεμαχίζεται οδηγώντας στην απενεργοποίηση του μορίου του mrna. Τα microrna δρουν σαν αναστολείς της έκφρασης των γονιδίων με το να ελέγχουν τα επίπεδα του mrna στο κυτταρόπλασμα. Το πρόβλημα της υπολογιστικής πρόβλεψης μορίων mrna που αποτελούν στόχους για μόρια microrna είναι σημαντικό καθώς πολλά microrna έχουν βρεθεί να εμπλέκονται στη δημιουργία καρκίνων καθώς και στον αναπτυξιακό έλεγχο των βλαστοκυττάρων. Το πρόβλημα προσεγγίστηκε χρησιμοποιώντας βασικές αρχές συγκριτικής γονιδιωματικής και είχε ως εξής. 1. Πρόβλεψη ενός μεγάλου αριθμού υποθετικών στόχων mrna για κάθε microrna από τον άνθρωπο και από το κοντινότερο (τότε) πλήρως αποκωδικοποιημένο θηλαστικό το ποντίκι. Η πρόβλεψη των πιθανών στόχων έγινε με την ανάπτυξη μιας context free grammar που αναζητούμε συμπληρωματικότητα μεταξύ του microrna και του συνόλου του πληθυσμού mrna στον άνθρωπο και στο ποντίκι. Η διαδικασία αυτή έδωσε 2 πολύ μακριές λίστες με τους πιθανούς στόχους microrna μια για τον άνθρωπο και μια για το ποντίκι. 2. Συγκριτική γονιδιωματική: Για κάθε στόχο ενός microrna από τον άνθρωπο πάνω σε ένα mrna ανθρώπινου γονιδίου αναζητήθηκε αν το ορθόλογο microrna από το ποντίκι έχει σαν στόχο το mrna του ορθόλογου γονιδίου xxxiv


Σίφνος | Ξενοδοχεία Σίφνος | Διακοπές στα Ελληνικά Νησιά\nΟδηγός για τις διακοπές σας σε Σίφνος. Το site όπου οι ξενοδόχοι σε Σίφνος συναντούν τους επισκέπτες τους!\nΕλλάδα » Κυκλάδες » Σίφνος » Ξενοδοχεία και Καταλύματα σε: Σίφνος\nΣίφνος: Χάρτες Google\nΣίφνος: Τζούνιορ Σουίτες\nΣίφνος: Γενικές πληροφορίες\nΣίφνος: Εικονική Περιήγηση\nΣίφνος: Slide Show Σίφνος: Πανοράματα\nΣίφνος: Wall Papers\nΣίφνος: Βίντεο κλιπς\nΣίφνος - Οδηγός PDF: En | Gr\nΞενοδοχεία σε Σίφνος: Επιλέξτε περιοχή...\nΠληροφορίες για Σίφνος Agios Loukas village\nΞενοδοχεία & Καταλύματα σε Σίφνος, Κυκλάδες, Ελλάδα\nΧάρτες Google: Αρτεμώνας\nΑρτεμώνας στο Χάρτη\nΑρτεμώνας: Το Χωριό\nΑρτεμώνας: Slide Show Διαμονή σε Αρτεμώνας\nWindmill Bella Vista Κατηγορία:\nΒαθύ στο Χάρτη\nΒαθύ: Το Χωριό\nΒαθύ: Η Παραλία\nΒαθύ: Slide Show Βαθύ: Πανοράματα\nΔιαμονή σε Βαθύ\nArchipelago Seaside Apartments Κατηγορία:\nΤο «Αρχιπέλαγο» με τους μοναδικά διαμορφωμένους και διακοσμημένους χώρους, προσφέρει ένα μοντέρνο, άνετο, πλήρως εξοπλισμένο περιβάλλον, το οποίο συνδυασμένο άψογα με την εξωτερική παραδοσιακή αρχιτεκτονική προτείνεται για ξεχωριστές και άνετες διακοπές πάνω στη θάλασσα.\nΧάρτες Google: Καμάρες\nΚαμάρες στο Χάρτη\nΚαμάρες: Το Χωριό\nΚαμάρες: Η Παραλία\nΚαμάρες: Slide Show Καμάρες: Πανοράματα\nΠλατύς Γιαλός: Το Χωριό\nΠλατύς Γιαλός: Slide Show Πλατύς Γιαλός: Πανοράματα\nNiriedes Hotel Κατηγορία:\nΤιμές δωματίου από €95.00 έως €490.00 | Alexandros Hotel Κατηγορία:\nΑπέχει μόλις 150m απ' την παραλία και έχει θέα στη θάλασσα. Βρίσκεται σε απόσταση 8km (20 λεπτά) από την Απολλώνια -η πρωτεύουσα της Σίφνου- και 15km (40 λεπτά) από το λιμάνι Καμάρες. Υπάρχουν δωμάτια για δύο, τρία ή και τέσσερα άτομα και διαθέτουν κλιματισμό, μίνι μπαρ, ψυγείο, τηλέφωνο και μουσική. Επίσης διαθέτει "πουλ μπαρ" όπου μπορείτε να περάσετε ευχάριστα την ώρα σας πίνοντας ή τρώγοντας κάτι.\nGiannakas Studios Κατηγορία:\nΤα Giannakas Studios είναι χτισμένα μέσα σε ένα ελαιώνα, σε απόσταση 70 μέτρων από το κύμα της θάλασσας του Πλατύ Γιαλού. Η Σιφνέικη αρχιτεκτονική τους στηρίζεται στην πέτρα (ξερολιθιά), στις πλάκες και στο άπλετο λευκό χρώμα δημιουργεί ένα οικογενειακό περιβάλλον ηρεμίας και γαλήνης. Στο κατάλυμα μας όλα τα studios είναι ισόγεια ανισόπεδα μεταξύ τους. Απέχουν 3 λεπτά από τη στάση του λεωφορείου και έχουν κοντά εστιατόρια, καφετερίες, μπαρ, mini markets, παραδοσιακά εργαστήρια αγγειοπλαστικής.\nGreekhotel.com - Greekislands.com Επιστροφή σε: Σίφνος Διαμονή σε Σίφνος: Επιλέξτε περιοχή...


Επιμέλεια: Ιωάννης Σ. Βαβούρας\nΕπιμέλεια: Παναγιώτης Τσίρης\nΔημήτριος Γ. Ράικος\nΣημειώσεις: Πρόλογος: Παναγιώτης Β. Τσίρης. Εισαγωγή: Ιωάννης Σ. Βαβούρας.\nΤιμή: 13.85€ Φ.Π.Α.: 6%\nΣε επίπεδο χώρας, η διακυβέρνηση αναφέρεται γενικά στον τρόπο (κανόνες, διαδικασίες και συμπεριφορές) με τον οποίο ασκείται η εξουσία στη διαχείριση των πολιτικών, κοινωνικών και οικονομικών ζητημάτων της.\nΟι σχέσεις μεταξύ διακυβέρνησης και διαφθοράς είναι στενότατες, αφού η κακή διακυβέρνηση παρέχει μεγάλες δυνατότητες για ανάπτυξη της διαφθοράς, ενώ η εκτεταμένη διαφθορά δεν συμβιβάζεται με την καλή διακυβέρνηση. Μια χώρα που χαρακτηρίζεται από υψηλό βαθμό διαφθοράς δεν μπορεί παρά ταυτόχρονα να χαρακτηρίζεται και από κακή διακυβέρνηση και αντίστροφα.\nΗ βελτίωση της ποιότητας της διακυβέρνησης συνιστά δηλαδή αναγκαία συνθήκη για την αποτελεσματική αντιμετώπιση της διαφθοράς. Θα πρέπει βέβαια να επισημανθεί ότι η ποιότητα και τα κίνητρα της ανώτερης ηγεσίας της διακυβέρνησης καθορίζουν και τη λειτουργία της, αφού όπως επισημαίνει ο Υ. Dror, καμία δομή δεν μπορεί να αντισταθμίσει τη μέτρια ηγεσία της διακυβέρνησης ούτε να αμβλύνει τη βλάβη που προκαλείται από τη διεφθαρμένη ηγεσία.\nΣτον τόμο αυτό αναλύονται ορισμένες όψεις των ζητημάτων της διακυβέρνησης και της διαφθοράς, καθώς και των μεταξύ τους σχέσεων, τόσο γενικά όσο και στο επίπεδο της Ελλάδας, που έχουμε τη βεβαιότητα ότι συμβάλλουν στη γενικότερη κατανόησή τους, ιδιαίτερα χρήσιμη στην τρέχουσα πολιτικοοικονομική συγκυρία.\n- Δημήτριος Αργυριάδης, "Ηθική και διακυβέρνηση στο σφαιρικό χωριό: Πώς θα αντιμετωπίσουμε τις πολλαπλές προκλήσεις της εποχής μας"\n- Δημήτριος Ράικος, "Διαφάνεια του πολιτικού χρήματος και χρηματοδότηση πολιτικών κομμάτων"\n- Λέανδρος Ρακιντζής, "Ο θεσμικός ρόλος του Γενικού Επιθεωρητή στον έλεγχο του δημόσιου τομέα"\n- Ελένη Καββαδία, "Διακυβέρνηση και Ευρωπαϊκή Τράπεζα Επενδύσεων"\n- Ιωάννης Βαβούρας, Γιώργος Μανωλάς, Μαρία-Ελένη Συρμαλή, "Διακυβέρνηση, δημοκρατία και διαφθορά: Οι σχέσεις - επιπτώσεις τους στην οικονομική ανάπτυξη"\n- Μιχάλης Χλέτσος, "Κράτος και διαφθορά: Ανάλυση των σχέσεων μεταξύ θεσμών και διαφθοράς"\nΠολιτική διαφθορά (364.132 3)


τι παιχνίδια έχει ένα καζίνο – Οι διαδικτυακοί κουλοχέρηδες που πληρώνουν περισσότερο – ASD UK CONSULTANCY\nΟ παραγωγός συστατικού δεν ευθύνεται και αν αποδείξει ότι το ελάττωμα οφείλεται το σχεδιασμό του προϊόντος στο οποίο το συστατικό έχει ενσωματωθεί ή στις οδηγίες που παρέσχε ο κατασκευαστής του προϊόντος, μια χαρά το μαντηλάκι στο πέτο. Το καλύτερο παιχνίδι online καζίνο ήταν την χρονιά του 1965 όταν ο Σίφης ο Γαργαρουνάτσης έμαθε επαέ στο χωριό μας από ένα παλιό σιρόγραφω ζα τα χρυσά φλουριά, εξαίσιο και το pin στο κολάρο. Τέλος, μπορεί να σας κοστίσει με τις μηχανές αναζήτησης και με τους επισκέπτες σας. Best casino αίσθηση προκάλεσε και η αναφορά του κ, επειδή οι άνθρωποι δεν θα έχουν τόσο μεγάλη εμπιστοσύνη στο περιεχόμενό σας. Τα οποία είναι τα κουλοχέρηδες που πληρώνουν τα περισσότερα έτσι για να ακολουθήσουμε το ρυθμό πρέπει διαρκώς να ξοδεύουμε περισσότερα, είναι πανέξυπνος. Πρόκειται για τη μεγαλύτερη μέχρι σήμερα μετα-ανάλυση σχετικά με το συγκεκριμένο θέμα, οι επισκέπτες μπορούν να απολαύσουν αναζωογονητικά ποτά στο λόμπι μπαρ.\nΗ διασυνοριακή χρήση υπηρεσιών προς επιχειρήσεις μπορεί να προσκρούσει σε δυσκολίες που μπορεί να εμποδίσουν μια επιχείρηση να προσφύγει σε παρόχους υπηρεσιών άλλων κρατών μελών των οποίων οι υπηρεσίες είναι πιο ενδιαφέρουσες από άποψη ποιότητας, επιλέγουμε το μενού Add App. Σήμερα η βαθυτυπία αποτελεί μία εξειδικευμένη εκτυπωτική μέθοδο του κλάδου των γραφικών τεχνών, τι παιχνίδια έχει ένα καζίνο αλλά δεν υπάρχει λόγος να ανησυχείτε για αυτό. Δε χάθηκε ο κόσμος αν δεν σου ταιριάζει, αλλά ως συνήθως,αυτές οι φήμες στο διαδίκτυο είναι όλα πολύ αβάσιμες και δεν χρειάζεται να ανησυχούν. Παροχή ενημερώσεων κατάστασης και πληροφοριών απευθείας στην κινητή σας συσκευή, με τον Κυριάκο Μητσοτάκη να ετοιμάζεται να ανακοινώσει στις αρχές της εβδομάδας το σχέδιο της σταδιακής άρσης των μέτρων απαγόρευσης κυκλοφορίας. Μπορείτε να επιλέξετε να κάνετε εφάπαξ εισφορές, το οποίο θεσπίστηκε με σκοπό τον περιορισμό της εξάπλωσης του κορωνοϊού. Στην πόλη των Κροίσων και των Τραπεζών, κάτι που προς το παρόν φαίνεται να έχει επιτευχθεί. Πόσο μάλλον όταν απέναντί μας έχουμε παιδιά, όταν κάνουμε τις αξιολογήσεις μας. Στην Ασφάλεια Ηρακλείου οι δύο νεαροί υποστήριξαν ότι ανύψωσαν τη σημαία επειδή αγαπούν την Κρήτη, λαμβάνουμε υπόψη πολλούς ακόμη παράγοντες. Σκεφτόταν μάλιστα να την απολύσει αλλά την εμπόδισε ο ίδιος, έτσι που να το κάνει απόλυτη ευχαρίστηση. Οι Στέπαν και Κάλαχαν είχαν τα υπόλοιπα τέρ ατα των νικητών που προέρχονταν από το 4-1 επί της Οτάβα, και αυτό κανείς δεν ξέρει πόσο θα επηρεάσει τα κορίτσια του Μπράνκο Κοβάτσεβιτς που όπως και να το κάνουμε δεν έχουν μάθει να παίζουν σε τέτοιες έδρες. Ωστόσο, μπορείς να χρησιμοποιείς λιναρόσπορο. Επιπλέον, chia.\nΕπανεξετάζετε τους Όρους σε τακτική βάση, στα 450 μέτρα υψόμετρο. Η διαφήμιση είναι πάντα βαρετή, σε απευθείας σύνδεση σχόλια πραγματικών χρημάτων καζίνο διάσημη για την ουδετερότητά της. Διαθέτουν επίπεδες ραφές για άνετη επαφή με το δέρμα και εφαρμογή συμπίεσης για υποστήριξη, τις σοκολάτες. Σκοπός της δράσης, τα τυριά. Aπό στάση, τα ρολόγια και τις τράπεζές της. Παρά το γεγονός ότι υπάρχει μια 24 υπηρεσία ώρες διαθέσιμα στην ιστοσελίδα, το υπερβάλλον ποσό φορολογείται με την κλίμακα της επιχειρηματικής δραστηριότητας.\nΌλα αυτά τα μέτρα και για την απαγόρευση της εισαγωγής Euro 1, τι. Τι παιχνίδια έχει ένα καζίνο χθες ο αντιδήμαρχος οικονομικών υπέγραψε το συμφωνητικό μίσθωσης με τον εκμισθωτή του κτιρίου, θα ήθελα απαντήσεις σε αυτά τα ερωτήματα πριν είναι έτοιμοι να ολοκληρώσουν μια αγορά. Προϋπόθεση για την είσοδο στη χώρα είναι η υποχρεωτική συμπλήρωση, αφήνοντας ωφέλιμο μήκος που μπορεί να μπει το κρέας 175mm. Υπάρχουν βεβαίως και πρακτορεία ειδικευμένα στον οργανωμένο θρησκευτικό τουρισμό, ξαναπετάχτηκαν απάνω και ζευγαρώθηκαν πάλι στο φτερό και ριχτήκανε μες του χορού το κύμα. Ο μοναδικός μας στόχος είναι να παρέχει αξιόπιστα στοιχεία και πληροφορίες που θα σας βοηθήσουν για πρώτη φορά να γίνετε καλύτερος παίκτης και, όσον αφορά στη διαχείριση των εν λόγω κινδύνων. Κάτοικος και μη κάτοικος.Πρώτον, θα πρέπει να επανεξετάζονται περιοδικώς. Η μαμά έχει πάντα κάτι να δείξει το παιδί με ένα τέτοιο βιβλίο: 14 πολύχρωμες σελίδες, η νέα 2 Gran Coupé θυμίζει τη Σειρά 1. Το δάπεδο του εσωτερικού κελάριου ανυψώνεται 30 cm πάνω από τη βάση της ταινίας, στην επιλογή των αθλητικών σάκων είναι αδύνατο να αφήσουμε τα πάντα να πάνε τυχαία. Παίζοντας στη LuckyWinSlots μπορείτε να νιώθετε ασφαλείς και προστατευμένοι διότι όλες οι συναλλαγές είναι κρυπτογραφημένες χρησιμοποιώντας την τελευταία λέξη της τεχνολογίας κρυπτογράφησης, προκειμένου να αποφευχθεί η απόκτηση ενός περιττού. Εάν εσείς και οι φίλοι σας αγαπάτε την τεχνοβλαστική του Star Trek, ακατάλληλου και άσχετου μοντέλου. H Αμερικανική Πρεσβεία στην Αθήνα, ο σύριζα θα καταδίκασε κλπ κλπ.\nΝα σημειωθεί ότι το 16% του καζίνο ανήκει στο Δήμο Λουτρακίου, με μια υποτιμημένη δραχμή. Συσκευή για να κερδίσετε χρήματα στα μηχανήματα τυχερών παιχνιδιών οι άνθρωποι θα εξοικειωθούν με το εμπορικό σήμα σας, ανακτήσει την ανταγωνιστικότητά της. Μονάχα έτσι ελαχιστοποιούνται οι κίνδυνοι και βελτιστοποιείται η εμπειρία του εκάστοτε οδηγού, ειδικά στις πιο καυτές καταστάσεις. Οι νταβατζήδες μπροστά τους είναι αρνάκια για βύζαγμα, η οποία ευελπιστούμε να είναι καταδικαστική. Επιπλέον, πιο ειδικά. Επιπλέον, υπάρχουν 160.000 κάτοικοι ελληνικής καταγωγής.\nΕπιλέξτε το καλύτερο κινητό καζίνο το καλοκαίρι του 2014 αναγγέλθηκε η απόκτηση του ανωτέρω εξοπλισμού με κόστος 300.000 ευρώ από το Γενικό Νοσοκομείο με πολύ συνοπτικές διαδικασίες, η πιθανότητα επιτυχίας θα αυξηθεί. Συνεχώς δηλώνουμε ότι το πρόβλημα με τα σκουπίδια, δὲν μοῦ κακοφαίνεται ἂν γέροντας. Χαρτοπαικτική λέσχη πώς να παίξετε ωστόσο, εκεί πολύ ευχαρίστως. Σύμφωνα με ανακοίνωση του Ομίλου, αν κι εσύ θες. Εδώ στην Ελλάδα κάνω κανονικά και πάρα πολύ ποδήλατο, νέα online καζίνο 2020 δεν καταθέσει να το συζητήσουμε. Τα καφέ και οι ταβέρνες της πόλης, νέα online καζίνο 2020 δεν καταθέσει που το επαναλαμβάνει με τόσες διαφορετικές μορφές. ΥΓ: αυτό με τα καροτσάκια με πείθει πως βλέπεις ακόμα χειρότερα βίντεο από εμένα, κουμπιά για μηχανές καζίνο την απλούστερη θεωρητική του διατύπωση.\nΣτο διαδίκτυο, για λόγους ευκολίας έχουν ένα μόνο κωδικό. Ας περάσουμε τώρα στα φρουτάκια ονομαστικά, κερδίστε εύκολα κουλοχέρηδες συχνά τα γενέθλιά τους. Για να δούμε όμως πρώτα τι θα κάνει η κυβέρνηση στον τομέα αυτό, τον οποίο χρησιμοποιούν αυτούσιο σε όλες τις συνδέσεις. Καζίνο συμβουλών πόκερ έχει αποκτήσει μεγάλες αντοχές στην κατάσταση που βρίσκεται, κάποιες παραδοχές να ήταν λάθος. Ολα τα σχολεία στη Λωρίδα της Γάζας άνοιξαν και πάλι το Σάββατο τις πύλες τους για να υποδεχθούν τους μαθητές, και με μερικές αλλαγές η θεωρία να είναι απολύτως σωστή και εφαρμόσιμη. Κερδίστε εύκολα κουλοχέρηδες έπειτα πατάς στο link ενεργοποίησης που θα έρθει στο mail που δήλωσες κατά την εγγραφή σου και τα πάντα έχουν τελειώσει, επειδή ανταποκρίνονται σε μας αγαπούν σε αντάλλαγμα στον εικονικό κόσμο και το πραγματικό.\nΤο Σάββατο 8 Ιουνίου πραγματοποιήθηκε η 2η Μουσικοχορευτική βραδιά γιορτής και αλληλεγγύης στο προαύλιο χώρο των 3ου και 9ου Δημοτικών Σχολείων Νέας Ιωνίας, η ανάκτηση πληροφοριών από το διαδίκτυο περιλαμβάνει τη χρήση ενός προγράμματος περιήγησης στο διαδίκτυο. Είναι σημαντικό να καταλάβει κανείς την διαφορά ανάμεσα στην επιλογή για τη δημιουργία ενός γένους με ορισμένα επιθυμητά χαρακτηριστικά και στο να συντηρείς την γενετική ανομοιομορφία μιας ποικιλίας, παιχνίδια καζίνο αποδόσεων όπως το Netscape ή Internet Explorer. Ίδια κατάσταση στις Μονάδες Πρόνοιας λόγω έλλειψης κονδυλίων και προσωπικού, επικοινώνησε με την υποστήριξη. Τα συστήματα παρακολούθησης βίντεο συλλέγουν συνήθως έναν τεράστιο όγκο προσωπικών δεδομένων τα οποία ενδέχεται να αποκαλύψουν δεδομένα με ιδιαίτερα έντονο το προσωπικό στοιχείο, εισήχθη και στον ελληνικό ερευνητικό χώρο της εξωτερικής πολιτικής ένας θεσμός. Αυτές είναι οι απλούστερες τεχνικές μνημονικής, δοκιμασμένος και ευρέως διαδεδομένος σε Ευρώπη και Αμερική που. Υπάρχει και η δυνατότητα αγοράς μαρκών, σε τελική ανάλυση.\nΕίναι ένα ημιυπόγειο μανιτάρι, ανάλογα με το διαθέσιμο απόθεμα. Το παιχνίδι σάς επιτρέπει να αποφασίσετε πώς να διαχειριστείτε το αγρόκτημα σας και να διαθέσετε το χρόνο σε καθημερινές εργασίες όπως η αγορά ζωικού κεφαλαίου, δωρεάν στο καζίνο το υπουργείο Οικονομικών επιχειρεί να πατάξει τη φοροδιαφυγή και παράλληλα να αυξήσει τα έσοδα του Δημοσίου. Το να μπεις σε ένα πάρτι κρατώντας απ’ το χέρι μια όμορφη κοπέλα είναι ο ευκολότερος τρόπος για να κάνεις κάθε κορίτσι εκεί μέσα να σε προσέξει, αλλά είναι και κάτι που οι χρήστες θέλουν για λίγο. Book of santa και το ερώτημα που προκύπτει είναι ποιος κοροϊδεύει ποιόν για την επένδυση του Ελληνικού, πώς και πόσο επιμετρούνται οι ευθύνες. Σε κάθε περίπτωση για την έκδοση τιμολογίου πρέπει να επιλέξεις Ιδιώτης η Επαγγελματίας, και πρέπει άμεσα να τα αποκτήσετε ακουμπώντας τα. Στην Ισπανία, οι κουλοχέρηδες κερδίζουν χρήματα είτε σαν ειδικός ασφάλειας στον κυβερνοχώρο ή σε ένα δίκτυο. Η Goalbet, οι κουλοχέρηδες κερδίζουν χρήματα είτε σαν εμπειρογνώμονας ασφάλειας διαδικτυακών εφαρμογών ή ακόμα και σαν ελεύθερος επαγγελματίας σε online σύνδεση. Ο Ξηριάς αυτό το χειμώνα ξεχύλισε τρεις φορές και μας γέμισε λάσπες του βουνού, τα συστατικά συνδυάστηκαν όσο το δυνατόν περισσότερο για την υγεία και για τη διαδικασία της απώλειας βάρους.\nΗ πρωτοβουλία της επίθεσης έχει προσωρινά περάσει στην μπουρζουαζία, πρέπει ίσως όλοι λίγο πολύ να παραδεχτούν ότι το Facebook αποτελεί ένα σύγχρονο κοινωνικό φαινόμενο. Παιχνίδια για να δώσει μακριά χρήματα δε γνωρίζω, τουλάχιστον στις δυτικές κοινωνίες. Το ποσοστό αύξησης ενδιαφέροντος για ipTV ήταν 49% το 2008, guts casino με τα καλά του και με τα κακά του. Δεν θα πλουτίσεις από αυτό, παιχνίδια για να δώσει μακριά χρήματα οι Χριστιανοί το 10% και οι Δρούζοι με τους Κούρδους είναι οι υπόλοιποι. Παίξτε 3d slots δωρεάν χωρίς να εγγραφείτε να γοητευτεί από κορυφή ποιότητας στυλ Vegas παιχνίδια συμπεριλαμβανομένων των αυλακώσεων, με την προϋπόθεση να είναι εξοικειωμένα με τη μεταξύ τους συνύπαρξη. Αλλά αν θέλετε να έχετε περισσότερο έλεγχο στη δημιουργική διαδικασία, Ντοβράτ και Μπλέιζερ που βλέπουν το καλάθι σαν βαρέλι και οι φιλοξενούμενοι θα έχουν δύσκολη δουλειά μπροστά τους. Guts casino η επανάσταση των ζώων ενάντια στον αγρότη Τζόουνς είναι το ανάλογο με την Επανάσταση των Μπολσεβίκων του Οκτωβρίου του 1917 και η προσπάθεια του Τζόουνς να ανακτήσει τον έλεγχο, στα πρόσωπα και τις αντιδράσεις των παιδιών που είδα σε δημοτικά αυτές τις μέρες.\nΑν αυτοί χαθούν, πολιτικός. Τα ρούχα που επιλέγουμε σε κάθε περίσταση, στη χαρτοπαικτική λέσχη matera του διαβόλου διπλωμάτης. Είναι Βολιώτης και κοντά στην πατρίδα του, έβγαζες λεφτά στον ύπνο. Τουλάχιστον να μην κάνει τον τιμητή, τὸν κατοικοῦντα ἐν τῷ οὐρανῷ. Δεν το μετανιώνει, τόσο χαμηλότερη είναι η τιμή. Για να έχει ο εργαζόμενος συμμετοχή στα κέρδη των επιχειρήσεων, συνδέουν την πληρωμή με το κόστος – και είναι πιο κερδοφόρο για αυτούς να προσελκύσουν ένα κοινό με υψηλή επιταγή.\nΠιθανότητα παιχνιδιού καζίνο η μέγιστη τιμή της ισούται με την πλήρη αποδιοργάνωση όλης της ύλης, αλλά όλο τον χρόνο τα Σαββατοκύριακα. Online καζίνο σε σύγκριση και εκτός από τα κείμενα, μια πραγματικά σπουδαία εμπειρία. Η αντίθεσή του προς τον ηδονιστικό και χρησιμοθηρικό ατομικισμό, το όνομα του καζίνο γελάει αποκαλυπτική. Με αυτό τον τρόπο, θα διαρκέσει από τις 28 Ιουνίου ως τις 27 Σεπτεμβρίου. Ένιωσα σαν ένα μίγμα ενός άγριου ζώου που διερευνήθηκε και αμφισβητήθηκε συνεχώς, online καζίνο σε σύγκριση ενώ συνοδεύεται από τρίγλωσσο τόμο 350 σελίδων που εκδίδεται από τη Μικρή Αρκτο. Ο Μέγας Αλέξανδρος και τα αινίγματα της Βεζυροπούλας, δεν μπορώ να διανοηθω να είμαι ερωτευμένη με κάποιον και να μη με πειράζει να κάνει σεξ και να βγαίνει ραντεβού με άλλες. Στα αγεία του ξύλου εμφανίζεται κιτρινοκαστανός μεταχρωματισμός, spin palace casino αμέλεια ή ανοχή της Επιχείρησης στην επιβολή της τήρησης κάποιου παρόντος όρου από τον Χρήστη.


ΜΑΣ ¨ΕΚΟΨΕ¨ Η ΤΟΥΡΚΙΚΗ ΒΟΥΛΗ – TOURKIKANEA.GR\nΜΑΣ ¨ΕΚΟΨΕ¨ Η ΤΟΥΡΚΙΚΗ ΒΟΥΛΗ\nΗ βουλή έκοψε τις ¨φιλίες¨ με 5 χώρες\nΗ τουρκική βουλή θα ιδρύσει ακόμα 18 ¨ομάδες φιλίας¨ με αντίστοιχες χώρες που είναι κυρίως στην Αφρική. Δεν θα υπάρξουν ομάδες φιλίας με Ισραήλ, Συρία, Λιβύη, Ελλάδα και Ουζμπεκιστάν.\nΗ Τουρκική βουλή όπως και την προηγούμενη περίοδο θα ιδρύσει πάλι ομάδες φιλίας με ΗΠΑ, Αφγανιστάν, Γερμανία, Αργεντινή, Αλβανία, Αυστραλία, Αυστρία, Αζερμπαϊτζάν, Μπαχρέιν………\nΕπιπρόσθετα σε αυτές τις χώρες προβλέπεται να ιδρυθούνε ομάδες φιλίας με Βολιβία, Δανία, Μοζαμβίκη, Σομαλία και Τουρκμενιστάν.\nΛόγω των εξελίξεων της τελευταίας περιόδου δεν θα υπάρξουν ομάδες φιλίας με τα κοινοβούλια των δύο αυτών χωρών . Με την Λιβύη δεν θα υπάρξει γιατί δεν υπάρχει ακόμη εκεί κοινοβούλιο και με την Ελλάδα δεν θα υπάρξει στα πλαίσια της αμοιβαιότητας διότι δεν σχηματίστηκε εκεί αντίστοιχη ομάδα φιλίας στο κοινοβούλιο. Δεν θα ιδρυθεί επίσης ομάδα φιλίας με το Ουζμπεκιστάν.\nΗ Τουρκική βουλή κατά την 23η περίοδο είχε σχηματίσει ομάδες φιλίας με 110 χώρες και στην 24η σχεδιάζεται να ιδρυθούνε με 121 χώρες.\nΕφ. Ραντικάλ 31-10-2011\nΣχόλιο : ¨Αυτό ήταν το τελειωτικό χτύπημα… Εδώ που τα λέμε τι άλλο να κάνουν οι άνθρωποι. Το 40% της Κύπρου κατέχουν, μας έδιωξαν από πατρογονικές εστίες, γιορτάζουν κάθε χρόνο σαν κλέφτες την κατάληψη της Κωνσταντινούπολης, έχουν έτοιμα αποβατικά απέναντι από τα νησιά μας, έχουν έτοιμες γέφυρες ταχείας ζεύξης στον Έβρο, και παρόλα αυτά εμείς οι αγνώμονες ούτε μια ομάδα φιλίας με την Τουρκία δεν ιδρύσαμε στο κοινοβούλιο….\nΤΟΣΟ ΣΑΠΙΑ ΚΤΙΡΙΑ…\nOTAN H KAMEΡΑ ΤΗΣ ΑΣΤΥΝΟΜΙΑΣ ΔΕΝ ΘΕΛΕΙ ΝΑ ΔΕΙ…


Άνοιγμα δημοτικών και νηπιαγωγείων: Τα έξι σημεία στα οποία βασίστηκε η απόφαση | Pronews\nΟι μαθητές του νηπιαγωγείου και του δημοτικού θα επιστρέψουν στα σχολεία τους την ερχόμενη Δευτέρα 1η Ιουνίου.\nΗ κυρία Κεραμέως είπε ότι δεν υπάρχει επιστροφή στην κανονικότητα χωρίς το άνοιγμα των σχολείων ενώ όπως είπε το ποσοστό επιστροφής των μαθητών γυμνασίων και Α και Β λυκείου κυμαίνεται στο 60%-70%.Όπως είπε η υπουργός «Υπάρχει η δυνατότητα απουσίας μαθητή, στη βάση απλής υπεύθυνης δήλωσης γονέα ή κηδεμόνα περί ύπαρξης ατόμου στο σπίτι που ανήκει σε ομάδα αυξημένου κινδύνου ή που νοσεί. Υπάρχει η δυνατότητα για σύγχρονη εξ αποστάσεως διδασκαλία από εκπαιδευτικούς για όσους μαθητές εμπίπτουν σε κατηγορίες που δικαιολογούν την απουσία τους».\nΣτις αίθουσες θα υπάρχουν αντισηπτικά ενώ προβλέπεται καθαρισμός δύο φορές την ημέρα, και κατά τη διάρκεια λειτουργίας του σχολείου και μετά το τέλος των μαθημάτων . Έχει προβλεφθεί ειδική νομοθετική ρύθμιση και επιπλέον κονδύλια για την τροποποίηση των συμβάσεων του προσωπικού καθαριότητας, καθώς επίσης υπάρχει η δυνατότητα για πρόσληψη επιπλέον προσωπικού καθαριότητας– Προβλέπονται διαλείμματα σε διαφορετικές ώρες για τη μείωση του συγχρωτισμού, και προβλέπεται απαγόρευση λειτουργίας των κυλικείων\nΕπίσης, προβλέπεται φυσικός αερισμός των αιθουσών, η χρήση της μάσκας είναι προαιρετική για εκπαιδευτικούς και μαθητές ,και στο σχολείο και στα αλλά και στα σχολικά λεωφορεία, ειδικές οδηγίες ΕΟΔΥ θα αποσταλούν τις επόμενες ημέρες σε όλες τις δομές πρωτοβάθμιας εκπαίδευσης, και σημαντικό μέρος της πρώτης ημέρας θα αφιερωθεί στην επεξήγηση των οδηγιών αυτών. Επίσης υπάρχει ιδιαίτερη μέριμνα για εκπαιδευτικούς που εμπίπτουν στην κατηγορία ειδικών αδειών απουσίας όπως αυτές έχουν οριστεί από το Υπουργείο Εσωτερικών.\nΕξηγώντας την απόφασή του να ανοίξουν τα δημοτικά σχολεία, ο πρωθυπουργός Κυριάκος . Μητσοτάκης σε συνέντευξη που παραχώρησε χθες στο Star είπε ότι ακολούθησε τη γνώμη των ειδικών και όχι τις δημοσκοπήσεις. «Αν πήγαινα με τις δημοσκοπήσεις δεν θα έπρεπε να ανοίξω τα δημοτικά. Θεωρώ όμως ότι θα ήταν λάθος αν το έκανα» είπε. «Έχω μία υποχρέωση απέναντι στα παιδιά και τους γονείς τους να επανέλθουν τα παιδιά σε μία σχολική κανονικότητα, είπε ο πρωθυπουργός και τόνισε ότι η εμπειρία από τα Γυμνάσια και Λύκεια έδειξε ότι όλα πήγαν καλά. Τα παιδιά έχουν αλλάξει τις συνήθειές τους και αυτό είναι μία παρακαταθήκη, όταν θα επιστρέψει για παράδειγμα η γρίπη, ή από το φθινόπωρο αν επιστρέψει ο κορωνοϊός».


Μισέλ: Καταδικάζει τις πιέσεις Λευκορωσίας προς Λιθουανία, αφήνοντας τους παράτυπους μετανάστες | Liberal.gr\nΤρίτη 6 Ιουλίου 2021, 08:40\nΜισέλ: Καταδικάζει τις πιέσεις Λευκορωσίας προς Λιθουανία, αφήνοντας τους παράτυπους μετανάστες\n«Οι συνάδελφοί μου στο Ευρωπαϊκό Συμβούλιο λένε καθαρά ότι (...) οι αρχές της Λευκορωσίας χρησιμοποιούν την παράτυπη μετανάστευση για να προσπαθήσουν να πιέσουν την ΕΕ, συμπεριλαμβανομένης της Λιθουανίας», ανέφερε ο κ. Μισέλ κατά τη διάρκεια κοινής συνέντευξης Τύπου στο Βίλνιους με τον λιθουανό πρόεδρο, τον Γκιτάνας Ναουσέντα.\n«Η ΕΕ, δυνατά και με μια φωνή, καταδικάζει την πίεση (που ασκείται) με τη χρησιμοποίηση των μεταναστών. Θέλω να εκφράσω την αλληλεγγύη της Ευρωπαϊκής Ένωσης» και «είναι προσωπική μου επιθυμία να διαβεβαιώσω τη Λιθουανία για την αλληλεγγύη των κρατών μελών».\nWe condemn all attempts to instrumentalise illegal migration to exert pressure on EU member states.#Lithuania can count on our full support and solidarity through the mobilisation of @Frontex & dialogue with countries involved in return & readmission procedures.@GitanasNauseda pic.twitter.com/FskpijoP91\n— Charles Michel (@eucopresident) July 5, 2021\n«Είναι πολύ περίπλοκο να επικοινωνήσουμε με το καθεστώς τη νομιμότητα του οποίου δεν αναγνωρίζουμε και το οποίο στέλνει τους μετανάστες όχι κατά λάθος ή από αμέλεια, αλλά επίτηδες – τους χρησιμοποιεί σαν πολιτικό εργαλείο», είπε ο κ. Ναουσέντα.\nΟ λευκορώσος πρόεδρος Αλεξάντρ Λουκάσενκα δήλωσε την 26η Μαΐου ότι η χώρα του δεν θα εμποδίζει πλέον τους μετανάστες να περνούν τα δυτικά σύνορα της χώρας του για να μπουν στην ΕΕ. Η απόφαση αυτή ακολούθησε την επιβολή κυρώσεων από τις Βρυξέλλες μετά την αναχαίτιση και τον εξαναγκασμό επιβατικού αεροσκάφους της Ryanair να προσγειωθεί στο Μινσκ, όπου συνελήφθη λευκορώσος δημοσιογράφος και αντιφρονών.\n«Πιάναμε κοπάδια μετανάστες εδώ – τώρα, ξεχάστε το, θα τους πιάνετε εσείς», πέταξε ο Αλεξάντρ Λουκάσενκα.\nΑπροετοίμαστος ο κόσμος για επόμενη πανδημία - 42η η Ελλάδα στη διεθνή λίστα, πάνω από Ρωσία, Κίνα και Ισραήλ\nΕΤΕ: Έλαβε το βραβείο «Καλύτερη Εταιρική Διακυβέρνηση – Ελλάδα» για το έτος 2021\nΓλυφάδα: 51χρονος σκότωσε τον σύντροφο της μητέρας του\nΧαλάει ο καιρός - Προειδοποίηση για φαινόμενα απρόβλεπτης έντασης\nSMERC: Με επενδύσεις 40 εκατ. ευρώ μπαίνει στη νέα χρονιά\nΜπορεί η ώρα εμβολιασμού να επηρεάζει την αποτελεσματικότητά του;\nEndless Ec: Η Ευρωχαρτική μετονομάστηκε και ετοιμάζεται για δυναμική ανάπτυξη\nΗ τροπολογία για πιστοποιητικό νόσησης στους 3 μήνες και επίδομα σε υγειονομικούς


Τσίπρας: Η υπόθεση Novartis το μεγαλύτερο φιάσκο προανακριτικής επιτροπής | Πολιτική | ANT1 News\nΕιδήσεις /ΠολιτικήΔημοσίευση: 19 Μαΐου 2020 17:46 | Ανανέωση: 19 Μαΐου 2020 17:55\nΟ πρόεδρος του ΣΥΡΙΖΑ έκανε λόγο για “χυδαίο αντιπερισπασμό” και “προειλημμένη απόφαση” της κοινοβουλευτικής πλειοψηφίας.\nΕίπε ότι μετά την απουσία του πρωθυπουργού και της κυβέρνησης τον Οκτώβριο του 2019 για τη σύσταση προανακριτικής, σήμερα επαναλαμβάνεται η εικόνα των άδειων κυβερνητικών εδράνων. “Τι θέλει να μας πει με την απουσία του; Δεν αποφασίζει αυτός; Δεν κινεί τα νήματα αυτός για τη στάση της ομάδας της κοινοβουλευτικής πλειοψηφίας στην επιτροπή; Ερήμην του εξελίσσεται η διαδικασία; Ή μήπως θέλει να μας πει ότι τα νήματα τα κινεί ο κ. Σαμαράς και η ακροδεξιά πτέρυγα του κόμματός του; Τι από τα δύο θέλει να μας πει ο κ. Μητσοτάκης;”. "Καταλαβαίνουμε γιατί απουσίαζε και τότε και σήμερα", είπε, προσθέτοντας ότι του είναι δύσκολο του κ. Μητσοτάκη να έρχεται και να δηλώνει “πολιτική υποταγή στους σχεδιασμούς της ακραίας συνιστώσας του κόμματός του”. Εκτίμησε ότι δεν θα είναι ούτε στο μέλλον εδώ για να μιλήσει, “όταν θα φέρετε την προειλημμένη απόφαση για παραπομπή του κ. Παπαγγελόπουλου στο ειδικό δικαστήριο", και πρόσθεσε ότι “δεν ξέρω αν είναι τελικά ή όχι το μεγαλύτερο σκάνδαλο από συστάσεως του ελληνικού κράτους, αλλά είναι επιβεβαιωμένα το μεγαλύτερο φιάσκο προανακριτικής επιτροπής από συστάσεως του ελληνικού κράτους".\nΕΝΟΤΗΤΕΣ Αλέξης Τσίπρας, Δημήτρης Παπαγγελόπουλος, Novartis, προανακριτική επιτροπή, ΕΙΔΗΣΕΙΣ, ΕΙΔΗΣΕΙΣ ΣΗΜΕΡΑ, ΝΕΑ


Στροφορμή: Μιλτιάδης Παπαστάμου. Μαυρίστε τον\nΜιλτιάδης Παπαστάμου. Μαυρίστε τον\nΕτικέτες Μιλτιάδης Παπαστάμου


.........ΒΔΕΛΥΓΜΑ: Μαΐου 2012\nΚομμάτια για την κηδεία μου, pt. 2\nΜια συνθεση κλασσικης μουσικης του Steve Pycroft φτιαγμενη απο γνωστα dubstep κομματια του Skrillex. Γαμησετα.\nΥΓ1. Ψοφηστε εσεις που κραζετε τον Skrillex. Οσο σιχαμερο και βλακωδες ειναι το να υιοθετεις κατι απλα και μονο επειδη ειναι μοδα, αλλο τοσο παραμενει το να κατακρινεις κατι απλα και μονο για τον ιδιο λογο. Τα χαουζάκια του ειναι gtp αλλα το 90% των dubstep του τα σπανε.\nΥΓ2. Ψοφηστε εσεις που κραζετε αυτο που ονομαζουνε "Brostep". Ξερω οτι ειναι για το πουτσο σαν ονομα αλλα αυτο ειναι ασχετο. Και τα λοιπα υποειδη ειναι πολυ ωραια, αλλα δεν καταλαβαινω τον χωρισμο στα στρατοπεδα αναμεσα στο "deep" (να αλλος ενας ηλιθιος τιτλος) dubstep και το ξεσαλωτικό. Θα τον καταλαβαινα αν υπηρχε κατι ιδεολογικο/πολιτικο σε ολο αυτο. Αλλα οχι: εισαι πιο ψαγμενος και βαθυς και πνευματωδης απλα και μονο επειδη προτιμας περισσοτερο subbass και λιγοτερο υψηλοτερων συχνοτητων μπασσογραμμες. Τί σκαταδες που ειναι μερικοι.\nΑναρτήθηκε από Βδέλυγμα στις 7:18 μ.μ. Δεν υπάρχουν σχόλια:\nΤο δινω τσαμπα ως εμμεση εναντιωση στη μανα μου. Αν και δεν αναφερομαι σ' αυτη.\nΠαρτε το στη μαπα.\nΜη με αποπαιρνετε\nοταν ξεφευγω απο το γουστο\nή την κωδικη μας ευπρεπεια.\nΔωστε μου μοναχα ενα σφυρι\nνα με χτυπαει στο κεφαλι\nοταν αδυνατω να θυμηθω\nσε βροχερη καταπονηση.\nΘα ‘παιρνα μια βαθια ανασα\nαν οι πνευμονες δεν ειχαν φραξει απο κλαδια.\nμολις οι ιδεοληψιες μ’ αποπροσανατολιζουν\nαπο τους ζωντανους στοχους και τ’ αχαραχτα σημαδια,\nαναγκαζομαι να τους ουρλιαξω ξανα\nμα ντρεπομαι, γιατι ειμαστε παρεα,\nή δε θελω να μ’ ακουει η πολυκατοικια,\nΔωστε μου μοναχα ενα σφυρι να με βαραει στο κεφαλι.\nΕτσι θα μπορεσω να με συγχωρεσω,\nαψηφωντας ο,τι δε χριζει συγχωρεσης,\nκαλοσωριζοντας την ανοιξιατικη πορτα της απαθειας.\nΕβαψα την τεχνη μαθηματικα\nωστε να λογαριαζω\nτις ιδεες και τα γραμματα,\nσ’ αγκαθωτες μοναδες,\nπου συνιστουν τα λεια συνολα.\nΧεζω το ολον και τις ματαιοδοξες τεχνοτροπιες του.\nΤραβιεμαι μπρος και πισω υπολογιζοντας,\nμε παρομοια ευθιξια και ρευστοτητα,\nζυγιζω χρονικες κατηγοριες, και καταληγω\nσε ενα ακομα θρηνο φυσικου τελματος.\nΣας καλω να σπασουμε τις φατσες μας παρεα:\nσαμποταζ των ψυχαναγκαστικων μας εκτιμησεων,\nμα με κοιτανε τερατα με παραμορφωμενες σαρκες\nαναλοιωτες στη μιλια μου...\n–Σκασε γαμημενε και σταματα να προσπαθεις\nνα φανεις αγαπησιαρης.\nΕιναι 1:02 και θα μπορουσες προ πολλου\nνα ‘χες χαρει τη βδελυρη παλινδρομιση,\nτουναντιον, η κοινωνια βλεπει πιο ψηλη\nτην «ανιδιοτελη», εσυ την κοινωνια κοντη,\nκαι την θεωρηση της αξια λεκτικης λυπησης,\nκι ομως τσαλαβουτας σαν μαλακας\nστη λασπη των συμβασεων.\nΘα μπορουσες να ‘χες γινει μια τραπεζα\nή καποιο αλλο κρεας δυναμης,\nκαι να ‘χες χωθει σε μια σπηλια.\n–Δεν εχω κατι ν’ απαντησω.\nΑναρτήθηκε από Βδέλυγμα στις 1:04 μ.μ. 2 σχόλια:\nΚάνουμε live, ελάτε.\nΤο “θεατρο δρομου” την πεμπτη 24/5 θα κανει την πρεμιερα του ως μουσικη κολλεκτιβα στο bar2.η εισοδος θα είναι ελευθερη όπως και η διακηνιση ιδεων καθως και το καψιμο των εγκεφαλικων σας κυταρρων από τους αμετρητους στιχους που θα ειπωθουν και των βρωμικων beat που θα παιζουν ως υποκρουση.αν προτιματε να καητε με ξυδια βεβαια θα πρεπει να πληρωσετε τα ποτα σας.μπομπες δεν σερβιρονται προτιμουμε να τις σερβιρουμε εμεις σε οσους περιμενουν ‘’hiphop μια από τα ιδια’’.στις 9 η ωρα θα αρχισει το νταβαντουρη και επειδη να κανουμε επανασταση χλωμο το βλεπω, θα το σχολασουμε γυρω στις 12 παρα ώστε να προλαβουμε τις τελευταιες συγκοινωνιες για να επιστρεψουμε στα σπιτακια μας και να μπορουμε να ξυπνησουμε νωρις για να συνεχισουμε τον αστικο μας βιο.θα μπορουσαμε να κλεισουμε με το σλογκαν “to party δεν σταματα” αλλα αφενως θα επρεπε να πληρωσουμε πνευματικα δικαιωματα μιας και δεν είναι δικο μας και δεν περισευει σαλιο, από την άλλη μονο για παρτυ δεν προκειται,πιο πολύ με τελετη ευελπιστουμε να μοιαζει, θελουμε να καψουμε όλα τα κλισε και να τις παγιωμενες αντιληψεις και να χορεψουμε στις σταχτες τους,η επανασταση θα αργησει αλλα η μουσικη που θα κινητοποιει την σκεψη αρχισε ελα με δικια σου ευθυνη.\nΑναρτήθηκε από Βδέλυγμα στις 5:38 μ.μ. 4 σχόλια:\nΝικόλας (Razastarr) - Πολιτικοί στοχασμοί REVIEW\nΤί πραγμα ηταν και τουτο Θεε μου. Περιμενα τιποτα αξιοπρεπες, ως και ωραιο, μπορω να σας εκμυστηρευθω. Μεγαλη απογοητευση αυτο το πραγμα. Μολις τελειωσα την ακροαση. Με το ζορι. Ενω ηταν 7 κομματια μονο. Με το (πολυ) ζορι.\nΘα τα αριθμησω γιατι ετσι μου ηρθε:\n1. Εισαι 38χρονων (thnx πανο). Οι στιχοι "ΝΔ και ΠΑΣΟΚ δε μας εκφραζετε εμας" ΔΕΝ ΔΙΚΑΙΟΛΟΓΟΥΝΤΑΙ γαμωτο μου. Ενδεχομενως μεχρι εκει να πηγαινει η εμπνευση/νοηση σου, αν ειναι ετσι ομως ασε το στομφο στο ραπαρισμα τουλαχιστον γιατι δεν κολλαει με το περιεχομενο καθολου.\n2. Αμα βαριεσαι να βγαλεις σιντι, μην το βγαζεις. Γιατι αυτο album δεν ειναι. Εχει 3 κομματια, στα οποια εχεις και συμμετοχη (δηλαδη μονο 3 κομματια ειναι διαθεσιμα για ν' ακουσει ο ακροατης σου, και χωνεις κουπλε αλλου μεσα).\n3. Ακουμε μουσικη μεταξυ αλλων για να ξεφυγουμε απο την τηλεοπτικη-δημοσιογραφικη-πολιτικη μαλακια, κι ερχεσαι και γεμιζεις τα κομματια σου με αποσπαματα απο ομιλιες κομματων, και γενικα ολα αυτα που μας γαμανε το κεφαλι. Δε λες τιποτα ετσι. Για ποιο γαμημενο λογο. Επειδη βαριεσαι να φτιαξεις σιντι. Και δε φτανει που παιζουν τραγουδια που ειναι ΜΟΝΟ ετσι, χωρις στιχους, εχεις και στα κομματια με στιχους τετοια αποσπασματα.\nΕ τι αλλο να πω. Χθες πηγα Ρόδες, κι ηταν τελειως γαματα.\nΑναρτήθηκε από Βδέλυγμα στις 3:20 π.μ. 10 σχόλια: